摘要

耐甲氧西林和易感金黃色葡萄球菌(分別為MRSA和MSSA)作為人類病原體仍然是一個公共衛生問題。研究了MRSA和MSSA在河流和城市汙水中的存在情況金黃色葡萄球菌確定各生態位上spa型和MLST的遺傳多樣性和優勢基因型。城市汙水中MRSA比例高於河流汙水(P<0.05)。基於spa類型的Simpson多樣性指數顯示，MSSA分離株的多樣性高於MRSA分離株(P<0.05)。在MSSA河流分離物中檢測到的主要spa類型和STs與在城市汙水中發現的不同。在MRSA人群中，ST125-t067是城市汙水(67.6%)和河水(82.4%)中檢測到的主要基因型。總的來說，在河流和城市汙水中最常見的MSSA和MRSA係是與人類相關的克隆(ST125-t067, ST5-t002;ST22-t032, ST30-t012和ST15-t084)。這些結果顯示了水在金黃色葡萄球菌維持和傳播中的潛在作用。來自河流的分離物與人類分離物的聯係可能反映了人類活動在生態係統中的影響，這突出了評估病原體在環境中通過水的循環的必要性。

關鍵字

金黃色葡萄球菌;城市廢水;河水;Spa打字;MLST

簡介

耐甲氧西林和易感甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA和MSSA)作為人類病原體[1]仍然是一個公共衛生問題。不同的遺傳譜係被描述為醫院相關性mrsa (HA-MRSA)、社區相關性mrsa (CA-MRSA)和牲畜相關性mrsa (LA-MRSA)。由hammrsa分離株引起的感染通常與住院、手術或住院醫療器械等危險因素有關[2]。CA-MRSA對健康人群的影響和感染與潘通-瓦倫丁白細胞素或PVL[2]毒素的存在有關。最後，LA-MRSA被認為是一種職業風險，盡管在MRSA[3]流行率較低的國家，其分離頻率正在增加。由於HA-MRSA在社區中的發病率，這些群體之間的遺傳分化變得更加複雜反之亦然由於MRSA在人和動物之間的傳播[4]。直接接觸被認為是最可行的傳播途徑金黃色葡萄球菌[3]。然而，定植的個體可能將細菌排放到城市汙水和休閑水中[5,6]。汙水處理廠被描述為MRSA的蓄水池，假設，參與他們的傳播通過汙水處理廠的廢水，作為一部分金黃色葡萄球菌人口可能在廢水處理中存活[6-9]。此外，河水[10]中MRSA的存在指出了水在MRSA傳播中的潛在作用，並因此傳播到相關環境中[8,9,11]。這些事實促使我們研究城市汙水和河水中MSSA和MRSA的存在，以評估每個生態位內的遺傳多樣性和優勢基因型。

實驗部分

樣品來源

2011年7月在一個汙水處理廠采集了一份城市汙水樣本，該汙水處理廠從一個320萬人口的城市中心的幾個城市收集器(未經處理的廢水)收集廢水(http://www.ine)。es / SID Informe.do)。2012年9月，在一個有8392人的城市(http://www.ine.es/SID/Informe.do)的下遊農村采集了一份河水樣本。

隔離和表征

將兩個樣本分成子樣本分別處理(每個樣本n=100個子樣本)。每個亞樣品(1 mL)分別培養於9 mL Muller-Hinton肉湯(6.5% NaCl, Oxoid)中，37℃孵育16-20 h。然後將1 mL轉移至9 mL色氨酸大豆肉湯(Oxoid)中，加入頭孢西丁(3.5 mg/L, Sigma-Aldrich)和氮曲南(75 mg/L, Sigma-Aldrich)， 37℃孵育16-20 h。最後，將25µL標記於Brilliance MRSA板(Oxoid)上，37℃[10]孵育24-48 h。牛仔藍菌落(每個亞樣本一個)被證實為MRSA (台麵式晶體管或作為國內陽性)PCR[12]。同時，將100µL培養的Muller-Hinton肉液(6.5% NaCl)與兔血漿纖維蛋白原(bioMerieux)培養在Baird Parker (BP)瓊脂上，37℃培養24-48 h。選擇凝固酶陽性的黑色菌落(每個亞樣本一個)作為潛在菌落金黃色葡萄球菌並被證實為MRSA (台麵式晶體管或作為國內陽性)或MSSA (mecA和mecC陰性)，如上所述。通過對A[12]蛋白可變片段進行spa分型測序，確定金黃色葡萄球菌的特征，並使用最小生成樹算法(bionnumerics 6.0)分析spa類型。利用Simpson多樣性指數(SID)和Jackknife偽值(CI: 95%)估算了不同品種的遺傳多樣性金黃色葡萄球菌基於spa類型的分離(圖2;http://darwin.phyloviz.net/ComparingPartitions/ index . php ?鏈接=工具)。根據[13]之前描述的協議，對每個spa類型和隔離路徑(n=103)至少一個分離物進行多位點序列分型(MLST)，以獲得序列類型(STs)。[12]檢測潘通-瓦倫丁白細胞素(PVL)。

統計分析

計算Fisher精確檢驗(SPSS 20)，以分析樣本類型(城市汙水或河水)與MRSA存在之間的關係，以及樣本類型與收集中最常見的spa類型和STs之間的關係(n>5株分離株)。

結果與討論

MRSA協議在城市汙水的100個亞樣本中檢測到96株MRSA菌株，而在河水中僅檢測到33/100株MRSA(表1)mecA-MRSA。在Baird - Parker方案中，大部分金黃色葡萄球菌分離株為MSSA(表1)，但也檢測到一些MRSA(5株)mecA-MRSA和1個分離物mec城市汙水中的C-MRSAmec河水中的A-MRSA)。的低檢出率mecC-MRSA相比mecA-MRSA與其他研究一致[13-16]。然而，檢測mec考慮到人畜共患傳播[17]和野生動物-環境相互作用的可能性，廢水中的C-MRSA值得關注mecC-positive MRSA[10]。

圖1:基於最小生成樹算法的spa類型聚類。圓圈之間的線/數代表不同溫泉類型之間的遺傳距離。(*):在河水中檢出的溫泉種類;(^):在城市汙水中檢測到的溫泉類型和():共享溫泉類型

表1:河流和城市汙水中金黃色葡萄球菌的溫泉類型和序列類型[STs]
MRSA:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;MSSA:甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌;^一個PVL積極隔離;^b作為隔離[13];加粗字體:本研究描述的溫泉類型和化糞池

圖2:基於spa類型的金黃色葡萄球菌分離株遺傳多樣性:辛普森多樣性指數(Simpson’s ID)和疊刀偽值置信區間(CI)為95%MRSA:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;MSSA:甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌

河水中僅有1株MSSA對PVL陽性(ST737- spa型t4801)。一些研究描述了PVL在歐洲南部和西班牙的一些地區正在增加，但主要指的是ST8和ST80[18,19]，在我們的研究(表1)中分離頻率低(ST8)或未檢測到(ST80)的STs。

在城市汙水中檢測到的MRSA菌株比例較高(102/169;60.4%)高於河水(34/115;29.6%)，差異有統計學意義(P<0.05)。與河水相比，城市汙水中MRSA的分離頻率更高，這可能與廢水中耐藥菌濃度更高以及采樣區域的種群密度有關[20,21]。

分離株被分組在81種不同的溫泉類型(圖1)和42種STs中，其中12種溫泉類型和14種STs是兩種環境的共同類型(表1)。本研究首次描述了10種新的溫泉類型和7種新的STs(表1)。從河流水和城市汙水中檢測到42種不同的溫泉類型的MSSA分離株。在MRSA分離株上，數量不同水療中心從河水和城市汙水中檢測到的細菌種類分別為7種和13種(表1)。在MSSA和MRSA分離株細菌種群中觀察到的遺傳多樣性將反映金黃色葡萄球菌兩個水樣的種群。

MSSA比MRSA菌株在基因上更加多樣化(圖2;P < 0.05)。基於的辛普森多樣性指數(SID)水療中心來自河流的MSSA分離株為0.958 (95% CI: 0.934-0.981)，來自城市汙水的MSSA分離株為0.944 (95% CI: 0.910-0.978)(圖2;P > 0.05)。在MSSA分離株中觀察到的這種遺傳多樣性與之前的研究[1]中觀察到的相似。盡管有很高的遺傳多樣性，一些MSSA基因型更頻繁地被分離。因此，在河水中檢測到的MSSA基因型最多的是ST5/水療中心t002類型(13/81;16.0%), ST30 /水療中心類型t012 (6/81;7.4%), ST25 /水療中心類型t078 (6/81;7.4%)和ST15 /水療中心類型t084 (5/81;6.2%),而ST30 /水療中心類型t012 (13/67;19.4%), ST15 /水療中心類型t084 (7/67;10.4%)和ST30 /水療中心類型t021 (5/67;7.5%)是城市汙水中最常見的MSSA基因型。這些常見的MSSA基因型在人類健康攜帶者和患者中已經被發現[1,22,23]。

對來自河水和城市汙水的MRSA分離株，SID值分別為0.326 (95% CI: 0.102-0.550)和0.530 (95% CI: 0.412- 0.648) (P>0.05)。這種低遺傳多樣性是由於主要基因型的存在，包括大多數MRSA分離株。特別是ST125/基因型水療中心從河水和城市汙水中分離出的MRSA菌株中，t067型占82.4%(28/34)，67.6%(69/102)，順序依次(表1)水療中心代表與醫院感染相關的主要MRSA基因型[1,24]。其他MRSA基因型如ST22-t032和ST5-t002(表1)也與人類感染有關[4,22,24]。LA-MRSA在河流和城市汙水中被發現，盡管典型的基因型如ST398/水療中心t011或其單位點變異ST1094在我們的研究中僅零星發現(表1)。這些結果可能是由於采樣區域靠近城市核的動物影響有限。

我們的數據表明，在城市汙水和河水中檢測到的主要MRSA和MSSA遺傳譜係是人類相關基因型。這可能與被定植的個體不斷向環境中釋放金黃色葡萄球菌的潛力有關[5,6,20]，同時也與金黃色葡萄球菌在水環境中持續存在[6,10,25]。

結論

我們的數據強調了人類活動在氣候變化中的潛在作用金黃色葡萄球菌在水中傳播，並強調有必要評估這種病原體在環境中的循環和持久性及其對公共衛生的可能影響。

致謝

這項工作得到了馬德裏自治社區(S0505 / AGR-0265;S2009 / AGR-1489)和歐盟FP7基金ANTIGONE(項目#278976)。

巴爾韋德大學由西班牙經濟和競爭力部的博士後獎學金“Juan de la Cierva”資助。

作者謹此感謝Ursula博士Höfle在現場采樣方麵的幫助，以及J. A. Carriço(裏斯本大學醫學院分子微生物研究所分子微生物學與感染部)博士幫助我們使用旨在計算辛普森多樣性指數(Simpson’s ID)和置信區間的Web工具，以及技術人員María García, Estefania Rivero和Carolina Castilla (VISAVET)提供的出色技術支持。

沒有收到用於支付以開放獲取方式出版的費用的資金。

的利益衝突

作者聲明沒有利益衝突。發起人在研究的設計中沒有任何作用;在數據的收集、分析或解釋中;寫稿子的時候，以及決定發表結果的時候。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Porrero MC, Valverde A, Mateos A, Cantón R, Gortázar C，等(2016)城市汙水和河水中發現的金黃色葡萄球菌遺傳譜係。國際J水廢水處理2(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-5299.117

版權:©2016,Porrero MC，等人。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2015年10月06

接受日期:2016年1月25日

發表日期:2016年2月01