摘要

通過聚合酶鏈式反應變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析和DNA測序，比較了在處理城市汙水的各種汙水處理係統中繁盛的細菌群落。本研究比較了來自台式、中試和全尺寸膜生物反應器(mbr)、常規活性汙泥(CAS)和滴式固體接觸過濾(TF/SC)係統的微生物群落結構。DGGE指紋圖譜采用GelCompar II聚類分析進行群落相似性分析。在所有站點中，處理相同廢水的台架和中試規模mbr具有最高的相似性(73%)。從處理類似廢水的全尺寸MBR中提取的樣品與試驗台和中試規模MBR的相似度較低，但仍相當高(44%)。與TF/SC係統相比，CAS係統中細菌種群的相似性(64%)更大。MBR組與CAS + TF/ SC組相似度均處於極低水平(小於5%)，說明MBR組的優勢種與其他活性汙泥處理形式存在很大差異。通過DNA測序成功識別了73%被切除的DGGE條帶，發現了四種細菌，它們存在於不止一個生物廢水處理係統中:未培養的副球菌克隆3-3、未培養的細菌克隆SB3-6、未培養的梭狀芽孢杆菌sp.和未培養的克雷伯氏菌sp.結果表明，由於不同的操作條件和內部水動力機製，在台架和中試規模mbr中發現的微生物群落結構可能不是研究全尺寸mbr性能的好模型。

關鍵字

廢水處理;微生物群落;PCR-DGGE;DNA測序

簡介

膜生物反應器(mbr)近年來越來越受歡迎，因為它們能夠保持高混合液體懸浮固體(MLSS)濃度，更長的固體停留時間(SRT)，改善處理性能，還提供了高度的操作靈活性[1,2]。mbr能夠產生類似於小足跡[3]中通過二次澄清和出水微過濾相結合獲得的出水質量。然而，mbr麵臨著獨特的挑戰，限製了它們的廣泛應用，特別是由於膜生物汙染[4]導致的工廠維護和運行成本。控製生物汙染的一種方法可能包括物理、化學或生物手段，用於控製已知的導致汙染的特定細菌種類。為了做到這一點，需要對這種細菌進行識別，然後對其棲息地特征進行廣泛研究，以確定控製策略。同樣重要的是，要確定細菌群落在將試驗台或中試規模的係統擴大到全尺寸係統的過程中是否受到影響，以便在更小的規模上開發/測試的控製策略也適用於全尺寸係統。同樣重要的是，找出mbr中的生物是否與其他類型的生物處理過程(如傳統活性汙泥(CAS)和滴灌過濾係統)中的生物不同。許多關於mbr中生物過程的已知或假設主要來自對CAS係統的研究，而不考慮兩種處理過程在操作/環境條件上存在顯著差異的事實。少數研究者如Le-Clech等[4]，Li等[5]，Wu和Huang[6]等報道了MLSS特性對膜汙染的影響。微生物群落結構與膜生物汙染之間的聯係也有報道[7-9]。 A shift in microbial community composition occurs with changed operating conditions and shift can lead to loss of ecosystem functions (nitrification, denitrification and biological phosphorus removal) [10].

在一項研究中，Wan et al.[11]使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析了群落結構，並報道了中試規模的mbr中的細菌群落與CAS過程中的不同。Miura et al.[12]使用聚合酶鏈反應(PCR)-DGGE和熒光原位雜交(FISH)技術分析了細菌群落結構，報道了進水廢水組成對細菌群落結構有很大影響。Stamper等人還揭示了細菌群落結構對進水廢物特性的響應。[13]。

直到最近，Wan等人才對城市汙水處理的全規模MBR係統進行了分子微生物多樣性調查。結果表明，mbr反應器中的細菌群落與平行運行的CAS生物反應器中的細菌群落始終不同，反映了兩種處理係統中截然不同的環境和操作條件。然而，並沒有太多的研究對並行運行台架、中試規模mbr和全規模滴濾器/固體接觸(TF/SC)處理城市廢水中的細菌種類(存在度和豐度)進行比較。許多研究者[14,15]報道DGGE剖麵中相同位置的條帶可能來自不同的細菌來源，不同的條帶也可能來自相同的細菌來源[16,17]。DGGE條帶顯示了細菌群落結構隨時間的變化。盡管有這些限製，DGGE已經被公認為一種快速的細菌群落分析方法。本文利用PCR-DGGE技術對mbr與CAS、TF/SC工藝處理城市汙水中生長的微生物群落結構進行了比較。

材料與方法

抽樣

在6個月的時間裏，從4個不同的汙水處理廠(wwtp)每半年收集大約1升混合液樣品(曝氣池汙水汙泥)。樣品收集在高壓滅菌的塑料瓶中，收集後立即保存在冰中，運到實驗室，並在分析前保持冷藏。所有樣本都在夏威夷大學水資源研究中心實驗室進行了分析。這四個汙水處理廠(Honouliuli、Wahiawa、東檀香山和Schofield Barracks)接收不同質量的廢物流，因為鹽度和社區規模/特征(包括住宅、工業和商業規模)不同。Honouliuli汙水處理廠是夏威夷州第二大汙水處理廠，位於瓦胡島西部。該汙水處理廠每天接收平均流量為2600萬加侖(MGD)的中等鹽度(總溶解固體(TDS) 795毫克/升)的廢水，主要是住宅性質的廢水，並使用TF/SC進行生物處理。試驗台和中試規模的mbr位於Honouliuli汙水處理廠，與TF/SC接收的廢水並行運行。研究中包括的其他汙水處理廠包括:容量為4.5 MGD的東檀香山汙水處理廠，使用CAS處理高鹽度(TDS 4400 mg/l)的生活廢水;容量為2.5 MGD的Wahiawa汙水處理廠，使用CAS處理低鹽度(TDS 218 mg/l)的生活質量廢水;容量為4.2 MGD的Schofield Barracks汙水處理廠，使用中空纖維型MBR處理低鹽度(TDS ~254 mg/l)的混合生活/工業廢水。

DNA提取和PCR擴增

使用快速DNA旋轉試劑盒(MP Biomedicals, Solon, OH, USA)從混合液中直接純化總基因組DNA，然後用PCR擴增成片段。以16S rRNA v3區為模板，采用Lane[18]報道的正向引物338f(5 ' - act - cct - acg - gga - agag -3 ')和Muyzer等[14]和Øvreås等[19]建議的反向引物518r (5 ' -ATT-ACCGCG-GCT-GCT-GG-3 ')作為PCR擴增的通用引物。50µl PCR混合物包含:每種引物2.5µl, 10mm PCR核苷酸Mix 1µl, 5 ×無色Go Taq flexxi反應緩衝液10µl, 25mm MgCl 5µl₂溶液中，5 u/ l Go Taq DNA聚合酶0.25µl, BSA 2µl，無核酸酶水26µl，提取DNA 0.75µl。PCR擴增在iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)中進行。16S rRNA基因擴增在94°C孵育5 min後發生初始變性;35個變性(94°C 45秒)、退火(55°C 45秒)和延伸(72°C 45秒)循環，最後在72°C延伸10分鍾。PCR擴增的DNA樣本在1.5%瓊脂糖中與2個PCR產物(如[14]所示)用水平電泳檢測。

DGGE和DNA測序分析

PCR擴增後，將DNA樣品裝入體積比為8%的聚丙烯酰胺凝膠(37.5:1，丙烯酰胺/雙丙烯酰胺)，1 × TAE緩衝液(20 mM Tris, 10 mM醋酸酯，0.5 mM EDTA, pH = 7.4)中。凝膠在Bio-Rad D Code係統(BioRad, Hercules, CA)中在130V、60°C下運行210分鍾。然後，凝膠在溴化乙錠(1.0 mg/l)中染色10分鍾，在1 × TAE緩衝液中衝洗10分鍾，用紫外反式照明儀(Bio-Rad gel Doc 2000, Bio-Rad, Hercules, CA)觀察。然後手動從凝膠中切除特定的DGGE條帶進行DNA測序。測序方法在Huang等人[20]中描述。我們使用了幾種方法來改善所獲得的低DNA測序結果(最初識別不到67%)。有報道稱甜菜堿通過減少富含gc區域[21]引起的二級結構的形成來改善基因的擴增。測序前在DNA樣品中加入5 M甜菜堿可使結果提高4%。將退火溫度從50°C提高到60°C，將延伸溫度從60°C提高到80°C，結果沒有序列結果。然而，根據引物P518r (GC含量為64.7%)(Tm = 4℃x(引物中G和C的數量)+ 2℃x(引物中A和T的數量)，測序過程中溫度從50℃增加到58℃，延伸溫度從60℃增加到70℃)，序列結果增加了3%。同時使用5 M甜菜堿，並在測序過程中將退火溫度提高到58°C和延伸溫度提高到70°C，結果提高了6%。 Although sequencing conditions improved, 27% of DNA sequencing results remained unidentifiable.

聚類和測序分析

DGGE研究結束後，從每個汙水處理係統中選取4個具有代表性的樣本進行對比分析。使用GelCompar II聚類分析比較來自不同wwtp的細菌群落之間的結構和相似性(Applied Maths, Austin, TX, USA)。全局相似度是通過合並字符或使用皮爾遜相關非加權對組(UPGMA)平均實驗相關相似度來計算的。值得注意的是，DGGE被認為最適合於在一個多樣化的細菌群落中識別主要的種群，而不是次要的，但可能非常重要的種群。從DGGE凝膠中分離出單個DGGE條帶，然後進行DNA測序，並使用NCBI在線基因庫數據庫進行評估，以確定單個細菌種類。

結果與討論

在群落多樣性分析中，假設每個波段對應一個獨特的物種，波段密度對應物種豐度。在細菌群落多樣性研究中，每個條帶被認為來自一個細菌來源。此外，每個DGGE剖麵模式可以顯示一個或多個不同的樣本特定優勢種。在不同操作條件下觀察到的樣品特定優勢種的差異被認為是由於微生物群落所處的操作/環境環境不同導致不同的生理生長條件造成的。

台式規模，中試規模和全尺寸mbr

下麵的圖1 (1a:左側部分和1b:右側部分)分別展示了實驗規模、中試規模和全尺寸MBR樣品與東檀香山CAS、Wahiawa CAS和Honouliuli TF/SC過程之間的DGGE分析對比。

如圖1所示，MBR中細菌群落的DGGE指紋包含10個重複出現的條帶;其中5種是永久性細菌(亮帶代表一種優勢微生物物種，並在6個月的研究期間持續存在)。在這5個物種中，條帶B2被鑒定為未培養的細菌克隆Pia-s-66，在條帶亮度方麵表現出相對較大的優勢(表1)。10個物種中有9個通過測序鑒定，包括未培養的副球菌克隆3-3(條帶B7)。在Honouliuli的全尺度Schofield MBR和TF/SC工藝樣品中也發現了未培養副球菌克隆3-3。來自同一製造商和處理同一廢物流的實驗規模和中試規模mbr的結果顯著不同，9個主要物種中有6個被識別出來。隻有P2帶被鑒定為未培養EubacteriumcloneF10.18 16S在整個跟蹤過程中表現出穩定性，在試驗係統中僅代表一個永久細菌種。

圖1:PCR擴增16S rRNA片段的DGGE指紋圖譜，提取自台架、試點和全量程(Schofield) mbr混合液樣品;以及來自東檀香山CAS、Wahiawa CAS和Honouliuli TF/SC。

在反應堆的初始設置中，黃杆菌屬sp. AKB-2008-JO36 (P3頻帶)的豐度最大(頻帶質量最亮)，但隨著時間的推移，隨著係統的再適應，頻帶質量逐漸下降。在6個月的跟蹤中，在Schofield的全尺度MBR(來自試驗台和中試的不同廢物流)和Honouliuli的TF/SC(與試驗台和中試MBR相同的廢物流)中的細菌群落的PCR-DGGE帶帶模式都非常恒定。斯科菲爾德MBR的DGGE指紋有16個條帶，其中13個經測序確定。Honouliuli的TF/SC植物在所有樣品中也有16個條帶，所有16個都被識別出來(圖1a，底部)。隨著時間的推移，CAS植物的穩定性有所下降，而高鹽度的東檀香山植物的細菌形成穩定性下降。在Honouliuli (TF/SC)汙水處理廠的樣品中發現的四種細菌也在其他處理廠的樣品中發現(表1)。

mbr的16S rRNA指紋以有限數量的條帶為主，而CAS指紋顯示出複雜的條帶模式，因此表明細菌群落的多樣性。在東檀香山CAS樣本中，有15個可檢測波段，其中10個通過測序成功識別(圖1b)。類似地，在Wahiawa CAS樣本中有14個可檢測條帶，但其中隻有7個被確定為最接近的係統發育關係。所有樣品之間具有很高的相似性，說明生物係統應激源是相對恒定的。從不同的條帶形態和條帶的亮度可以看出，每個生物反應器的細菌群落多樣性和優勢菌種不同。

斯科菲爾德兵營全尺寸MBR樣品比實驗和試驗樣品有更多的條帶。此外，實驗級和中試級MBR係統在帶的出現上具有更大的連續性。聚類分析(圖2)顯示，基準級MBR和中試級MBR有72%的相似度，在所有測試的樣本站點中相似度最高。然而，研究結果表明，中等規模mbr的優勢種群數量與中試規模mbr的優勢種群數量不同。這些係統使用相同的汙泥，使用相同的膜(相同的製造商、孔徑和結構)，並以相同的SRT並排處理相同的廢水流。然而，台架尺度單元的物理尺寸不同，導致不同的流體動力學(更大的水力停留時間，不同的循環率，和不同的曝氣/混合製度)，表明這些參數在選擇微生物種群中所起的作用。Schofield全尺寸MBR樣本與實驗尺度和中試尺度MBR樣本的相似度較低(44%)。部分原因可能是斯科菲爾德全尺寸MBR(低鹽度，混合住宅/工業)和台架和中試規模MBR(中等鹽度，住宅)處理的不同廢物流，以及與小規模反應堆相比，不相同的反應堆內部配置和操作。DGGE分析了來自東檀香山CAS、Wahiawa CAS和Honouliuli TF/SC的pcr擴增16S rRNA片段，發現樣本之間存在顯著差異(圖2)。

表1:測序結果顯示Genbank的登錄號，最接近的係統發育關係和%序列相似性

聚類分析顯示，東檀香山CAS和Wahiawa CAS具有64%的相似性，而Honouliuli TF/SC樣本與CAS設施樣本的相似性較低(43%)。從圖2也可以看出，CAS和TF/SC組與MBR組的相似度處於顯著低水平(小於5%)。盡管在Honouliuli的實驗規模、中試規模和TF/SC都處理了相同的廢水流，但在優勢微生物群落中存在重大差異。這兩種環境的差異可能是由於膜對生物質的完全排斥和mbr中應用的截然不同的操作條件(例如汙泥齡、F/M比)。顯然，mbr選擇的優勢菌群不同於CAS和TF/SC係統。

一般來說，操作和環境條件都應該影響細菌群落的組成以及哪些生物占主導地位。在夏威夷，無論是在時間上還是在特殊的基礎上，廢水溫度基本上沒有變化，所以它不被認為是一個選擇壓力。城市汙水的組成複雜，隨著時間的推移變化很大，因此微生物群落必須多樣化，適應環境條件，以確保一致的處理結果。MBR係統具有較長的srt(大約30天，而CAS和TF/SC為10-15天)和較高的MLSS(大約10,000 mg/L, CAS為2000 mg/L, TF/SC為3500)，這導致了較低的F/M，從而導致生物量的內源衰減和更頑固的DOM的形成，其中較大的部分被膜保留在曝氣池中。可溶性微生物產物(SMP)和細胞外聚合物質(EPS)的形成和保留也可能有利於不同生物的生長，它們在MBR食物網中清除這些產物。如Wan等人[11]所述，較短的水力停留時間，較大的剪切力(使用粗泡曝氣時較大的曝氣速率)，以及通過膜滯留所有生物質，會導致不同的選擇壓力。所有這些都表明mbr係統中生物量的生理狀態與CAS係統不同。TF/SC混合液隻暴露在TF生物塔產生的殘留有機物中，因此它也在低F/M條件下運行(可能比mbr更低)，然而，環境條件與CAS比mbr更相似。

進水廢水的特性可以解釋微生物多樣性的變化，這肯定在CAS係統與Wahiawa CAS(低鹽度)和East Honolulu CAS(高鹽度)之間觀察到的差異中起了一定作用，因為這兩個係統處理的是有機和營養成分相似的住宅型城市廢水。Honouliuli TF/SC的廢水被認為是中等鹽度的，主要是居住城市廢水。然而，這是一個更大的區域工廠，有一個大的收集區域，這樣的進水是老化的(化糞池)，這可以解釋一些社區多樣性的差異。然而，提出的主要因素是TF/SC和CAS之間的操作/環境條件的差異，TF/SC混合液隻暴露在TF生物塔產生的殘留有機物中。

DNA測序還顯示，在多個汙水處理係統中發現了4種細菌:(a)在台式和斯科菲爾德全尺寸mbr中發現了未培養的副球菌sp.克隆3-3，以及Honouliuli TF/SC。這是紅杆菌科的一個屬，是水生環境和廢水中常見的革蘭氏陰性異養菌，(b)未培養的細菌克隆SB3-6在中試規模的MBR和Honouliuli TF/SC中發現，(c)未培養的梭菌sp.在東檀香山CAS和Honouliuli TF/SC中發現。這些細菌是混合液體中常見的革蘭氏陽性厭氧菌，100種細菌中的一些是重要的病原體，(d) Wahiawa CAS和Honouliuli TF/SC中發現了未培養的克雷伯氏菌。這些細菌是腸杆菌科的革蘭氏陰性兼性成員，在自然界中隨處可見。這四種生物不一定在這些係統中起主導作用，但它們在多個設施中被發現的事實可能表明它們在基質偏好/可用性以及可能的生理競爭優勢方麵具有共同的性質。

圖2:比較從東檀香山CAS、Wahiawa CAS、Honouliuli TF/SC、Honouliuli的bench - scale和中試規模MBR以及用GelCompar II分析的Schofield全尺寸MBR中獲得的細菌群落。基於曲線:皮爾遜相關;方法:無加權配對分組(UPGMA)。

結論

73%的DGGE條帶被成功測序到最接近的係統發育隸屬關係，在多個汙水處理廠的混合液中發現了幾個相同的細菌種類。DGGE譜帶的聚類分析表明，處理相同廢水的實驗規模和中試規模mbr的培養物之間有72%的相似度，但與小規模mbr的相似度較低(44%)。東檀香山CAS和Wahiawa CAS的植物培養具有64%的相似性(僅居住城市廢物，但鹽度差異很大)，而CASs和Honouliuli TF/SC之間的相似性較低(43%)，這被認為是由於不同的廢物特征和操作/環境製度)。MBR組和非MBR組之間的相似性處於顯著的低水平(小於5%)，這是因為即使處理具有相同或相似特征的廢水，但由於操作製度的差異，導致培養物的生理狀態不同。由於在試驗台、中試和全規模mbr以及CAS和TF/SC過程中微生物種群似乎有所不同，因此在將從試驗台和中試規模研究收集的數據外推到全規模mbr的預期效果時必須謹慎。需要進行更多的研究來探索操作條件對mbr中微生物群落多樣性和豐度的影響，因為大多數研究都集中在mbr的性能和膜汙染上，而沒有考慮到所涉及的細菌群落。

參考文獻

1. EPA(2007)廢水管理情況說明，膜生物反應器。美國環境保護局，華盛頓。［Ref。］
2. Radjenovi´c J, matoiic M, mijatoviic I, petroviic M, Barceló D(2008)膜生物反應器(MBR)作為一種先進的廢水處理技術。組屋環境化學5:37-101。［Ref。］
3. 吳玉軍，王麗敏，張愛梅，福島T，李玉春，程仕生，等。(2013)食品與微生物比和膠體化學需氧量對全尺寸膜生物反應器處理薄膜晶體管液晶顯示廢水硝化性能的影響。生物資源技術14:35 -40。［Ref。］
4. Le-Clech P, Chen V, Fane TAG(2006)用於廢水處理的膜生物反應器的汙染。中國生物醫學工程學報(英文版)［Ref。］
5. 李江,楊,李Y,黃FS,蔡HC(2008)生物成分和活性汙泥性能的影響在一種新型一體式膜生物反應器膜汙染。海水淡化225:356- 365。［Ref。］
6. 吳傑，黃霞(2009)膜生物反應器混合液性質對汙染傾向的影響。中國生物醫學工程學報(英文版)［Ref。］
7. 阿邁德卓，趙傑，林伯榮，宋國強，安克凱(2007)汙泥停留時間對膜生物反應器中膜汙染及微生物群落結構的影響。中國生物醫學工程雜誌28(5):561 - 561。［Ref。］
8. 吳斌，易鬆，Fane AG(2011)不同固相保留時間下膜生物反應器中餅垢微生物行為。生物資源技術102:2511-2516。［Ref。］
9. 張迪，黃燕，申宏，李偉(2013)鹽度對膜生物反應器生物質特性及膜汙染的影響。生物科技141:50-56。［Ref。］
10. Vuono DC, Benecke J, Henkel J, Navidi WC, Cath TY，等(2015)活性汙泥元群落的擾動與時間分配。Isme 9:425 -435。［Ref。］
11. 萬春春，Wever HD, Diels L, Thoeye C，梁劍傑，等。(2011)全規模膜生物反應器處理城市汙水微生物的生物多樣性及種群動態。水文獻45:1129-1138。［Ref。］
12. Miura Y, Hiraiwa MN, Ito T, Itonaga T, Watanabe Y，等(2007)mbr處理城市汙水中的細菌群落結構:群落穩定性與反應器性能的關係。水Res 441: 627-637。［Ref。］
13. Stamper DM, Walch M, Jacobs RN(2003)通過16S rRNA基因片段的變性梯度凝膠電泳分析監測灰色水處理膜生物反應器中細菌種群的變化。應用環境微生物69:852-860。［Ref。］
14. Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG(1993)通過變性梯度凝膠電泳分析聚合酶鏈反應擴增的編碼16S rRNA的複雜微生物種群。應用環境微生物學59:695-700。［Ref。］
15. Kurisu F, Satoh H, Mino T, Matsuoc T(2002)利用核糖體RNA方法和醌譜法分析嗜熱接觸氧化過程中的微生物群落。水Res 36: 429- 438。［Ref。］
16. Nübel U, Engelen B, Felske A, Snaidr J, Wieshuber A，等(1996)用溫度梯度凝膠電泳檢測多粘芽孢杆菌16S rrna編碼基因的序列異質性。微生物學雜誌(英文版)［Ref。］
17. Fogel GB, Collins CR, Li J, Brunk CF(1999)原核基因組大小和SSU rDNA拷貝數:估計混合種群的微生物相對豐度。微生物Ecol 38: 93-113。［Ref。］
18. Lane D (1991) 16S/23S rRNA測序。細菌係統的核酸技術。王文華，王文華(主編)。約翰·威利父子公司，英國。［Ref。］
19. Øvreås L, Forney L, Daae F, Torsvik V(1997)通過pcr擴增16S rRNA編碼基因片段的變性梯度凝膠電泳測定Saelenvannet meromictic湖中浮遊細菌的分布。應用環境微生物63:3367- 3373。［Ref。］
20. H鐵石，J仁勇，X思清，Roger B Jr(2014)不同參數對膜生物反應器處理城市汙水微生物群落的影響。費森尤斯環境通訊23:976-985。［Ref。］
21. Henke W, Herdel K, Jung K, Schnorr D, Loening SA(1997)甜菜堿改善了GC-rich DNA序列的PCR擴增。核酸Res 25: 3957-3958。［Ref。］

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Xu-Sadri H, Lamichhane KM, Babcock R(2015)膜生物反應器和其他處理係統中細菌群落的分析與比較。國際J水廢水處理2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-5299.112

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出版的曆史:

收到日期:9月23日

接受日期:11月17日

發表日期:2015年11月23日