水和廢水處理- Forschen科學

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水生真菌的毒素抗性帶來了環境友好的修複可能性:毛黴EH5對藍藻毒素的生長響應和生物吸附潛力的研究

伊芙琳Balsano1Maranda Esterhuizen-Londt1霍克Enamul2Stephan Pflugmacher1 *

* 1Technische Universität柏林，生態毒理學影響研究和生態毒理學部門，德國柏林，10587 ern - reuters廣場1
 2HelmholtzZentrum München -德國環境衛生研究中心，地下水生態研究所，Ingolstädter德國紐beplay最新下载赫堡Landstr. 1,85764

*通訊作者:Stephan Pflugmacher，技術部門Universität柏林，生態毒理學影響研究和生態毒理學部門，德國柏林，ernst - reuters廣場1,10587，電話:+49 3031429023，傳真:+49 3031429022，電子郵件:stephan.pflugmacher@tu-berlin.de

摘要

藍藻產生各種有害的次生代謝物，對全球水生生態係統和人類健康構成嚴重威脅。生物降解是水淨化研究的一個重要課題，尤其提供了一種環境友好的修複策略。在這裏，我們介紹一種水生真菌屬毛黴菌這顯示出相當大的前景，應用作為真菌修複劑去除水中藍藻毒素。在本研究中，我們研究了三種不同的藍藻毒素，即肝毒素微囊藻毒素- lr，神經毒素β- n-甲氨基-l-丙氨酸和細胞毒素圓柱形精蛋白對的敏感性毛黴菌hiemalisEH5，以及毒素對真菌生長和生物量生產的影響，通過徑向延伸和幹重(DW)測量。此外，我們建立了從毛黴hiemalis EH5營養部分提取個別藍藻毒素的優化策略，並分析了其生物吸附潛力通過質/女士測量。該真菌表現出快速的適應行為和對毒素較強的抵抗力。當將暴露的真菌與未處理的對照進行比較時，在生長方麵沒有發現顯著差異。這表明藍藻毒素對真菌不是致命的，而且有機體可以在它們的存在下不受幹擾地生長和發育。采用LC - MS/MS檢測定量毒素吸收，回收率為>既定提取方法的60-85%。在將真菌分別暴露於每種毒素24和48小時後，我們發現每克菌絲生物量(dw)吸收0.1到1.7毫克毒素的顯著量(p<0.05)。我們的研究結果表明毛黴菌hiemalisEH5是一種理想的生物降解係統，可用於修複汙染水體中的藍藻毒素。

關鍵字

藍藻毒素;生物降解;毛黴菌hiemalisEH5;增長反應;生物吸附;毒素吸收

簡介

藍藻是一種普遍存在的生物，主要存在於水生環境中。它們是地球上最早的生物之一，也是製造氧氣的先驅者。盡管它們在進化和生態上的重要性毋庸置疑，但由於它們能夠形成各種具有生物活性的次生代謝物[2,3]，它們現在正成為一個日益引起環境和公共健康關注的問題。水體的富營養化和氣候變化因素促進了微藻和藍藻的發育，導致大規模爆發[4,5]。產生的藍藻毒素主要保留在藍藻細胞內，但在衰老和細胞裂解過程中特別釋放[6,2]。這些次生代謝物表現出不同的作用模式，從而對水生動植物[7-10]和人類健康產生不利影響[11]。根據其生物學作用，可將其分為五大類:肝毒素、神經毒素、細胞毒素、皮膚毒素和脂多糖[2]。它們的結構多樣性在圖1中清楚地說明了，圖中顯示了三種常見的青藻毒素。

微囊藻毒素，環七肽，是最廣泛的毒素，因此是最好的研究。微囊藻毒素- lr (MC-LR，圖1)被認為是這個家族[12]中毒性最大的化合物。β- n Methylamino -l-丙氨酸(BMAA，圖1)是一種高度活性的非蛋白氨基酸，可能由所有藍藻合成[13-15]，可以在遊離或蛋白結合的[16]中發生。BMAA被認為會導致各種神經退行性疾病，如ALS-PDC和阿爾茨海默病[16]，最近已被證明在極低濃度下可誘導神經損傷[17,18]。圓柱形精蛋白(CYN，圖1)已在澳大利亞和巴西造成人類中毒[19]，並導致動物[20]死亡。

為了改善水質和安全，從水體中去除藍藻毒素至關重要，也是一個日益引起人們興趣的新興研究領域。生物吸附和生物轉化被證明是在環境條件下有效清除水體中藍藻毒素的最合適方法[22]，並提供了自然和可持續戰略[23]的特別優勢。

真菌生物吸附在汙水處理過程中得到了主要關注。陸地和水生真菌對重金屬的生物吸附作為重金屬廢水的替代處理方法已經有了廣泛的研究。真菌對重金屬和放射性核素的吸附等曲黴屬真菌spp。毛黴菌spp。根黴種蟲害和青黴菌spp和酵母(釀酒Spp .)已經在不同程度上被觀察到[24-27]。

此外，真菌對不同異種生物製劑的吸收和生物降解是已知的。4種外生菌根真菌在15天內幾乎完全從培養基中修複1,1,1-三氯-2,2-雙(4-氯苯)乙烷(DDT)，隻有40-50%被發現在菌絲中積累，而其餘的DDT被降解為代謝物，經GC-MS[28]鑒定。

圖1:藍藻毒素微囊藻毒素-LR (MC -LR)、β- n-甲氨基-l-丙氨酸(BMAA)和圓柱精子素(CYN)的分子結構。

白腐菌最成功的應用在於紡織工業、造紙和製漿工業廢水的淨化，因為它們具有很高的脫色能力。真菌的菌絲栓菌屬veriscolor在合成染料與菌絲體[29]接觸的第一個小時內表現出初步吸附。真菌細胞對17種分散染料的吸附使其脫色效果顯著Cunninghamella polymorfa文化[30]。一般來說，染料分子在細胞表麵的生物吸附似乎很快，往往在幾個小時內完成。存在於真菌細胞壁中的氨基、羧基、硫醇和磷酸基負責結合染料分子[31]。Fu和Viraraghavan[32]研究了四種染料的生物吸附黑曲黴生物質能．Phanerochaete chrysosporium(p . chrysosporium)用於MyCoR(菌絲顏色去除)反應器[33]或固定在藻酸鹽床上，用於去除氯酚[34]。

迄今為止，盡管真菌在水處理中發揮了重要作用，但關於真菌對氰化物毒素的生物吸附和降解的信息非常有限。研究主要集中在篩選細菌的能力，以控製和降解水中環境中的有害藍藻細菌及其產生的毒素。目前對真菌的研究較少，包括對白腐真菌的研究，白腐真菌可以抑製藍藻種的生長[35-37]。此外，白腐菌的能力Trichaptum abietinum1302BG降低MC-LR在培養微胞藻屬綠膿杆菌PCC 7806已經報道過。12小時後觀察到細胞外MC-LR完全降解。最近，壓力木黴屬citrinoviride已經確定可以選擇性地抑製藍藻的生長微胞藻屬綠膿杆菌並有效降解其微囊藻毒素。72小時後毒素完全消除[38]。這些結果表明，真菌菌株降解微囊藻毒素的速度(12-72小時)比細菌菌株(6-25天)更快[39,40]。因此，有必要篩選更多的真菌種類，特別是水生真菌，以作為抗藍藻毒素的有效生物製劑。

真核真菌由於底物特異性很低，降解能力超過細菌[41,42]。細菌通過遺傳特異性降解機製發揮作用，真菌則通過非特異性細胞外氧化酶發揮作用，如過氧化物酶係統[43,44]和穀胱甘肽- s -轉移酶[45]。穀胱甘肽-異位轉移酶是脫毒代謝的關鍵酶，通過催化異種生物與穀胱甘肽的結合來保護細胞免受毒物的侵害。具有穀胱甘肽s -轉移酶活性的真菌種，如屬擔子菌亞門,半知或Zygomycotina,如。Cephalosporium青黴菌,木黴屬而且毛黴菌sp .可用於淨化含硫水體[46]。毛黴菌hiemalis（m . hiemalisF. irnsingii (DSM 14200, alias EH5)具有獨特的高穀胱甘肽- s -轉移酶活性，對H . irnsingii表現出較高的耐受性2S[47]。此外，這種真菌在細胞壁上具有官能團，能夠生物吸附重金屬，如鉻VI[48]和鎳[49]，而且如果與除草劑異丙隆聯合使用，它還以其快速和完全緩解除草劑異丙隆的潛力而聞名p . chrysosporium[47]。然而,p . chrysosporium需要39°C的最佳生長溫度，這導致生物技術應用中的高溫消耗。相比之下,m . hiemalisEH5不受溫度影響，在低於地下水溫度(如5℃)的溫度下仍能產生孢子。這為真菌生物的季節性應用鋪平了道路，並使其能夠在深層沉積物層和極端環境條件下去除汙染物。m . hiemalis可應用於兼性好氧/厭氧，還原或H2年代汙染水;此外，它能在較寬的pH值範圍(3-11)內抵抗金屬汙染，可用於地下和地表水、汙水、廢水和工業和礦山水[50]。

由於其有前途的特點m . hiemalisEH5可能降解和去除汙染水體中的藍藻毒素，本研究的目的是了解MC-LR、BMAA和CYN對藍藻敏感性和生長響應的影響m . hiemalisEH5及其對藍藻毒素的吸附能力。

材料和方法

真菌菌株

m . hiemalisEH5 (DSM 14200)，以前被分離為水生H2來自德國巴伐利亞含硫Irnsing泉水生物膜的抗S菌株[45]，來自德國萊布尼茨研究所DSMZ -德國微生物和細胞培養集合的培養集。

藍藻毒素

藍藻毒素微囊藻毒素- lr (MC-LR)， β- n-甲氨基- l -丙氨酸鹽堿(BMAA)和圓柱形精蛋白(CYN)從商業供應商(Enzo Life Sciences, Alexis Biochemicals ALX-350-012-M001;Sigma-Aldrich，慕尼黑，德國CAS編號:16676-91-8;Enzo生命科學，Alexis Biochemicals ALX-350-149-M001)。在純甲醇中製備濃度為1 mg/mL的預儲備溶液，在-20℃下保存，在消毒的雙蒸餾水中製備5、50、100、250、500和1000µg/L的連續稀釋溶液用於實驗。

培養條件

實驗室純培養物的短期保存是通過每月一次的麥芽提取物瓊脂板定期接種來實現的。

為了菌種的維持和繁殖，培養物生長在固體麥芽提取物瓊脂基質上。營養培養基包括30 g麥芽提取物肉湯(Sigma-Aldrich, Fluka 70146)， 15 g細菌瓊脂(Oxoid no 1, LP0011)， 1 L雙蒸餾水(Roth, T172.3)，添加0.82 mM硫代硫酸鈉和100 ppm硫酸鏈黴素(Roth, HP66.1)[45]。在121℃下蒸壓20分鍾，冷卻至60℃後，將10 mL瓊脂培養基無菌倒入培養皿中。將平板用副膜密封，並在4°C的黑暗中保存，以便進一步實驗。

圓盤擴散法:接種和暴露

菌絲生長實驗是在25°C的黑暗環境下進行的，據報道，25°C是M. hiemalis EH5[51]的最佳生長溫度。用無菌鑷子從1平方厘米的瓊脂表麵輕輕取下含有3-4周齡菌落的孢子囊孢子的菌絲墊，放置在距離培養皿壁1厘米的地方。

該方法是根據Kirby-Bauer圓盤擴散試驗[52]的改進而采用的。將直徑約5mm的小濾紙盤分別浸入MC-LR、BMAA和CYN的高濃度毒素溶液(100 μg/mL)中。每種毒素使用不同的圓盤，並放置在單獨的瓊脂板上進行抑製區試驗研究。水作為陰性對照，抗絲裂(±)-硝唑鹽作為陽性對照。區直徑測量從邊緣到邊緣橫跨帶抑製中心的圓盤中心。真菌生長的抑製區被用來衡量其敏感性。較大的抑製區表明該生物是敏感的(S)，而較小或無抑製區表示耐藥性(R)。進行了三個獨立的重複。

測量徑向生長速率和生物量生產

分別用1ml不同濃度(5、100、250、500和1000 μg/L)的MC-LR、BMAA和CYN毒素溶液包被在麥芽提取物瓊脂上製備瓊脂板。直徑5毫米的菌絲盤從3-4周的培養物中取出並轉移到培養皿上。培養皿在25°C的黑暗環境下孵育。

每隔24小時標記一次放射狀延伸，持續7天，或直到達到最大延伸。從接種體的中心開始測量菌落直徑。距離值用平板三個測量點(一個中軸和左右軸成45°角)的平均值表示。徑向生長速率由菌落半徑隨時間的線性回歸計算。

為了評價生物量生產，測定了幹重。真菌菌落從培養皿中取出，與瓊脂凝膠一起轉移到50毫升裝滿蒸餾水的試管中。試管在高壓滅菌器中加熱至110°C 30分鍾，以融化瓊脂，然後立即將內容物倒入0.5 mm的濾網，用蒸餾水衝洗。完整的菌絲收集在預先加重的濾紙(Whatman no。1p或e size), dried in the oven at 80° C until a constant mass was reached (about 20 hours) and cooled to room temperature in a desiccator. Dry weights were noted after seven days of incubation [53].

生物吸附:暴露場景和樣品收集:十天的古老文化m . hiemalisEH5生長在Sabouraud Dextrose Broth (Sigma-Aldrich, Fluka S3306)瓊脂培養基上，25°C黑暗培養皿中，在最佳生長條件下分別暴露於1ml 1000 μg/L的濃縮MC-LR、BMAA和CYN溶液中24和48小時。試驗共進行5個重複，對照組為純水。采收前用5ml水徹底洗滌真菌菌絲3次，然後用5ml甲醇洗滌1步，再用5ml水重複洗滌3次，使菌絲板和菌絲墊表麵的毒素殘渣完全清除。然後用鑷子收集菌絲，速凍在液氮中，凍幹一夜(-48.3℃，0.1163 mbar)。

毒素提取:破壞和均質化營養部分m . hiemalisEH5通過Ultra-Turrax處理(最大轉速為25,000 rpm)實現。30 s)，然後用玻璃陶器研磨凍幹的菌絲(20- 50mg dw)，加入1-1.5 mL本節所述每種毒素的分解/提取溶劑。由於所使用的機械破壞法對孢囊孢子具有抗性，因此隻能測定真菌菌絲中的毒素含量。

MC-LR用0.1%三氟乙酸(TFA)在70%甲醇中提取。每個菌絲勻漿在水浴中超聲2小時，振蕩45分鍾，離心(4000 xg 10分鍾)。收集上清液，在500 μL萃取溶劑中重懸。振蕩和離心循環總共進行了三次。組合提取物在真空濃縮器中30°C蒸發至幹燥，得到的幹燥組分用250 μL甲醇100% (MS級)重新溶解，離心後插入HPLC-MS/MS係統。

按照從藍藻分離菌[54]中提取BMAA的方法，用0.1 M三氯乙酸(TCA)在水浴中超聲提取BMAA 1小時。在4℃下15,800 xg離心3分鍾後，上清中獲得遊離BMAA以沉澱蛋白質。用250 μL 0.1 M TCA洗滌2次，將所有上清混合。為了釋放蛋白結合的BMAA，顆粒懸浮在1ml 6 M鹽酸中，水解過夜。BMAA在使用Phenomonex EZ進行高效液相色譜/質譜分析之前進行衍生TM符合製造商的規格。衍生化包括吸附劑尖端的濃縮步驟、洗滌、從固定相中洗脫和去除，以及使用專有的氯甲酸酯衍生物進行衍生化以及樣品清理通過液體-液體萃取和有機溶劑蒸發在一個溫和的氮氣流。其餘幹燥的氨基酸衍生物被重新溶解在LC流動相組分的混合物中(水/甲醇，3.2:6.8)。

Welker等人發表的[55]方法的改進已被用於提取CYN，純水已被證明可以有效地從菌絲材料中提取CYN。將勻漿後的菌絲水懸浮液在水浴中超聲15min，搖勻1h，再次超聲，4000 xg離心15min。組合的上清液在真空濃縮器中幹燥，幹燥的組分在乙腈和水(95:5)的混合物中重新懸浮。所有的步驟都是在黑暗中進行的，因為CYN是光敏的。

質/女士:MC-LR的色譜分離采用Kintex C18色譜柱(2.6 μm, 2.1 x 50 mm)，使用Agilent 1200 Infinity Series液相色譜係統和Agilent Technologies 6460 Triple Q耦合TM．柱烘箱溫度設置為40℃，注射量設置為10 μL。在分析過程中使用0.2 mL/ min的流速，在H中使用0.1% TFA的溶劑梯度2O (MS級，流動相A)和0.1% TFA在乙腈(MS級，流動相B)中分離。在跑步開始時，移動階段B在3分鍾內從0增加到35%，隨後增加到65%，直到3.75分鍾，在此條件下保持5分鍾，最後以3分鍾的post time結束。MC-LR的保留時間為6.15分鍾。對於後續的MS-MS檢測，使用MRM模式(正模式)，MC-LR的傳質為995.5 (Q1)和135、213和379 (Q3)。方法校準為線性(R2= 0.999)在0.01 ~ 100 μg/L之間，柱上定量下限為2 pg。

衍生BMAA和內部標準品在Phenomenex AAA-MS氨基酸分析柱(2.0 x 250 mm，包括在試劑盒中)(在同一設備上)上色譜分離，柱烘箱溫度為35℃。樣品進樣量為1µL，流速為0.25 mL/min，使用以下溶劑梯度，在H中加入10 mm甲酸銨2O (MS級，流動相A)和MeOH中的10mm甲酸銨(MS級，流動相B):流動相B在13分鍾內從68%增加到83%，隨後立即下降到68%，流動相B在此條件下持續到17分鍾。衍生BMAA的保留時間被確定為8.2分鍾。對於後續的MS檢測，將使用MRM模式(正模式)m / z333 (Q1，衍生BMAA)測量到產物離子的轉變m / z273年和245年。校正為線性(R2= 0.999)介於1 ~ 100 μg/L之間。檢測限(LOD)為1 ng/mL衍生BMAA。在考慮衍生化效率的情況下，使用內標同精氨酸(包含在試劑盒中)對衍生化BMAA進行定量[54,10]。

在與MC-LR相同的設備上，用Kinetex HILIC柱(2.6 μ m, 2.1 x 100 mm)實現CYN的色譜分離。柱箱溫度為35℃，注射量為20µL，流速為0.5 mL/min。從95%乙腈(MS級)開始梯度洗脫5分鍾，然後在3分鍾內降低到50%，貼出時間為2分鍾，結果CYN的保留時間為4.2分鍾。對於後續的MS - MS檢測，將使用MRM模式(正模式)，對CYN的傳質為416 (Q1)和176和194 (Q3)。該方法的校準是線性的(R2= 0.998)，含量在0.01 ~ 100 μg/L之間，柱上LOD為2 pg。

統計分析

研究了MC-LR、BMAA和CYN對植物生長和生物吸附勢的影響m . hiemalisEH5采用SPSS統計軟件分析(α= 0.05, 95% CI)。夏彼羅-威爾克氏測驗(p>0.05)表明，各因子(徑向生長延伸、幹重和吸收)均呈正態分布，但有一些例外(解釋如下)，采用不同響應(徑向生長延伸、幹重和吸收)的方差分析表對各因子(p> 0.05)。數據不服從正態分布(第7天生長和生物量由CYN 250µg/L的幹重確定)，采用非參數測試，如Kruskal-Wallis和mann - whitney - u測試(p> 0.05)。攝取采用t檢驗(p< 0.05)。

結果與討論

從水體中清除藍藻毒素是維持人類和生態係統健康的基礎。這項研究的重點是三種發生在世界各地的不同作用模式的氰毒素:肝毒素MC-LR，神經毒素BMAA和細胞毒素CYN。

作為第一步，進行抑製區測定以研究m . hiemalisEH5轉向MC-LR, BMAA和CYN。3個獨立重複的數據和孵育3天後的照片如表1和圖2所示(A-C分別為100 μg/L MC-LR、BMAA和CYN)。m . hiemalisEH5似乎對測試的所有氰毒素都具有耐藥性，與陽性對照抗有絲分裂-硝唑鹽(±)相比，EH5缺乏抑製區形成(圖2A-C)強調了這一點(圖2D)。在A-C中，真菌表現出快速的適應能力，並明顯生長在有毒浸漬過濾區，而對MC-LR、BMAA或CYN沒有表現出任何敏感性。D為陽性對照的一個例子，觀察到一個清晰的14.3±0.6 mm的區域形成。

這種行為證明真菌的生長不受影響m . hiemalisEH5能夠在測試的藍藻毒素存在的情況下生長。

在培養皿中更詳細地檢查了生長特性，在培養皿中瓊脂表麵分別均勻地包覆了純MC-LR, BMAA和CYN毒素溶液，以闡明對生長速率常數的影響m . hiemalisEH5在MC-LR, BMAA和CYN存在的不同生態相關濃度[56]。最高濃度是根據在中國巢湖爆發中報告的最高氰毒素濃度[57]和較低濃度與發生在德國淡水中的較低劑量有關(在柏林水體中高達119 μg/L的MC-LR，[56]。

圖2:抑製區試驗是對藍藻毒素MC - LR (A)、BMAA (B)和CYN (C)與對照(±)硝唑鹽(D)進行的柯比-鮑爾圓盤擴散試驗的適應。

表1:抑製區直徑測定和敏感性表征。數據為平均值±標準差。水為陰性對照，(±)-硝唑鹽為陽性對照(R =耐藥，S =敏感)。

表2:hiemalis EH5暴露於1000µg/L 24和48小時後，MC-LR、遊離BMAA和CYN的菌絲濃度(mg / g dw±SE)。數值為平均值±SE。治療組和對照組在兩個采樣日期之間存在顯著差異(方差分析，t檢驗，p < 0.05)，無時間依賴性(p > 0.05)。*ND未檢測到。

每天監測培養物的徑向延伸，並繪製隨時間變化的曲線。白灰色的殖民地m . hiemalisEH5細胞以每天11.2±0.5 mm的恒定速度循環膨脹。線性增長曲線如圖3A-C所示。

數據以毫米為單位表示，在所有時間點分別分析每種毒素濃度與對照(不添加藍藻毒素)的對比。在全濃度範圍(5µg/L ~ 1000 μg/L)內，無顯著差異(方差分析，p>0.05)，表明m . hiemalisEH5不會因真菌暴露在MC-LR、BMAA和CYN濃度增加的環境中而受到負麵影響。即使在最大暴露濃度下，真菌仍在繼續生長，沒有觀察到毒性影響。當在實驗結束前達到最大延伸時，取接種體到板壁的距離值(80 mm)進行計算和圖解;在圖3A-C中，條形圖用星號標出。

為了揭示藍藻毒素對菌絲發育和生產力影響的更精確信息，也考慮了空氣生長。除了橫向生長外，還測定了生物量產量通過幹重量分析法。

7天後，當真菌菌落直徑達到70到80毫米之間時，記錄幹重。除CYN在250 μg/L處外，其餘幹重均呈正態分布。得到的數據集用方差分析進行分析，評價的毒素和濃度依賴性反應與對照相比沒有顯示出任何顯著偏差(p> 0.05)。對於250 μg/L的CYN，非順磁性mann - whitney - u檢驗證實了同樣的假設(p>0.05)。

藍藻毒素沒有顯示出影響生物量的生產m . hiemalisEH5在暴露7天後也不會對菌絲生長產生負麵影響(圖4)。

對所有毒素的濃度依賴幹重結果進行了獨立測試，證明在整個濃度範圍內與對照無顯著偏差(方差分析，p> 0.05和Kruskal-Wallis/ mann - whitney - u檢驗，p> 0.05)。

圖3:濃度依賴性生長動力學m . hiemalis在藍細菌毒素MC - LR (A)、BMAA (B)和CYN (C)存在的不同濃度(條形為白色5 μg/L、灰色50 μg/L、對角條紋100 μg/L、點紋250 μg/L、水平條紋500 μg/L、方紋1000 μg/L和黑色對照)的情況下，EH5呈陽性反應。數據為三次獨立重複的平均值±標準差。*表示最大周邊，最大距離達到80毫米，該值用於計算和圖形說明。在每個時間點比較濃度/毒素與對照時，未觀察到統計學差異(p> 0.05)。

這些結果表明，該水生真菌對MC-LR、BMAA和CYN具有較高的耐受性，這可能取決於其通過特定酶降解毒素的能力。

進行了吸收實驗，以檢查生物吸附能力和可能的真菌-毒素相互作用。提取方法從真菌細胞中分離藍藻毒素，回收率較高，MC-LR的回收率在60%以上，CYN的回收率在85%以上。采用EZfaast從Esterhuizen和[14]中提取和衍生BMAATM氨基酸分析kitf或LC/MS (Phenomenex)。

在培養過程中可獲得適量的菌絲生物量m . hiemalisEH5在最佳生長條件下培養10天。m . hiemalis未暴露於MC-LR、BMAA和CYN的EH5對照在24和48 h後均不含藍藻毒素(圖5)。以生長試驗中使用的最高濃度(1000 μg/L)作為暴露劑量，分別對每種毒素進行24和48 h的暴露時間5個重複。所有三種藍藻毒素的測試都是由m . hiemalisEH5(圖5)表現出良好的生物吸附能力。暴露24小時後，毒素水平在毫克/克範圍內觀察到，48小時後仍在菌絲體中檢測到m . hiemalisEH5。然而，沒有觀察到與時間有關的吸收，因此無法說明吸收/流出的速率和可能的生物積累。暴露24 h後，在M. hiemalis EH5的營養部分，每克菌絲生物量(dw)的最高攝入量為0.58 mg MC-LR，檢測到的BMAA和CYN含量分別為0.22和0.13 mg毒素/g dw。在長時間暴露48小時後，當比較不同暴露時間下每種毒素的數據時，未觀察到生物吸附模式的顯著變化(p> 0.05)。然而，暴露於MC-LR的菌絲生物量所含的毒素濃度明顯高於暴露於BMAA和CYN的菌絲(p<0.05)，而BMAA和CYN的攝取程度之間無顯著差異(p> 0.05)。毒素的攝取需要穿透真菌細胞，其效率與真菌生物細胞壁以甲殼素和殼聚糖為主要成分的特殊結構有關。根據它們的化學性質，分子可以通過被動擴散或主動傳輸被吸收。MC-LR的疏水性可能是增強毒素攝取的一個可能的解釋m . hiemalisEH5菌絲細胞，由於甲殼素細胞壁是高度疏水的，因此疏水分子可能更容易進入細胞，因為它們更容易與親脂細胞壁相互作用。BMAA是高度親水性的，但由於它是一個隻有一個氨基酸組成的小分子，它可以通過簡單的擴散吸收，也可以通過氨基酸載體之一運輸到細胞內;BMAA與穀氨酸的相似性及其對穀氨酸受體的激動活性已被報道，這可能解釋了該毒素在真菌菌絲中的攝取途徑。由於BMAA以多種形式存在於血漿中(中性、兩性離子、三極陽離子和α-和β-氨基甲酸酯)，因此每種物質可能對一個或多個載體表達親和力。與(水生)植物和動物的吸收機製[16]相比，在水生真菌中沒有觀察到BMAA與蛋白質的結合機製，這表明一種不同的吸收模式可能伴隨著對真菌有機體較低的毒性，因為BMAA不會積累並合並到細胞蛋白質中。激活的防禦機製可能阻止BMAA蛋白進入菌絲m . hiemalisEH5，然而，這需要進一步的研究，因為暴露時間不足的假設也不應被拒絕。可能需要更長的周轉時間。盡管CYN具有親水性，使得分子不太可能穿過細胞壁，但其較小的分子量使得被動擴散的可能性相當大。

圖4:生物量產量以暴露一周後的幹重表示。數據為三次獨立重複的平均值±標準差。當濃度/毒素與對照比較時，未觀察到統計學差異(p> 0.05)。

圖5:暴露於1000 μg/L MC-LR、BMAA和CYN 24和48 h後，hiemalis EH5對毒素的總吸收以每克幹重凍幹菌絲生物量的毫克毒素表示。數據為平均值±標準差(n=5)。

由於本實驗中所使用的機械破壞方法對真菌孢子囊孢子具有抗性，LC-MS/MS定量的藍藻毒素數量僅歸因於水生真菌營養菌絲部分的MC-LR、BMAA和CYN的攝取(表2)。這是關於水生真菌對藍藻毒素攝取的首次報道。其結果是非常有前途的生物吸附能力m . hiemalisEH5所處的範圍在某些情況下超過了幾種水生植物的吸收潛力，此前有報道稱，這些植物可以有效積累大量的藍藻毒素。在三種有根水生植物中，應用無線電標記的MC-LR的吸收量在0.6%到1.75%之間加拿大綠蚤,Vesicularia dubyana[59]。相比之下，在m . hiemalisEH5，顯示了應用MC-LR的1.95 ~ 2.9%的吸收。另一項研究表明MC-LR在小調Lemna (l小調)而且Chladophora fracta (C. fracta)[60]。l .小暴露於MC-LR 5 d後，其吸收率為0.288±0.009 mg/gww，但使用的處理劑量是MC-LR的20倍。c . fracta當劑量達到6倍時，最大攝氧量為0.042±0.015 mg/gww。當比較僅限於較低濃度下得到的結果時，該濃度仍然比所適用的濃度高3倍m . hiemalisEH5在本研究中檢測到的MC-LR攝取水平為0.046±0.007 mg/gwwl .小和0.041±0.016 mg/g ww，在相對可比濃度條件下均顯著低於m . hiemalisEH5。水下大型植物苦草屬•MC-LR暴露14 d ~ 25 μg/L時，其含量最高為0.013.63±0.00342 mg/gdw。

水生真菌M. hiemalis EH5對BMAA的吸收明顯高於模型水生植物c . demersum．有趣的是，如上所述，沒有檢測到蛋白質相關形式m . hiemalis從而顯示出真菌和(水生)植物或動物對BMAA的生物吸附特性的差異。遊離BMAA和蛋白結合BMAA在水生植物中均有發現。c . demersum[54],Fontinalis antipyretica，Riccia fluitans,Lomariopsis劃線的[10],在小麥小麥[61]和動物，如淡水貽貝[62]和老鼠[63]。

藍藻毒素被m . hiemalisEH5等不再是食物鏈中可用的。更具體地說，毒素可以在原地或轉移原地被分解，通過這種方法完全消除m . hiemalisEH5，並從汙染水體中持久去除。

綜上所述，本研究表明，三種被測藍藻毒素對水生真菌無毒性影響m . hiemalisEH5，而且這種生物在它們的存在下很容易生長。沒有觀察到生長和生物量生產下降m . hiemalisEH5培養液暴露在MC-LR、BMAA和CYN的濃度5-1000 μg/L中可達7天。此外，快速和顯著的MC-LR, BMAA和CYN的吸收m . hiemalisEH5演示。這些結果構成了水生真菌吸收藍藻毒素的第一個報告。適應有毒幹擾的能力

生物吸附表明水真菌具有較強的抗性m . hiemalisEH5，這是它作為生物修複有機體使用的先決條件。以前的研究已經表明m . hiemalisEH5分解除草劑異丙隆。可能被攻擊的位點是C-C和C-N鍵[47]，它們也存在於MC-LR, BMAA和CYN中(結構如圖1所示)。因此，有可能m . hiemalisEH5可能也能分解藍藻毒素的結構並利用代謝物作為碳源，這使得m . hiemalisEH5是用於真菌修複目的的理想生物體。這種水真菌在其自然棲息地發揮著簡單的生態係統功能，利用它可能是生物降解和清除受汙染水體中的藍藻毒素領域的一個突破，並可能提供一種對環境友好和可持續的清除過程。這種水生真菌已顯示出對高濃度毒素的抵抗力;這一點加上它在極端環境條件和低溫下的已知有效性，使[47]具有通用和不依賴季節的應用。建議進一步研究其代謝降解能力m . hiemalisEH5對藍藻毒素。

確認

我們感謝柏林elsa - neumann - des landdes stipendium對Evelyn Balsano的財政支持。我們感謝V. ContardoJara博士的科學投入和S. Kühn博士在研究中的技術援助。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Balsano E, Esterhuizen-Londt M, Hoque E, Pflugmacher S(2015)水生真菌的毒素抗性帶來了環境友好的修複可能性:毛黴EH5對藍藻毒素的生長響應和生物吸附潛力的研究。國際水與汙水處理雜誌1 (1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381- 5299.101

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出版的曆史:

  • 收到日期:2015年4月10

  • 接受日期:2015年5月07

  • 發表日期:2015年5月11日