硒與六價鉻複合對活性汙泥細菌毒性劑量的研究

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研究文章

Sepideh Sadeghi^＊蘇澤特Burckhard克裏斯托弗Schmit貝弗利克萊因

美國南達科他州立大學土木與環境工程係

*通訊作者:美國南達科他州立大學土木與環境工程係電子郵件:sepideh.sadeghi@sdstate.edu

摘要

結合硒(Se)和六價鉻(Cr)的毒性作用^{6 +})，通過呼吸抑製試驗研究了來自當地汙水處理設施的活性汙泥中的鹽。結果表明，當Se濃度大於500 mg /L時，硒具有抑製作用^{6 +}Cr濃度大於0.05 mg時，可抑製乙酸的生物降解^{6 +}/ L。研究了硒與鉻的複合效應^{6 +}在活性汙泥上還發現對乙酸酯的生物降解有抑製作用;在500 mg Se/L和0.05 mg Cr的組合下，可抑製20%的生物量呼吸^{6 +}/ L。而在50 mg Se/L + 0.05 mg Cr的條件下，其除乙酸性能可提高10%^{6 +}/ L。利用生態板研究了重金屬對活性汙泥中微生物群落代謝活性的影響^TM．結果表明，鉻的存在^{6 +}與硒的存在相比，增加了活性汙泥的代謝活性馴化時間。不添加重金屬的活性汙泥和添加鉻的活性汙泥的功能多樣性最高，最低^{6 +},分別。

關鍵字

呼吸運動計量法;乙酸降解;重金屬組合效應;EcoPlates^TM

簡介

生物處理方法是世界範圍內汙水處理的基礎。由於影響處理過程的參數數量眾多，處理過程的控製非常複雜。根據重金屬濃度的不同，廢水中的重金屬在生化反應中可能具有刺激性、抑製性甚至毒性[1-3]。Cu、Zn、Pb、Ni和Co是一些生物所需要的低量(µg/L)的酶活性輔因子。然而，已知重金屬離子濃度達到mg/L水平對大多數生物[4]是有毒的。毒性可歸因於重金屬與酶和微生物[5]的化學結合，導致酶結構和活性的破壞[6,7]。酶活性的變化可以指示細菌群落中發生的變化[8]。重金屬還可以在相對高濃度下形成未定義的化合物，導致細胞毒性效應[9]，可以改變活性汙泥的生物化學和分解有機物的性能。

重金屬，如硒，可以存在於自然環境中。富含硒的土壤在世界上許多地方都很常見，包括北美、加拿大西部、中國、瑞典、意大利、芬蘭和愛爾蘭[10]。據報道，中國大山地區的硒濃度在0.31 - 7.65 μ g/kg(幹重)[11]之間。Lévesque發現硒濃度在0.073 ~ 2.090 mg/kg[12]之間。據報道，美國南達科他州西部土壤中硒的濃度相對較高[10,13,14]。南達科他州土壤中硒的濃度範圍從低於檢測極限到12.6 mg/kg，在25.4 cm深處平均約為6 - 7 mg/kg，在一些0-5 cm深的南達科他州土壤中平均為7.5 mg/kg。原生土壤中硒濃度較高的一個後果是，由於自然和人類活動，它們在水中，特別是地下水[15]和徑流中普遍存在。在受采礦活動和油氣開發徑流影響的地區，魚類和動物中發現了硒。

硒在原生物種中高度溶於水;硒酸鹽(搜索引擎優化₄^{2 -})，這是易於移動和生物可利用的微生物，亞硒酸鹽(SeO_3.^{2 -})，其移動性和生物有效性較低[10]。硒可以從灌溉和雨水徑流轉移到地表水、地下水和汙水係統[10,17,18]。此外，雨水徑流中高濃度的硒酸鹽很容易為汙水係統中的微生物提供生物可利用性。此外，廢水處理係統經常同時接收一種以上的金屬。六價鉻是一種有毒重金屬，來自於各種工業活動，如電鍍設施、發電廠、采礦、電氣設備製造、皮革和木材工業、表麵處理或化肥生產[20,21]，隨後可釋放到汙水係統，流向城市汙水處理廠。鉻的濃度^{6 +}根據工業活動的不同，廢水中的氯化物含量差異顯著(從50到700 mg/L)，據報道，一些工業區的地表水和地下水中的氯化物含量在0.033-5.25 mg/L之間。然而，Cr^{6 +}由於工業廢水將被生活廢水稀釋，因此預計工業廢水的排放量將大大降低。

一些研究探討了重金屬對城市汙水處理廠活性汙泥的毒性影響[4,19,23- 25]。Tyupa DV等人[19]報道了廢水處理廠活性汙泥中1,50,300和600 μ g/L的銀的致死劑量，以及120,1500和1000 mg/L的鈾的致死劑量。劉剛、王傑研究了納米銅和納米鎂顆粒對活性汙泥的影響。結果表明，銅對內源性呼吸和BOD生物降解的最大抑製濃度分別為19和5.5 mg/L。根據Vaiopoulou和Gikas[25]的說法，許多報告支持Cr^{6 +}在濃度高於5 mg/L時，對活性汙泥有毒，而其他研究報告在濃度高達25 mg/L時，對生長有刺激作用。然而，所有的報道都認為Cr^{6 +}是活性汙泥生長抑製劑，當濃度較高時，80mg Cr^{6 +}每升被確定為致命劑量

已經提出了許多方法來測量微生物係統[26]中的金屬毒性。對好氧微生物最常見的方法是測量微生物呼吸速率[25,27]。呼吸是好氧細菌的基本活動，呼吸測定法用於測定廢水對活性汙泥中細菌種群的毒性。在呼吸測定試驗中，有毒化合物會導致活性汙泥微生物的呼吸速率降低。細菌呼吸速率通常由呼吸計[4]中的耗氧量來測量。此外，重金屬[28]的存在可能影響活性汙泥微生物群落和代謝。有一些方法可以檢測混合菌群。細菌可以通過顯微鏡、DNA技術、培養和化學測試進行檢查。EcoPlates^TM設計用於微生物群落分析，而不具體識別特定的細菌種類。EcoPlates^TM有95個單獨的碳源加上96孔板上的水控製，允許快速測定細菌種群的代謝能力，無需耗時的試劑製備。它們易於使用，並能在相對較短的時間內提供接觸有毒化合物的細菌群落的有益信息[8,29]。

由於自然和越來越多的人類活動，如采礦和油氣開發，土壤中硒的大量含量導致地表水中硒的水平升高，這表明有必要研究硒對好氧活性汙泥細菌的有害劑量。此外，由於廢水處理係統經常同時接收一種以上的金屬，硒與工業廢水中發現的另一種重金屬鉻的協同效應^{6 +}也在本研究中進行了檢驗。此外，在最近的研究中，很少有關於重金屬存在下細菌種群的結構和功能的記錄。因此，目前的工作是研究硒和鉻的單獨和綜合效應^{6 +}微生物群落的功能和結構。

材料與方法

活性汙泥樣品和實驗材料

本研究使用的生物質來自當地汙水處理設施的活性汙泥曝氣池。以化學需氧量(COD)衡量，該設施的混液活性汙泥平均值為2000 mg/L，其中混液懸浮固體(MLSS)為1866 mg/L，混液揮發懸浮固體(MLVSS)為1400 mg/L。活性汙泥的特性如表1所示。四個解決方案;根據[30]在實驗室中製備了兩種礦物基礎溶液、一種營養液和一種緩衝溶液，以支持好氧呼吸測定試驗中的生物量增長。這些解決方案確保生物質能夠充分消耗基質而不缺乏礦物質。緩衝溶液中含有30% (w/v)氫氧化鉀(KOH;純度為85.8%)，並應用於每個瓶子，以去除頂空的二氧化碳，以確保100%的氧氣由呼吸計測量。醋酸鈉(C2 H3 O2 Na;純度為99%)的費雪科學公司(Fairlawn, NJ)用於本研究的底物。 Sodium selenate (Na2 O4 Se; 98% purity) obtained from Acros Organics and liquid hexavalent chromium (Cr^{6 +}從Ricca化學公司(Arlington, TX)獲得的)被作為重金屬添加到測試中。所有原料原液都是通過將所需數量的相應鹽溶解到蒸餾水中製備的。EcoPlates^TM樣本來自BIOLOG公司(Hayward, CA)，用於評估微生物群落結構和反應。

	汙泥
	液相	固相
pH值	8	-
(毫克/升)	6	-
溫度	16°C	-
Cr^{6 +}	NA	幹重34毫克/公斤
Se	0.24毫克/升	44毫克/公斤幹重
鱈魚	2000毫克/升	-
美國職業足球大聯盟	1866毫克/升	-
MLVSS	1400毫克/升	-

表1:活性汙泥表征

設備

本研究采用PF-8000型脈衝流量呼吸計。該儀器是專門設計來測量需氧呼吸測量的攝氧量，以及厭氧和缺氧生物反應的產氣量。該儀器是一個8位PF-8000呼吸計。呼吸計與一台使用呼吸計軟件的筆記本電腦、壓力調節器模塊(PR-5010型號)、呼吸計控製模塊、水浴冷卻器、攪拌底座、培養箱、容器、注射器和氧氣罐相關聯。使用BioLog MicroStation微板閱讀器測量EcoPlates^TM．

實驗的程序

活性汙泥(AS)是從當地汙水處理廠曝氣池中收集的。試驗在50分鍾的保持時間內開始，就在汙泥被帶到實驗室後，以保持汙泥的特性。回到實驗室後，所有的呼吸測量設備都接通了電源。水浴冷卻裝置設置為室溫20±0.1°C，並在測試開始前約30分鍾打開，使水穩定到規定的溫度。同時，將活性汙泥樣品與空氣一起起泡30分鍾，以去除任何剩餘的可溶性底物。根據[30]中使用的計算，在8個瓶子中分別添加了2.13、8.52和0.71 mL/L的每種礦物堿I和II、緩衝液和營養堿。活性汙泥樣品在倒入瓶子之前要搖勻，以保持混合均勻。通過使用塑料圓筒和漏鬥，將500毫升的這種汙泥混合物添加到500毫升的瓶子中。在每個二氧化碳吸附管中，加入5 mL 30% (W/V) KOH，然後將管放入瓶中。每1分鍾記錄一次攝氧量。 After a few hours, the oxygen uptake rate became constant (endogenous respiration was reached), 210 mg acetate (based on the calculation used in [31]) along with the different concentrations of heavy metals (0.05-50 mg/L Cr^{6 +}硒500 ~ 20,000 mg/L)。在本研究中，較高濃度的硒僅用於研究活性汙泥微生物中毒硒的劑量範圍，而不一定用於模擬城市汙水係統中的硒水平。然後生物質利用基質消耗氧氣。當底物全部被生物量消耗殆盡時，吸氧達到最大值，內源衰減呼吸速率恢複。在每組測試中，有一個空白來測量內源性衰變的本底耗氧量。待基質利用完成，氧氣利用率恢複到背景水平後，停止測試並分析數據。收集每個瓶中的上清液，使用ICP光學發射光譜儀(Varian 720-ES，澳大利亞)測量所選重金屬。

的EcoPlates^TM試驗有96孔細胞培養板，包含31個重要的碳源，與對照[29]重複三次。新收集的批試驗汙泥經離心、漂洗、重懸於0.85% (w/v) NaCl(采用[28]法)，稀釋10倍後接種於孔中。在環境溫度(20℃)下培養板，接種後24 - 72小時用微孔板閱讀器讀取。

分析方法

在本研究中，每個批抑製實驗至少重複三次。三大主要參數;采用水與廢水檢驗標準方法[32]，分別按5220 C法、2540D法、2540 E法測定每一種新汙泥的活性汙泥COD、MLSS和MLVSS。鉻、硒殘留量的測定依據EPA 200.7和3015方法[33]。EcoPlates^TM數據分析由[29]定義。

結果與討論

細胞耗氧量是生物量活性和汙染物生物降解的指標，呼吸計是測量生物基質生物降解耗氧量[30]的設備。硒、鉻^{6 +}並在不同濃度下對它們的組合進行測試，確定它們對活性汙泥去除乙酸的抑製和致死作用。圖1顯示了在對兩種被測金屬及其組合進行呼吸測定試驗時觀察到的抑製剖麵。

圖1:活性汙泥暴露於a)硒b)鉻的呼吸譜^{6 +}c) 3 Se/ Cr的結合^{6 +}．

在加入醋酸鈉原液~180分鍾前，由於生物處於內源性呼吸，所有耗氧量曲線幾乎重合。添加乙酸鈉後，僅以乙酸為飼料的反應器(圖1 a,b,c)由於乙酸的生物降解，耗氧量明顯增加。氧的吸收速率為0.2±0.02 mg O₂/mg COD-h用於去除乙酸酯。500 mg/L Se對醋酸酯降解沒有明顯的抑製作用(圖1a)，而2000 mg/L Se對氧吸收速率為0.13±0.02 mg O的乙酸酯降解速率有抑製作用₂/h(35%呼吸抑製)。將硒濃度增加到20,000 mg/L，測定硒對細菌的致死作用。這種濃度導致了細菌死亡率和耗氧量的降低，導致的速率低於空白試驗(僅內源性呼吸)。活性汙泥對高濃度硒的抗藥性的一個原因可以通過活性汙泥中硒種類的微生物減少來確定。兩種氧陰離子:硒酸鹽(SeO₄^{2 -})和亞硒酸鹽(SeO_3.^{2 -})被還原為硒化物(Se^{2 -})，其毒性比SeO小₄^{2 -}和搜索引擎優化_3.^{2 -}對微生物細胞。在過量有效硒存在的情況下，細胞也開始將硒而不是S合並到通常含有S[34]的細胞成分中。

如圖1b所示，0.05 mg/L Cr不抑製乙酸的去除^{6 +}，而1 mg/L Cr^{6 +}以0.15±0.02 mg O抑製乙酸酯的去除₂/h(25%呼吸抑製)，作為Cr^{6 +}濃度增加到50 mg/L時，耗氧量降低到低於空白試驗的速率。根據實驗結果，Cr^{6 +}與Se (20,000 mg/L)相比，其毒性發生在較低的濃度(50 mg/L)。Hartmann S等[4]報告了與Cr相似的結果^{6 +}是好氧活性汙泥中毒性最大的重金屬之一，當濃度超過10 mg/L時，呼吸抑製率高達52%。鉻的其他研究^{6 +}對活性汙泥的影響報告了相互矛盾的結果。有人提到，鉻處理能抑製活性汙泥的生長^{6 +}濃度超過5 mg/L，而其他的報告生長抑製濃度超過25 mg/L。然而，所有研究者都認為Cr^{6 +}在較高濃度下絕對是活性汙泥生長抑製劑[4,19,24,35]。

根據實驗結果，Se和Cr^{6 +}分別為500 mg/L和0.05 mg/L時，對乙酸的去除無抑製作用。以確定非抑製性劑量的硒和鉻的組合是否^{6 +}在生物降解過程中會對活性汙泥的性能產生不利影響，試驗采用500 mg/L活性汙泥和較低濃度(50 mg/L)的Se與0.05 mg/L的Cr^{6 +}．圖1c顯示，500 mg/L Se，與0.05 mg/L Cr^{6 +}，抑製生物量呼吸速率為0.16±0.02 mg O₂/h(20%呼吸抑製)。這可以歸結為Se和Cr的組合效應^{6 +}活性汙泥對醋酸酯生物降解性能的研究。然而，生物量去除乙酸酯的性能提高了10%(0.22±0.02 mg O₂50mg /L Se配0.05 mg/L Cr+6。根據這一結果，硒促進了生物量的增長。較低的Se濃度(50 mg/L)與0.05 mg/L Cr+6相結合可獲得較高的生物量增長。人們對多種金屬對微生物的影響知之甚少。Chu kw和Chow KL認為，[36]金屬的共價指數和離子指數解釋了金屬之間的相互作用。結果表明，共價指數高的金屬往往具有協同作用，而共價指數低的金屬往往能中和其他共價指數低的金屬的毒性作用。[37]之前沒有明確的Se和Cr離子和共價指標，因此無法與我們的實驗結果相驗證，因此需要進一步研究Se和Cr之間存在的協同作用機製。

其他研究顯示了金屬之間的協同效應。Dilek FB等[23]研究了Ni和Cr的聯合效應^{6 +}活性汙泥法在去除COD方麵的研究。根據他們的結果，Ni和Cr的結合^{6 +}，對活性汙泥的COD去除率影響不大。根據Dawson PS和Jenkins SH[38]的研究，Ni和Cu的組合在呼吸學研究中抑製氧化。Mn與Cd或Zn的配對具有協同作用，而氰化物與Cu或Ni或Cu與Fe或Cr的配對沒有觀察到協同作用。Chu和Chow[36]在Cr、Cd和Cu的配對試驗中報告了協同作用。他們發現，當金屬混合時，死亡率會增加。他們認為，由於每種金屬的少量混合會產生嚴重的致命影響，環境樣品中潛在的金屬相互作用不應被忽視。Barth EF等人[39]也研究了四種金屬的組合效應。他們發現，總濃度為8.9 mg/L的四種金屬(Cu, Cr, Ni和Zn)對中試規模活性汙泥裝置的整體效率沒有不良影響。

EcoPlates^TM結果

使用EcoPlates研究了活性汙泥中存在重金屬時微生物群落的變化^TM．EcoPlates^TM不同的活性汙泥樣品[8]，其顏色發展規律與培養時間基本一致。EcoPlates的研究結果^TM如圖2所示，潛伏期為35小時。僅加醋酸鹽、加醋酸鹽和硒(2000 mg/L)的活性汙泥微生物群落比加醋酸鹽和鉻的活性汙泥微生物群落發育快^{6 +}(1 mg/L)，金屬組合為500 mg/L Se和0.05 mg/L Cr^{6 +}當比較時，更多的井顯示出顏色發展。Gryta A等人[8]報道了重金屬汙染汙泥的類似結果。他們發現，未受重金屬汙染的廢活性汙泥具有更強的代謝活性來利用生態板上的碳基質^TM．

圖2:a)加醋酸鹽的AS, b)加醋酸鹽和硒的AS, c)加醋酸鹽和鉻的AS, d)加醋酸鹽和金屬結合的AS在35 h內(金屬濃度:Se: 2000 mg/L, Cr^{6 +}:1 mg/L, Se/Cr^{6 +}: 500/0.05 mg/L)。

結果表明，僅添加醋酸鹽和添加2000 mg/L Se的活性汙泥代謝活性最高，分別能代謝31種底物中的25種和24種，而添加醋酸鹽和1 mg/L Cr的活性汙泥代謝活性最高^{6 +}在31個底物中隻有18個代謝，而在31個底物中有22個代謝了乙酸鹽和複合金屬。隻飼喂醋酸鹽的AS群落能夠利用最多的底物;然而，有6種底物的利用率低於大多數其他底物(i-赤蘚糖醇、l -苯丙氨酸、2-羥基苯甲酸、l -蘇氨酸、衣康酸和α-酮丁酸)。添加醋酸鹽和鉻的砷對所有碳源的利用率最低^{6 +}其中不能利用L-精氨酸、D-木糖、丙酮酸甲酯、i-赤糖醇、2-羥基苯甲酸、L-苯丙氨酸、α-環糊精、L-蘇氨酸、D-氨基葡糖酸、衣康酸、α-酮丁酸、苯乙胺和D,L-α -甘油磷酸。這些結果表明鉻對細菌的影響，導致微生物活性和底物利用多樣性的惡化，可能是由於分解代謝功能[8]的降低。未被氧化的5種底物為赤蘚糖醇、2-羥基苯甲酸、l -苯丙氨酸、衣康酸、α -酮丁酸。

僅用醋酸鹽、醋酸鹽和硒、醋酸鹽和鉻飼喂活性汙泥的樣品中所使用底物的總數、功能多樣性的百分比和結果的變化百分比^{6 +}醋酸鹽與兩種金屬的結合見表2。活性汙泥中未添加抑製性金屬的活性汙泥具有最高的功能多樣性，表明活性汙泥具有較高的物種多樣性。添加鉻的活性汙泥功能多樣性最低^{6 +}因為它的毒性。無抑製性金屬的活性汙泥和添加硒的AS在生態板上的變異比例不高^TM然而，AS用Cr喂養^{6 +}用混合的金屬喂養有很大比例的變化。

	加醋酸鹽的AS	用醋酸鹽和硒喂養AS	用醋酸鹽和鉻喂養AS^{6 +}	用醋酸鹽和金屬組合喂養AS
所使用的基板總數	25	24	18	22
%功能多樣性	80.6%	74.2%	61.3%	74.2%
樣本內結果的%變化	3.2%	6.45%	35.5%	22.6%

表2:EcoPlates^TM計算。(金屬濃度:Se: 2000 mg/L, Cr^{6 +}: 1 mg/L, Se/Cr^{6 +}: 500/0.05 mg/L)。

Cr^{6 +}上清殘留

表3報告了呼吸計上清中的六價鉻殘留濃度。Cr^{6 +}當活性汙泥中隻添加乙酸鹽時，上清液中的殘留比空白液減少89%。然而,Cr^{6 +}通過增加初始Cr，使上清液中的殘留從0.013 mg/L增加到大於5 mg/L^{6 +}濃度為0.05 ~ 50 mg/L。硒和鉻的結合^{6 +}結果表明，當初始Se濃度從50 mg/L增加到500 mg/L時，Cr^{6 +}上清中的殘留量略有減少。增加Se濃度可能會促進鉻的析出。然而，還需要進一步研究汙泥沉積物中金屬的命運。活性汙泥中六價鉻的去除可能有兩種機製;鉻在活性汙泥中的還原和積累以及在[40]細胞上的吸附。與鉻的去除相關的機製是鉻的還原^{6 +}對Cr^{3 +}．Cr^{3 +}然後沉澱為Cr(OH)_3.並在活性汙泥中積累[27,41]。Stasinakis AS, et al.[27]報道了Cr^{3 +}對Cr^{6 +}太慢了，Cr^{3 +}在被氧化前可能被吸附在固體上。這種吸附機製可能與MLSS含量有關，因為較高的MLSS濃度允許更多的吸附位點用於金屬吸收，並且可以通過在胞外聚合物或細胞質和細胞壁上吸附來實現更高的鉻去除[27,40]。

樣本類型	Cr^{6 +}剩餘(毫克/升)
空白	0.009
隻有乙酸	0.001
Cr^{6 +}0.05毫克/升	0.013
Cr^{6 +}0.1毫克/升	0.020
Cr^{6 +}1毫克/升	0.035
Cr^{6 +}5毫克/升	2.269
Cr^{6 +}10毫克/升	4.746
Cr^{6 +}50毫克/升	＞5
Se / Cr^{6 +}: 50/0.05 mg/L	0.015
Se / Cr^{6 +}: 100/0.05 mg/L	0.011
Se / Cr^{6 +}: 200/0.05 mg/L	0.010
Se / Cr^{6 +}: 500/0.05 mg/L	0.010

表3:上清液中六價鉻殘留。

結論

據報道，在南達科他州西部、中國和加拿大的土壤中發現了大量的硒，這表明硒有可能進入地表水、地下水甚至汙水係統。此外，由於汙水處理廠經常同時接收一種以上的金屬，本文測定了硒和鉻的毒性劑量^{6 +}單獨和一起對活性汙泥細菌種群的影響。結果表明，本研究中毒性最大的重金屬是鉻^{6 +}．六價鉻在劑量為1 mg/L時對乙酸的生物降解有抑製作用(25%)，在劑量為50 mg/L時是有毒的。硒對醋酸酯的生物降解也有抑製作用，當硒濃度為2000 mg/L時，對呼吸有35%的抑製作用。然而，硒的毒性在2萬mg/L的濃度要高得多。硒和鉻的結合^{6 +}分別在500 mg/L和0.05 mg/L濃度下對呼吸有抑製作用。

EcoPlates的結果^TM結果表明，僅飼喂乙酸鹽的AS代謝活性最高，飼喂乙酸鹽和硒的AS代謝活性最高^{6 +}導致底物微生物活性和多樣性下降。未來的研究需要確定哪些細菌受到重金屬毒性的影響。此外，從結果來看，Se可以增強Cr^{6 +}活性汙泥的沉澱。總的來說，本研究的結果可以為世界上原生土壤中重金屬背景水平較高的地區的廢水處理係統中存在重金屬的微生物提供有益的信息。

鳴謝

本材料基於國家科學基金會(NSF)資助號NSF 1642037的工作。本材料中表達的任何意見、發現和結論或建議都是作者的觀點，並不一定反映美國國家科學基金會或作者所屬的學院和大學的觀點。作者也要感謝WEERC實驗室和土木與環境工程師。南達科他州立大學係主任。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Sadeghi S, Burckhard S, Schmit C, Klein B(2019)硒和六價鉻組合對活性汙泥細菌的毒性劑量研究。國際J水廢水處理5(1):dx.doi.org/10.16966/2381-5299.161

出版的曆史:

收到日期:2019年5月8日

接受日期:2019年8月22日

發表日期:2019年8月28日