摘要

在2021年11月至12月期間，對NCBI SARS-CoV-2數據庫進行了分析，以破譯塔狀冠狀病毒變體在美國的傳播情況，並與最近起源於南非的高傳染性新歐米克隆變體進行了比較。目前，B.1.617.2和AY.103係Delta突變株穗蛋白L452R、T478K、P681R突變和F157/R158兩種氨基酸缺失在美國占主導地位，取代了B.1.1.7 Alpha突變株H69、V70和Y145氨基酸缺失以及N501Y和D614G高傳播突變株的致命疫情。有趣的是，omicron變體有6個H69、V70、V143、Y144、Y145、L212免疫逃逸缺失和29個穗蛋白突變，包括最致命的N501Y (omicron為Y498)和D614G (omicron為G611)。這表明該突變體是由B.1.1.7與AY組合而來。X和B.1.617.2血統。在刺突蛋白215位置檢測到一個獨特的3個氨基酸(EPE)插入，以補償6個缺失，提示進一步的重組事件。3個絲氨酸殘基在ommicron病毒RBD結構域的371 (S=L, ommicron的L368)、373 (S=P, P370)、375 (S=F, F372)位點發生突變，但在446 (G=S, S443)和496 (G=S, S493)位點發生補償。n蛋白30位的三個氨基酸(ERS)缺失是歐米克隆病毒的另一個特征。Omicron變體在編碼ORF1ab多蛋白的基因組2/3 - 5 '端突變較少，但在RNA依賴的RNA聚合酶中P4715L突變占主導。武漢病毒和小粒冠狀病毒的刺突蛋白在疏水圖上有一定差異，但總體氨基酸組成、脂肪化指數和不穩定性指數基本不變。BLAST檢索發現，ommicron病毒刺突蛋白的高變量22957-22977nt區(由488-493個氨基酸組成，NH2-PLRSYS-CO2H)與ch-2的完美匹配分別為20nt和19ntSeladonia tumulorum或者ch-16Steromphala瓜葉菊分別。從穗狀基因RBD結構域設計的引物在BLAST搜索中不能檢測到基因組，但從基因組恒定區域設計的引物效果良好。這種刺突蛋白的高度變異表明，使用冠狀病毒刺突基因的DNA疫苗或mRNA疫苗可能不能有效地保護歐米克隆病毒感染，減毒的全冠狀病毒疫苗將是更安全的疫苗。

關鍵字

NCBI SARS CoV-2數據庫;冠狀病毒的特征;高可變刺突蛋白;rt - pcr診斷;疫苗失敗;抗體抵抗

簡介

自2019年12月以來，武漢冠狀病毒(嚴重急性呼吸綜合征病毒或SARS-CoV-2)已在全球造成58萬人死亡，數千個突變產生了許多主要形式，如α、δ、δ +和最近的omicron。冠狀病毒是一種具有29,980個核苷酸長的基因組的大型陽性RNA病毒，COVID-19與CoV-229E、CoV-HKU1、CoV-OC43、CoV-NL63、SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)等6種不同的冠狀病毒相關[1-5]。它有結構蛋白(S, M, N, E)在3 '端和5 '兩個非常大的多聚蛋白(基因組的2/3)降解為16個非結構蛋白(nsp1-16)，包括RNA依賴的RNA聚合酶(nsp12)[6]，兩個蛋白酶(nsp3和nsp5) [7,8]， RNA拓撲異構酶(nsp2) [9]， RNA解旋酶(nsp13)[10]，核酸酶(nsp15)[11]和甲基轉移酶(nsp16)[12](圖1A)。刺突蛋白(1273 aa)是一種三聚體1類跨膜糖蛋白，其RBD結構域(335-515 aa)作為受體結合域與宿主細胞的ACE-2受體結合，用於病毒進入[13](圖1B)。S蛋白1- 13aa作為信號肽，S1亞基為14-685 AA，包含RBD結構域，S2亞基為686 - 1273個氨基酸，融合接觸肽(788-806 AA)和兩個在1163和1213位[14]的七肽(HPPHCPC)重複。在其他結構蛋白中，n蛋白(419aa)與複製冠狀病毒的前體RNA結合，並調節宿主-病原相互作用。

圖1:人類冠狀病毒(SARS CoV-2或COVID-19)的結構。

圖1 b:歐米克隆冠狀病毒刺突蛋白的一級氨基酸序列。兩個刪除點用Del-1和Del-2箭頭表示，插入點用Ins-1和星號表示。紅色表示突變氨基酸，下劃線表示增強病毒傳播的特征突變(圖中為G611和Y498)。

圖1 c:在NCBI SARS CoV-2數據庫中對200-500個序列進行多重比對，顯示灰色間隙(箭頭)為不完整序列，重紅色線為21000-25000nt之間的刺突蛋白突變(藍框)，作為小粒冠狀病毒的特征。該特征對200-500個序列的比對數據庫中檢索小粒序列具有重要意義。否則就很難找到歐米克隆序列。有趣的是，由於突變，在刺突蛋白的RBD結構域(313-393 aa/ 303-393 aa/ 425-439 aa)上沉積了許多不完整的omicron序列。

嚴重的COVID-19在年齡在70歲之間的成年人中更常見，並伴有糖尿病、心血管疾病和慢性呼吸係統疾病等並發症。觀察到各國的病死率不同，可能是由於不同的人口構成和不同國家為阻止[15]病毒傳播而采取的控製措施類型不同。根據2020年的數據庫，SARS-CoV-2主要分為三個分支，分別為支序G(刺刺蛋白S- d614g的變體)、支序V (ORF3a編碼蛋白NS3-G251V的變體)、支序GR (S- d614g + N-G204R)和支序S(變體ORF8-L84S)[16,17]。2020年底，SARS-CoV-2變種出現了很多倍，世衛組織報告了至少三種令人擔憂的變種(B.1.1.7、B.1.351和P1)。變種B1.1.1.7在2020年8月至2021年3月期間在印度、英國和美國造成了嚴重災難。在2021年3月至12月期間，Delta和Deltaplus變體特別是AY.103和B.1.617.2造成了大量死亡。與D614G突變體相比，Delta突變體能夠更快地與宿主肺細胞ACE-2受體融合，這表明Delta突變體比B.1.1.7譜係具有更強的致病性。β B.1.351、Gamma P.1、Epsilon B.1.427、Iota B.1.526、Mu B.1.621和Zeta P.2變種冠狀病毒在不同人口統計學中也存在一定的相關性。然而，最近omicron變種在南非高度傳播，並已經在包括歐洲、美國、澳大利亞和印度在內的90個國家被檢測到。它有30個高可變的尖峰突變，有重要的刪除和插入。 Thus, more complete sequences needed to define specific geographic distributions of omicron virus variant. Most importantly, clinical and political strategies at the local level must be augmented because spike gene DNA and mRNA vaccines may not work well for hyper-variable spike gene of omicron corona virus.

目前，至少有10種候選疫苗接種了70%的世界人口。疫苗通常是從冠狀病毒中提取的蛋白質或合成肽，可以激發體液抗體(IgG)以及t細胞介導的摧毀病毒的能力。減毒或滅活的冠狀病毒(Covaxin, Bharat Biotech, India)也像痘疫苗一樣使用。隨著細胞中的遺傳信息從DNA到RNA再到蛋白質的過程，科學家們開發出了保護冠狀病毒的DNA疫苗和RNA疫苗。印度血清研究所使用滅活病毒，而俄羅斯使用mRNA疫苗(Sputnik V)，英國(牛津+阿斯利康)使用S基因DNA疫苗使用腺病毒載體(Ad5或Ad26)。美國(Moderna/輝瑞)和德國BioNTech使用S基因mRNA疫苗[19]。大多數公司使用的是冠狀病毒的受體蛋白刺突蛋白(S基因)，它與人和動物肺細胞的ACE-2受體結合。

突變極大地影響了病毒傳播的增加方式，如D614G和N501Y突變[16]。此外，據報道，在α冠病毒(B.1.1.7)[20]中69、70和145個氨基酸缺失的情況下，疫苗效用(對病毒的保護)隨著免疫逃逸(T細胞免疫)而下降。此外，病毒RBD的L452R、E484K等突變大大降低了早期冠狀病毒患者血清抗體對突變病毒[21]的中和效果。目前，在AY中缺失F157和R158。X和B.1.1.617.2 Delta變異在D614G突變存在時傳播增加，進一步降低了疫苗的效力。最近，有一種獨特的omicron病毒新突變被發現降低了疫苗的效用並增加了傳播率，但證實的免疫學數據尚未得到報道[22-24]。我們將通過分析美國NCBI病毒數據庫20年之間的病毒，專門研究歐米克隆病毒在美國的傳播^th十一月至二十五日^th2021年12月，在網上使用不同的免費軟件。

方法

數據庫分析

我們隻使用了NCBI (www.ncbi.nlm.gov) SARS-CoV-2數據庫，因為它提供了多達500個序列的多對齊數據。這種比對檢測到大多數序列是不完整的，並分別進行分析。但是中間完整的序列通過尋找突變和主要是AY的紅線來檢查相比較的序列。變種冠狀病毒。歐米克隆病毒在21000-28000nt之間有很多高可變刺突蛋白和其他結構蛋白的紅線(圖1C)。因此，我們覆蓋了大量的病毒序列到少量的病毒序列，這有助於使用免費的Multalin軟件和CLUSTAL-Omega軟件進行分析。用Multalin軟件進行刺突蛋白(1273 aa)比對需要2-3分鍾，而CLUSTAL Omega軟件30kb RNA基因組比對需要30-40分鍾。我們發現大多數序列都是AY。X Delta型(~85%)和部分Delta B.1.1.617.2型(~10%)。我們隻記錄了存於23^{理查德·道金斯}11月及24日^th2021年12月。用NCBI數據庫中序列沉積日期、作者姓名和病毒收集日期對序列集進行分析。雖然我們首先在這樣的搜索中檢測到一個小微粒冠狀病毒序列。然後，我們BLAST分析了高可變區(60 nt)，得到了更多的三個omicron序列，但其中一個來自美國的序列有不完整的穗狀蛋白，兩個來自加拿大和比利時的完整序列。但是從12月6日開始，在數據庫中檢測到的omicron病毒越來越多。我們的猜想測序引物用於武漢，阿爾法和德爾塔變種沒有很好地使用標準試劑盒。但隨後會有越來越多的ommicron病毒完整序列被沉積。我們無法訪問GISAIP數據庫，第一個omicron病毒基因組(29684 bp)的登錄號為EPI_ISL_6640916，收集日期為2011-11-2021，提交日期為23-11-2021。多配位的部分呈現出不同的ommicron特征。在論文的審核過程中，我們還分析了數據庫，大量的omicron序列保存在2021年12月的最後一周和2022年1月的第一周。

結果

7日首次檢測到冠狀病毒ommicron株(B.1.1.529或BA.1)^th通過分析存於6號的NCBI病毒數據庫^th2021年12月，來自奧地利的Puehringer等人(第1號加入)。OL721912;隔離日期1^聖2021年12月)。Bankers L等在美國的數據中未檢測到任何omicron變體，主要發現delta B.1.617.2和AY。X株(圖2)^th2021年12月，Howard D等人、Schmedes等人、Bankers L等人、Pachucki R等人、Buck GA等人、Pokharel A等人、Blankenship HM等人和Lighthouse Lab等人沉積的序列也沒有發現任何小粒。然後，我們計劃BLAST搜索60nt(22894 5’- AAC TGA AAT CTA TCA GGC CGG TAA CAA ACC TTG TAA TGG TGT TGC AGG TTT TAA TTG ta -3’22953)高可變區。本研究獲得了歐米克隆B.1.1.529冠狀病毒的3個高變尖蛋白，接入號為OL698718(美國，不完全S)、OL677199(加拿大)和OL672836(比利時)。我們展示了多比對數據，以顯示與最致命的B.1.1.7、AY.103和B.1.1617.2變種相比的突變和缺失(圖3A-3C)。結果表明，omicron突變體有6個H69、V70、E144、F145、R146和L212免疫逃逸缺失和29個刺突蛋白突變，包括最致命的D614G (omicron病毒中G611)和N501Y (omicron病毒中Y498)。其他突變分別為:A67V (V67)、T95I (I93)、N211I (I206)、L212V (V207)、V215P (P210)、R216E (E211)、G341D (D336)、S373L (L368)、S377F (F372)、K419N (N414)、N442K (K437)、G448S (S443)、S479N (N474)、E486A (A481)、Q495R (R490)、G498S (S493)、Q500R (R495)、Y507H (H502)、T549K (K544)、H657Y (Y652)、P683H (H678)、N766K (K761)、D798Y (Y793)、N858K (K853)、Q956H (H951)、N971K (K966)、L983F (F978) [omicron病毒位置的數值](圖1B和圖3b - 3c)。武漢病毒的刺突蛋白有1273個aa, B.1.1.7變異的刺突蛋白有1270個aa, B.1.1.617.2和AY。X變種有1271 aa, omicron變種有1270 aa。這些突變的作用還不清楚，需要更多的研究!在B.1.1.617.2變種中發現了P681R突變(此處披露了P683H)，但在歐米克隆病毒中未發現L452R突變。在215位插入EPE序列，就會發生取代。 Receptor Binding Domain (RBD) of Spike protein bound to its ACE-2 receptor of human lung cells needed for virus entry. Analysis of ORF1ab protein (7096 aa long) suggested that dominant P4715L mutation in the RNA-dependent RNA polymerase and further K564N, K856R, L2084I, A2710T and P3395H mutations were happened in ORF1ab protein of omicron virus. P4715L, as well as L2084I mutations were also detected in Delta variants. However, S2083 deletion in omicron could be critical but no data available. In Delta variants other important mutations like A1306S, P2046L, P2287S, T2836I, V2930L, G5063S, P5401, A6319V, and K6958R were noticed (see, accession no. OL721909) as compared to Wuhan virus of December, 2019 (data not shown).

圖2:2021年11月30日之前在美國檢測到的大多數冠狀病毒變種是AY。X Delta變種，取代了英國阿爾法B.1.1.7變種。

我們在圖3B和圖3C(綠色下劃線)中發現了少數富含疏水氨基酸(V, L, I, F)的刺突蛋白保守區，以解釋最近報道的武漢S基因疫苗具有中和歐米克隆病毒的潛力，但可能會降低效力(8倍)的觀點。因此，像印度製造的Covaxin這樣的減毒全病毒疫苗，在新的含有omicron基因組的S基因疫苗研製出來之前，可能對控製omicron冠狀病毒的傳播更加重要。

圖3:與α變種和δ變種相比，小微粒冠狀病毒刺突蛋白的缺失和插入。蛋白id UFP04971、UFO69279和UFT26501分別是來自加拿大、比利時和奧地利的omicron變體。蛋白ID UFT26468為B.1.617.2 Delta型，在世界範圍內高度活躍。

圖3 b:與α型和Delta型相比，Omicron型冠狀病毒穗蛋白RBD結構域的高可變區。373、375和377的三個絲氨酸殘基在突變體中發生改變，並被G448S和G498S突變所補償。綠色下劃線表示保守疏水區。

圖3 c:致命的冠狀病毒的普遍D614G突變(現在是100%)和新的H657Y, N681K和P683H突變的omicron變體。綠色下劃線表示保守疏水區。

我們繼續我們的分析，隨著更多新的omicron序列沉積。Lemieux JE等人和Howard D等人在2021年10月12日沉積的數據沒有產生任何omicron，而主要是AY。X和一些B.1.1.617.2變體。然而，Holland SL等人、Howard D等人和Pinet K等人在2021年11月12日沉積的數據在2021年11月24日至12月6日收集日期間產生了14個omicron變體。注冊編號為:OL815080/81 (USA, AZ)、OL815417 (USA, TX)、OL815350/51 (USA, MA)、OL815447/48 (USA, GA)、OL815449/50 (USA, NY)、OL8154/51/52/53 (USA, CA)和OL815455/56 (USA, MA)。多次對齊產生非常相似的結果，如圖4所示。C麵板數據沒有調整，由於Multalin軟件無法檢測L212的刪除，RE插入出現不是EPE。我們保留了這些數據，因為CLUSTALOmega蛋白多比對也沒有糾正我們通過DNA比對確認的數據，如圖5所示。

圖4:數據庫分析Omicron變種202111-12-12的沉積物，並與Delta和Alpha變種進行比較。部分主要差異顯示了Omicron的主要特征，在H69、V70、V143、Y144、Y145氨基酸位置缺失，而不像在Delta變體中發現的F167、R168氨基酸位置缺失。由於omicron與武漢病毒和Delta病毒之間的VR序列(綠色圓圈)相似，此處沒有對齊L212刪除，而基於冠狀病毒基因組對齊的RE插入將是EPE(見圖)。冠狀病毒患者樣本來自2021年11月24日至2021年12月5日期間來自美國(CA、MI、MA、GA、NY、AZ、AL、KS、CO、TX)的鼻拭子、口腔拭子、唾液和粘液。

圖5:對冠狀病毒基因組進行多重比對(30kb)，發現在刺突蛋白215位置插入三個氨基酸(EPE)後，缺失了一個氨基酸(L212)，以及H69、V70、G143、Y144、Y145缺失。這裏展示了一部分基因組。

Lemieux JE等人對日期為13-12-2021年的三個omicron分離株進行了數據分析，但均出現不完全序列(登錄號為OL823147和OL823148 (USA, MA)和OL822906 (USA, NY)。然而，同一天，Howard等人和Blankenship HM等人沉積了許多序列，其中沒有ommicron病毒，而主要是AY病毒。X和少量B.1.1.617.2。類似地，2021年12月16日保存的數據中也沒有omicron變體(Howard D等人，和Diagnostics G等人)，截止到2021年12月17日，隻選擇了兩個omicron(加入號OL890283 (Lemieux J等人)和OL901854 (linres - perdo DJ等人)。有趣的是，美國Lemieux JE等人在2021年12月18日沉積了24個ommicron病毒。入庫號為OL903123 (NH, 3-12-2021)、OL880661(MA, 3-12-2021)、OL902594 (CT, 4-12-2021)、OL903509(MA, 5-12-2021)、OL913145(RI, 6-12-2021)、OL904534(MA, 6-12-2021)、OL904790(MA, 6-12-2021)、OL904791(MA, 6-12-2021)、OL903931(VT, 8-12-2021)、OL904803(NH, 8-12-2021)、OL904422(MA, 8-12-2021)、OL904499(MA, 9-12-2021)和來自馬薩諸塞州的7個收集日期為2021年8月12日的omicron數據，以及入庫號OL903558、OL903553、OL903821、OL903690、OL903698、Ol903660，OL903604和三個來自紐約(加入號OL903848、OL903853、OL903850)，兩個來自羅德島(加入號OL903865、Ol903866)。同一天(18-12-2021)Nickerson DA等人(美國)沉積了4個添加號為1的omicron變體。OL903977(收集日期9-12-2021)和添加號OL903978/79/80(收集日期12-12-2021)。在AAs 303-393、313-393和425-439處發現了大部分不完整序列，這表明引物在初始測序過程中由於omicron病毒基因組的強烈變異而無法工作。用Multalin軟件分析這種不完全S蛋白，結果是omicron的獨特缺失和插入(數據未顯示)。

Howard D等人、Linares-Perdo J等人和Grimaldo V等人分析了2021年20日至12日沉積物的數據，主要出現AY。B.1.617.2。Parrott T等人對2021年12月21日的沉積物進行了數據分析，給出了4個omicron完整序列，登錄號為OL960535/36/37/38，收集日期為2021年12月8日。同一天，Graffin J等從美國Minnosota沉積了28個omicron序列，登錄號為OL964103、OL964105/06、OL964108/09、OL964111/12/13/14/15、OL964117/18、OL964120/21/22/23、OL964125、OL964127/28/29/30/31/32和OL964134/35/36/37/38。S蛋白是部分的，少數蛋白僅用於確認小粒特征(數據未顯示)。然而，Howard D等人、Blankenship HM等人、Pokhard A等人和Ritter J等人沉積的序列主要產生AY。X delta冠狀病毒(未顯示數據)。

Gohl DM等人、Banu LA等人、Irfan M等人、Beukelman R等人、Bankers L等人對2021年22月12日沉積的分析數據大多是不完整的，多對齊產生了一些錯誤的圖像，沒有解釋omicron序列。但是Lemieux JE等人在同一天沉積了6個omicron序列，登錄號為OL976589 (USA, MA)、OL976472 (USA, MA)、OL976989 (USA, ME)、OL976899 (USA, MA)、OL977025 (USA, VT)、OL977069 (USA, VT)]，收集日期為7-12-2021年至11-12-2021年。同樣，A代等人從加利福尼亞保存了少量完整的omicron序列，登錄號為OL977473(4-12-2021)、OL977502(13-12-2021)，以及一些不完整的omicron序列，登錄號為OL977503(13-12-2021)、OL977504(13-12-2021)和OL977661(14-12-2021)(數據未顯示)。

omicron序列由來自美國的Lemieux JE等人保存，注冊號為OL976589、OL976472、OL976899 (USA, MA)和OL977025、Ol977069 (USA, VT)和OL976989 (USA, ME)，注冊日期為2021年23月12日。Kandal S等人在23-12-2021年沉積了一個omicron序列，登記號為。Ol988626 (usa, ar;10-12-2021)。Howard D等人在同一天保存了許多收錄號為OL991113 (USA, OH)、OL991168 (USA, TX)、OL991171 (USA, WV)，收錄日期為1-12-2021和OL991968 (USA, MD)，收錄日期為7-12-2021的omicron序列和部分收錄號為7-12-2021的omicron序列。OL991968 (CA, 4-12-2021)(數據未顯示)。

我們分析的最後一天是2021年12月24日沉積序列。我們通過多重比對發現，Nickerson等人保存了許多來自華盛頓的omicron序列，登錄號為OM003743(19-12-2021)、OM003730(15-12- 20210、OMOM003721(17-12-2021)、OM003729/27/28/32(15-12-2021)、OM003707/14/26/34(13-12-2021)、OM003719/35/37(17-12-2021)、OM003711/17/23(13-12-2021)、OM003716(15-12-2021)和OM003744/41/42(19-12-2021)。我們還發現英國的Ryan KA保存了一個omicron序列，登錄號為OM003685(27-11-2021)。在2021年12月24日-12月24日，Howard D等人也存入了許多起源於紐約的omicron序列，注冊號為OM005692、OM005638、OM005669、OM007728、OM007698、OM007702、OM007701和OM007731(收集日期為7-8日)^th2021年12月)。他還保存了許多來自美國不同州的OM007718、OM007685(新澤西州，8-12-2021)、OM007637(馬裏蘭州，7-12-2021)、OM007625(賓夕法尼亞州，7-12-2021)、OM007696(哥倫比亞特區，8-12-2021)和OM007970(夏威夷，13-12-2021)(數據未顯示)。

對141個長度為1270 aa的疑似全+不全基因組序列進行了分析，得到21個全序列。多比對在omicron序列中產生3個突變(UHO53537中的D212Y, UHO53468/91中的R343K, UHO53648和UHO53131、UGO96815和UGO96803中的A698V)。所以，直到24^th2021年12月，數據庫(2021年12月6日至12月24日沉積的總序列為3,71,307個)完整+不完整序列的穿透率為0.0379%，完整序列的穿透率進一步降至0.0056%。這表明很難獲得完整和真實的歐米克隆病毒序列(圖6)。

圖6:截至2021年12月24日完整的歐米克隆冠狀病毒刺突蛋白序列。給出了2021年的蛋白id和收集日期，並與武漢、甲型和德爾塔冠狀病毒刺突蛋白進行了比較。部分比對顯示V143、Y144和Y145三個氨基酸缺失。

有趣的是，在聖誕節(2021年12月25日)，Howard D等人向NCBI病毒數據庫存入了216個歐米克隆病毒序列，表明歐米克隆病毒的巨大傳播可能與三角洲冠狀病毒的巨大傳播競爭。為了確認omicron病毒，我們從NCBI多對齊圖的不同部分選擇了一些序列進行分析(圖7)。

圖7:美國Howard D等在2021年12月25日沉積的omicron序列的數據分析。隻有三個序列(OM01136, OM010507, OM011026)是完整的，其餘的在刺突蛋白的三個氨基酸(EPE)插入有歧義。因此，盡管Howard D等人在2021年12月25日沉積了約216個歐米克隆病毒序列，但真正的歐米克隆冠狀病毒刺突蛋白序列仍然很難檢測到。

我們想了解更多的冠狀病毒的特征。我們發現S蛋白的糠氨酸裂解位點沒有變化(圖8)(Hoffmann, et al.， 2020)。當我們分析來自歐米克隆病毒的n蛋白序列時，我們在30號位置檢測到獨特的三氨基酸缺失(ERS)和圖9所示的多重比對數據。有趣的是，n蛋白有點突變，如P13L, R203K, G204R和部分D343G。同樣，在m蛋白中檢測到兩個額外的新突變(D3G, A63T)(圖10)，但在ORF3a蛋白中未檢測到突變(數據未顯示)。ommicron病毒小結構E蛋白(75aa)有一個突變(T9I;數據未顯示)。盡管如此，歐米克隆病毒的傳播正在90個國家迅速增加，在美國的一些州，這一數字約為10%，而在南非，這一數字目前為90%。因此，歐米克隆的傳播率在英國和德國有所增加，而在印度約有400名患者被檢測到。在英國和美國已經有死亡報告，盡管在無需氧氣支持和住院治療的地方，omicron病的毒性似乎較低。

圖8:多重比對顯示新冠病毒武漢變種、α、Delta和Omicron變種的穗蛋白糠氨酸裂解位點無突變。

圖9:n -蛋白(416aa)的三個氨基酸缺失是冠狀病毒變異的一個指標。對日期為2021年12月18日的數據進行了分析，並與其他舊變體進行了比較。檢測到P13L、R203K、G204R點突變。

圖10:不同變種冠狀病毒m蛋白的多重比對。檢測到Omicron突變體D3G和A63T突變。

令人驚訝的是，在2021年12月25日NCBI SARS-CoV-2數據庫中存入的巨大的omicron數據中，我們報道了超過216個omicron序列。但在2021年27日12日的分析中，我們沒有發現歐米克隆病毒的多對齊模式(圖1C)。最終，我們發現，由於從25-12-2021年以來的大量omicron序列沉積，在Delta變體中發現了重讀線(反轉)。然後我們BLAST搜索了刺突蛋白的60 nt高可變區(22894 5’- AAC TGA AAT CTA TCA GGC CGG TAA CAA ACC TTG TAA TGG TGT TGC AGG TTT TAA TTG TTA3’22953)，我們發現了3815個可能的基因組序列，而不是在08-12-2021 BLAST搜索中隻發現了4個(4)。這樣的數據令人震驚，從2021年12月的第二周起，冠狀病毒在美國明顯地大規模傳播。通過對2021年12月29日和2021年12月31日的分析，我們發現了一種混合趨勢，表明我們的方法仍然有效。在2021年12月底，omicron的滲透率可能增加到1.2%。

接下來我們分析了S基因突變對冠狀病毒診斷的重要性。許多RT-PCR試劑盒使用S基因引物，有些試劑盒無法給出S基因區域的RT-PCR數據。我們測定了歐米克隆病毒與武漢2019毒株的序列變化。數據如圖11所示，其中基因組中有兩個或兩個以上的區域。用NCBI引物設計軟件構建10條引物，其中1條位於S基因。BLAST分析發現，正向引物(F3= 5 ' -23518GAC TAA GTC TCA TCG GCG GG23537-3 '不能與ommicron基因組雜交，而反向引物5 ' -24130CCC ACA TGA GGG ACA AGG AC24111-3 '可以與ommicron基因組雜交。為武漢菌株設計的舊引物很難識別出S基因的變異，因此需要設計新的引物來追蹤S基因的傳播。這是RT-PCR使用舊引物檢測歐米克隆病毒傳播的一個例子。然而，引物對F8-5 ' - GGC AAA CCA CGC GAA CAA AT-3 '和R8 5 ' - GAG GGT CAA GTG CAC AGT CT-3 ' (1145 bp;Tm=60oC)在全武漢運行良好(登錄號: NC_045512.2), alpha B.1.1.7 (accession no. OD984292), delta B.1.617.2 (accession no. OV104747) and omicron B.1.1.529 (accession no. OL672836) corona viruses. Similarly to sequence the hyper-variable point mutated region (300-550 AA) we devised a forward primer from F8 reverse primer region F9-5’-CTG TGC ACT TGA CCC TCT CTC-3’ and a reverse primer downstream (R9-5’-CAC GGA CAG CAT CAG TAG TGT-3’) giving a 863 bp DNA product (Tm=60oC) for all Wuhan, alpha, delta and omicron corona viruses.

圖11:2019年12月武漢冠狀病毒Seq-2 BLAST相似度分析NC_045512.2)和2021年11月的奧米克隆冠狀病毒變種(加入號為ncc_045512.2)。OL721912)。這裏隻介紹了由於突變和缺失造成的多個穗基因位置的差異。

有趣的是，BLAST搜索高可變區的另一部分(22954 5 ' - CTT TCC TTT ACG ATC ATA TAG TTT CCG ACC CAC TTA TGG TGT TGG TCA CCA ACC ATA cag3 ' 23013)得到了相同的三個基因組序列，相似性為100%，但我們也發現了與2號染色體(13807869至13807888)的20nt精確匹配Seladonia tumulonum(蜜蜂)和19號染色體與16號染色體(1796578 ~ 1796596)不完全匹配Stemomphata瓜葉菊(海螺)。它編碼了小粒冠狀病毒刺突蛋白的488-493氨基酸(NH2-PLRSYS-CO2H)區域(圖12)。我們不知道為什麼病毒序列與蒼蠅或軟體動物等低等真核生物基因組如此相似!然而，這些信息可能會引起一些進化生物學家的興趣。

圖12:S基因與蜜蜂ch-2、蝸牛ch-16首次完全序列同源性的檢測。

然後，我們想知道6個氨基酸的缺失和3個氨基酸的插入與許多突變如何保護歐米克隆病毒S蛋白的功能和穩定，並提供比α和δ變異更高的傳播能力?當我們分析穗蛋白的氨基酸組成時，我們發現與武漢株和α株相比，ommicron沒有明顯的變化。圖13所示的數據(www.expasy.org/cgi-bin /portparam)。非常微小的變化被注意到，並被框為精氨酸，Aspergine，穀氨酰胺，苯丙氨酸和絲氨酸(圖11)。酸性氨基酸(Asp + Glu)和堿性氨基酸(Arg + Lys)在武漢病毒中分別為110和103，在B.1.1.7 α病毒中分別為109和103，而在歐米克隆冠狀病毒中酸性氨基酸和堿性氨基酸均為111。武漢病毒脂肪病指數為84.67，歐米克隆病毒為84.95，阿爾法病毒為84.65。武漢病毒、α病毒和歐米克隆病毒的不穩定性指數分別為33.01、32.82和34.65，說明歐米克隆冠狀病毒刺突蛋白非常穩定。這可能是由於與ACE-2受體和S蛋白的穩定相互作用而導致小粒冠狀病毒傳播較高的原因之一。然而，小微粒冠狀病毒RBD結構域的其他>15突變的相互作用尚不清楚。武漢病毒和小冠病毒的疏水圖見圖14。 There are some differences as shown by green box.

圖13:新型冠狀病毒(COVID-19)武漢變種、阿爾法變種和歐米克隆變種氨基酸組成的差異

圖14:疏水性圖顯示武漢病毒和歐米克隆冠狀病毒S蛋白之間的微小差異(方框)。

討論與結論

新冠病毒的變種Omicron正在美國、英國、澳大利亞、印度等世界各地迅速擴散。我們在此分析NCBI數據庫得出結論，歐米克隆病毒在美國迅速傳播，歐米克隆冠狀病毒的刺突蛋白非常穩定，盡管它比α和δ變種有更多的缺失和突變。最近，利用GISAIP數據庫發表了一篇關於非洲歐米克隆冠狀病毒係統發育的論文，第一個歐米克隆病毒基因組(29684 bp)的接入號為EPI_ISL_6640916，收集日期為2021年11月11日，提交日期為2021年23月11日[25]。但是，我沒有權限訪問這樣的數據庫。新的26個未知刺突蛋白突變的分子機製尚不清楚，但這種變化的發生伴隨著更高的傳播，氨基酸的聯合缺失肯定增加了免疫逃逸[26]。我們分析了NCBI SARS-CoV-2數據庫從2021年11月至12月的大量數據，檢測到約141個omicron序列(至24-12-2021礦床)。但是這樣的序列大多是不完整的，我們最終得到了大約21個真正的長穗蛋白序列(圖6)。在聖誕節那天，Howard D等人沉積了大約216個長穗蛋白序列，但由於插入序列的模糊性，大部分序列是不完整的，但有足夠的完整序列供長穗蛋白分析。在2021年11月的最後一周，當媒體上關於omicron的報道越來越多的時候，我麵臨著獲得真正的omicron刺突蛋白序列的巨大問題。2022年1月，Omicron序列的數量超過了Delta變體!

問題是，S基因製造的冠狀病毒疫苗的疫苗失敗可能與這種高變量的小穗蛋白差異有關!分析表明，一些疏水區域有相似性，肯定部分保護是可能的!研究表明，隻有20%和24%的BNT162b2疫苗接種者分別對omicron變種HKU691和HKU344-R346K有可檢測到的中和抗體，而冠狀病毒疫苗接種者對兩種omicron分離物均無可檢測到的中和抗體滴度。Omicron變體逃脫了BNT162b2或冠狀病毒[27]引起的中和抗體。利用動物模型Starr TN等人，[28]表明抗體S2H97和S2E12在所有sarbecovirus進化支中具有高親和力結合到一個隱表位，並預防性地保護倉鼠免受病毒挑戰[28]。進一步的研究表明，E484K突變避免了感染或接種疫苗引起的抗體中和，並進一步增強了K417N和N501Y突變[29]。刺突蛋白[30]的RBD結構域缺失突變體所產生的抗體也證實了類似的結論。Wang R，等[20,21]等(2021)研究表明，南非變異B.1.351對武漢病毒感染者的當前單克隆抗體和恢複期血漿的耐藥性最強，其次是英國α變異(B.1.1.7)和巴西γ變異(P.1)，其中有Y144del和245 -244del突變和重要的D614G和N501Y突變，以及SARS-CoV-2的spike蛋白RBD域的K417N/T、E484K/Q突變[27,31,32](Wand, et al.， 2021)。另一項研究表明，滅活的冠狀病毒疫苗和針對B.1.617和B.1.1.7變種的rbd -刺突蛋白疫苗誘導的中和抗體增強了病毒進入和膜融合，並增強了抗體中和的抵抗力[33-35]。因此，所有的自然突變都具有變構效應，驅動種間傳播或逃避抗體中和[36]。 Omicron virus was already transmitted in 90 countries and likely will be threat to humanity [37]. Omicron may be ten times more contagious than the original virus and twice more infectious than delta variant. We have shown that omicron viruses are greatly affected many US States including CA, NY, CO, MN and NJ. Further, omicron may be twice more likely to escape current vaccines than the delta variant [38]. Wang R, et al., identified fast-growing RBD mutations like N439K, S477N, S477R, and N501T that enhanced the RBD and ACE2 binding. L452R mutation in the spike reduces its interaction with Wuhan corona virus antibodies. Similarly, mutations E484K and K417N found in South Africa and L452R and E484Q found in India variants could be responsible for such reduced antibody interaction [21]. Miller NL, et al., preprint disclosed that the omicron variant increased antibody escape due to mutations in class 3 and 4 antibody epitopes in the spike protein as well as enhanced transmissibility通過配體-受體界麵[26]的破壞。最後，歐米克隆病毒的分子生物學剛剛開始定義其基因改變[25]的功能。雖然報告了輕微的發燒、感冒和肺炎症狀，但delmicron (Delta + Omicron)已經在世界上造成了一場浩渺的災難[39]。然而瑞德西韋藥物對控製冠狀病毒的傳播有一定的作用，靶向RNA依賴的RNA聚合酶以及一些免疫藥物[40]被發現。我們已經確定了小粒長刺蛋白的差異，但小粒長刺蛋白與ACE-2受體的相互作用表現得非常穩定。但是基因組突變可能影響RT-PCR(圖11)，因此從保守區域提出了新的RTPCR引物。有趣的是，現在NCBI將在SARS-CoV-2數據庫中提供更多的歐米克隆病毒序列。

確認

這項工作沒有得到任何機構的資助。作者感謝CDC和NCBI提供的數據。AKC是一位退休教授。

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Aritcle類型:研究文章

引用:歐米克隆冠狀病毒高變尖蛋白及其與變種的差異:RT-PCR和新疫苗的展望。J新興病毒7(1):dx.doi.org/10.16966/2473-1846.166

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出版的曆史:

收到日期:2021年12月24日

接受日期:2022年2月07日

發表日期:2022年2月24日