摘要

甲氧西林耐藥菌株金黃色葡萄球菌(MRSA)在甲氧西林引入臨床實踐後不久被發現。的金黃色葡萄球菌樣本取自Chania " Agios Georgios "總醫院的住院患者。在醫院實驗室從不同的病理產物中分離出菌株。所有分離株均采用頭孢西丁圓盤擴散法、唑西林MIC法和PBP2 '乳膠凝集試驗(bioMérieux)進行檢測，以生產青黴素結合蛋白2a (PBP2a或PBP2 '蛋白)。金黃色葡萄球菌ATCC 29213作為陰性對照。我們跟蹤發現了台麵式晶體管基因貫穿PCR法，作為標準的“金”法，以鑒別MRSA菌株。將傳統的MRSA菌株檢測方法與PCR方法進行比較。使用bioanalysis有限公司的抗生素片，在柯比-鮑爾紙片擴散法中進行抗生素藥敏試驗。的台麵式晶體管基因經PCR檢測，陽性率為57.5%金黃色葡萄球菌這允許將分離的菌株定義為MRSA菌株。根據研究菌株的oxacillin MIC值，25株(53.2%)為MRSA, 21株(44.68%)為MSSA, 1*株(2.13%)為Borderline (BL) MRSA。的台麵式晶體管基因在24株MRSA菌株中存在，其中莫西林MIC≥4的菌株在莫西林MIC≥256的菌株中更為常見(12/27)。在耐甲氧西林菌株中加入BL菌株，MRSA菌株的檢出率增加到26株(55.32%)，為PCR法測定的MRSA菌株百分比的適宜值(57.45%)，兩種試驗結果的一致性為96.3%(26/27)。比較PCR法檢測結果;與莫西林MICs和PBP2’膠乳凝集試驗相比，莫西林MICs對89.36%的菌株(42/47)和PBP2’膠乳凝集試驗對97.87%的菌株(46/47)的結果一致。我們的結論是，這些方法的特異性為100%台麵式晶體管PCR法，PBP2a乳膠法97.87%，莫西林MIC 89.36%。表型方法(PBP2a乳膠反應、苯唑西林MICs、頭孢西丁圓盤擴散試驗)與基因型方法(存在台麵式晶體管結果表明，PBP2a乳膠反應具有很高的靈敏度(97.87%)，在資源限製條件下，可作為MRSA檢測的PCR的替代方法。

關鍵字

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌);Methicillin-sensitive金黃色葡萄球菌(MSSA);唑西林片擴散;青黴素結合蛋白2a;聚合酶鏈反應(PCR);台麵式晶體管基因;克拉黴素(CLR)

簡介

甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌在甲氧西林應用於臨床後不久就發現了MRSA菌株。應認為MRSA對所有青黴素類、頭孢菌素類、β-內酰胺/β-內酰胺酶抑製劑組合以及對亞胺培南[1]具有耐藥性。此前的一項研究表明，在醫院中MRSA的感染率上升了33%。快速檢測MRSA是必要的。基於DNA序列信息的幾種PCR方法已被用於MRSA (ORSA)菌株的檢測。早期發現甲氧西林耐藥(MR)至關重要。幾種表型方法中，膠乳與PBP2a的檢測台麵式晶體管建議[3]基因進行PCR檢測。已采用標準化方法檢測耐藥菌株[4]。基於培養的方法需要長達5天才能從患者標本中識別MRSA菌株。然而，甲氧西林耐藥的表型表達通常是異質的[5]。此外，耐甲氧西林性受培養條件如溫度、pH和NaCl含量的影響。這些因素使甲氧西林耐藥檢測複雜化，特別是對低水平耐藥菌株。為了取代這些費時的方法和避免MRSA在醫院內的傳播，人們開發了分子方法來識別MRSA菌株。商用PCR方法可用於MRSA快速檢測和僅在3小時內識別MRSA菌株[7]。基於DNA序列信息的幾種PCR方法已被用於MRSA菌株[8]的檢測。最近開發了在2-6小時內檢測MRSA菌株的分子分析方法，用於篩選標本。 The台麵式晶體管PCR方法檢測基因具有較高的敏感性和特異性，不依賴於物理和化學培養條件，隻需24小時即可進行正常的PCR方法。檢測台麵式晶體管PCR方法被認為是“金標準”，正在取代MIC方法作為參考方法，但尚未普遍使用，因為它隻在參考實驗室進行，而且比傳統測試[9]更昂貴。

研究目標與假設

在本研究中，我們跟蹤檢測台麵式晶體管基因全程PCR法，作為標準“金”法，以鑒別耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)。將傳統方法與聚合酶鏈式反應(PCR)法進行比較，以檢測MRSA菌株。

材料與方法

該研究於2020年1月至2020年4月進行，包括47株金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌)從希臘查尼亞" Agios Georgios "綜合醫院的住院病人身上獲得。菌株從不同醫院病房的住院患者中分離出來:內科、外科和重症監護病房以及該實驗室的其他醫療單位。的金黃色葡萄球菌菌株從不同病理產物中分離得到:血液19株(40.43%)、膿液(12.76%)、傷口9株(19.15%)、鼻分泌物5株(10.64%)、耳分泌物和結膜分泌物5株(10.64%)、導管針尖3株(6.38%)和其他引流液(圖1)。菌株從40-60歲(52%)、60-85歲(30%)和18-40歲(18%)患者中分離(圖2)。

圖1:從病理產物中分離出的菌株。

圖2:葡萄球菌感染患者的年齡分布。

菌株隔離

菌株在適當的非選擇性、選擇性和顯色培養基上進行分離。基於培養的方法需要5天才能從患者標本中識別MRSA。

分離株的鑒定金黃色葡萄球菌特性:金黃色葡萄球菌菌株通過傳統方法進行鑒定，基於表型特性:形態學、革蘭氏染色、凝固酶和過氧化氫酶試驗、葡萄球菌乳膠凝集(塗有等離子的乳膠珠-檢測凝集因子和蛋白A，金黃色葡萄球菌與中樞神經係統有區別)。分離株的鑒定金黃色葡萄球菌菌株也通過半自動(Api bioerieux)和自動方法(Vitek2 Compact BioMerieux)進行。對47株菌株，使用bioanalysis有限公司的抗生素片，通過Kirby-Bauer擴散法進行了抗生素敏感性測試，包括AB: β-內酰胺類，大環內酯類(紅黴素，克拉黴素)，糖肽類(萬古黴素，Teicoplanin)，林可胺類(克林黴素，林可黴素)，唑烷酮類(利奈唑酮)，鏈黴素:Quinupristin/dalfopristin (Q/D)， Pristinamycin, Virginiamycin，氨基糖苷類:(慶大黴素，妥布黴素)，喹諾酮類，四環素，複方新諾明(磺胺甲惡唑&噻甲氨苄啶)。解釋:臨床和實驗室標準協會(CLSI)易感性文件[10,11]。

金黃色葡萄球菌甲氧西林耐藥的快速檢測:分子檢測台麵式晶體管基因聚合酶鏈反應:所有分離株在整個聚合酶鏈反應方法中檢測其存在台麵式晶體管青黴素結合蛋白2a (PBP2a或PBP2 '蛋白)的基因編碼。PCR采用標準程序進行。的台麵式晶體管按照Predary, et al. 1992的描述進行基因擴增。DNA擴增在50°C的反應混合物中進行30個循環:94°C變性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸1分鍾，最後在72°C延伸5分鍾。PCR混合物由0.5µl的引物組成。特異性引物台麵式晶體管使用的基因是:正向引物(5 ' AAA TCA GAT GGT AAA GGT TGG C3 ')，反向引物(5 ' AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG C3 ')。PCR產物(10 ml)在1.5%瓊脂糖凝膠中進行分析。MSSA標準應變金黃色葡萄球菌ATCC 29213作為陰性對照。以MRSA標準菌株ATCC 43300A為陽性對照菌株。采用凝膠電泳法進行PCR擴增台麵式晶體管基因特異性引物，顯示典型的oxacillin (台麵式晶體管MRSA分離株[12]基因-533 bp)耐藥性(圖3)。

圖3:PCR顯示典型的莫西林耐藥(mecA基因+)模式。
巷1-5:巷:陽性對照臨床樣本1個，MRSA分離株mecA基因PCR條帶(533 bp);C巷:陰性對照(mecA陰性金黃色葡萄球菌);M:分子大小標記(100bp DNA Ladder Plus)。

用表型法(用於檢測MRSA菌株)檢測金黃色葡萄球菌分離株的甲氧西林耐藥。對所有分離株進行測試，使用頭孢西丁圓盤擴散法和莫西林MIC法，並通過PBP2 '乳膠凝集試驗(bioMérieux)生產青黴素結合蛋白2a (PBP2a或PBP2 '蛋白)[13]。

金黃色葡萄球菌ATCC 29213作為陰性對照。對23株(47株)進行頭孢西丁30 μ g/片頭孢西丁紙片擴散試驗，評估其在檢測MRSA菌株中的價值，並與其他方法進行比較:PCR(用於台麵式晶體管基因)，苯唑西林MICs, PBP2a乳膠反應)。不需要特殊的培養基或培養溫度。檢測受青黴素酶超產生菌的影響較小。將分離物製成0.5 Mc Farland標準懸浮液，並在MHA平板上進行草坪培養。在37°C孵育18 h。測量抑菌區直徑。最新的CLSI補充(M100-S14)建議使用30 μ g頭孢西丁片，斷點≤21 mm作為阻力指標金黃色葡萄球菌新青二。根據臨床和實驗室標準研究所- clsi文件M100 S20-2010，分離株被解釋為敏感或耐藥。據報道，頭孢西丁抑製帶直徑≤21的為對苯唑西林耐藥金黃色葡萄球菌≥22 mm為對唑西林敏感的金黃色葡萄球菌。頭孢西丁圓盤擴散試驗沒有中間類別。頭孢西丁e試驗:選擇性和差異培養基(CHROM瓊脂MRSA)用於MRSA的直接定性檢測也被確定為MRSA的可能的表型檢測方法。

莫西林MIC用於金黃色葡萄球菌特性:對47株菌株，在整個圓盤擴散法[14]中進行唑西林的MIC(最低抑菌濃度)測定。含1 μ g苯唑西林/片的片在muller - hinton瓊脂板上繪製。根據臨床和實驗室標準協會- clsi文件M100 S20-2010對Oxacillin MIC的解釋標準(μg/ml)，分離株被解釋為敏感或耐藥。MIC≤2 μg/ml為對甲氧西林敏感/敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)， MIC 2-4 μg/ml為耐甲氧西林(middle或Borderline methicillin)金黃色葡萄球菌(BL MRSA)， MIC≥4 μg/ml為耐甲氧西林(耐甲氧西林)金黃色葡萄球菌(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)。將PBP2a膠乳凝集試驗與PBP2a膠乳凝集試驗進行了比較台麵式晶體管用PCR(金標準)方法檢測甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌[15]。

結果

從總數金黃色葡萄球菌研究菌株(n=47株)台麵式晶體管基因PCR檢測到27例金黃色葡萄球菌20株(42.56%)未檢出甲氧西林耐藥mrsa株(57.45%)和甲氧西林敏感emssa株(42.56%)。台麵式晶體管20人中PCR結果為陰性(42.56%)。金黃色葡萄球菌菌株(n = 47)。所有的台麵式晶體管陰性菌株(20株)PBP2a膠乳反應陰性，證實了PCR方法得到的結果，指導了PBP2’膠乳凝集試驗100%的特異性和兩種方法100%的符合性。膠乳凝集試驗檢測到26例(55.32%)患者存在PBP2a台麵式晶體管積極的壓力。一個台麵式晶體管陽性菌株(2.13%)PBP2a乳膠反應陰性，兩種方法對甲氧西林耐藥(MR)檢測符合率為97.87%。考慮到PBP2a的缺失台麵式晶體管對於陽性菌株，需要指出的是，陰性/不一致的結果可能存在，在較低的百分比(2.13%)，導致診斷和識別分離菌株為MSSA菌株的錯誤。我們得出結論，PBP2 '乳膠凝集試驗具有在常規微生物環境中檢測MRSA菌株的潛力;它比任何單獨用於MRSA檢測的藥敏試驗方法都更準確;它接近PCR的準確性(97.87%)，兼具高速、優異的特異性和敏感性，對特殊設備或技術人員的要求有限。它可以推薦作為一種替代表型方法來識別MRSA菌株，並成功地用於微生物實驗室的常規應用，但有必要在整個檢測過程中確認所獲得的結果台麵式晶體管PCR法檢測基因。

結果表明，該菌的菌西林MIC值金黃色葡萄球菌菌株

21株(44.68%)在0.38 ~ 2 μg/ml之間，1*株(2.13%)在2 ~ 4 mg/ ml之間，25株(53.2%)≥4 μg/ml。根據研究菌株(47株)的oxacillin MIC值，分離株中25株(53.2%)為MRSA, 21株(44.68%)為MSSA, 1*株(2.13%)為BL MRSA (Borderline Methicillin-resistant)金黃色葡萄球菌(圖4)。研究菌株的苯唑西林ΜIC值25株(53,2%)的苯唑西林MICs水平較高，其中大部分≥64 μg/ml(21株):4 μg/ml (1)， 32 μg/ml (1)， 64 μg/ml (2)， 96 μg/ml (4)， 128 μg/ml (3)， >256 μg/ml(12)。

圖4:分離菌株的唑西林mic值。

莫西林MIC與PCR的比較(存在mec A基因)

27個MRSA (台麵式晶體管+)菌株24(51.07%)具有oxacillin MIC>4和18 (20)MSSA (台麵式晶體管-)菌株(38.3%)的莫西林MIC在0.38-2之間，兩種試驗結果的一致性為89.36%(42/47)。

Oxacillin MIC用於台麵式晶體管+ (MRSA)菌株

的台麵式晶體管基因在24株MRSA菌株中存在，其中莫西林MIC≥4的菌株在莫西林MIC≥256的菌株中更為常見(12/27)。將BL菌與耐藥菌加在一起，MRSA菌率增加到26株(55.32%)，這是MRSA菌率的適宜值，由台麵式晶體管基因法(57.45%)，兩種試驗結果一致性為96.3%(26/27)。莫西林的mic和台麵式晶體管5株MRSA和MSSA(10.64%): 2株MSSA (4.25%)台麵式晶體管陰性菌株莫西林mic值分別為3 μg/ml和6 μg/ml, MRSA 3株台麵式晶體管陽性菌株(6.39%)的mic值低於2 μg/ml(0.38 ~ 2)。比較PCR檢測結果台麵式晶體管用苯唑西林MICs進行基因檢測，89.36%(42/47)菌株檢測結果一致，5株(10.64%)菌株檢測結果不一致。莫西林mic值為6 μg/ml的菌株(菌株Nr 1851)為a台麵式晶體管陰性菌株，對AB敏感，提示MIC Oxa斷點值與對AB敏感可能存在相關性台麵式晶體管陰性菌株，對頭孢西丁敏感(抑製區直徑為26)，對AB敏感，產生β內酰胺酶。

msa菌株產生β內酰胺酶的相關性將在後麵觀察。在總數中台麵式晶體管MRSA陽性菌株27株，3株(6.39%)Oxacillin mic≤2低水平，分別為0.38 μg/ml(1株)、0.75 μg/ml(1株)、2 μg/ml(1株)。這3株對頭孢西丁也敏感(S)，可考慮為對唑西林(MSSA)敏感株。所有三個不和諧的菌株都呈現台麵式晶體管基因表達PBP2a，並產生β-內酰胺酶，導致它們的框架為MRSA。

金黃色葡萄球菌臨床分離株攜帶台麵式晶體管最近，其他作者越來越多地報道了表型上對唑西林敏感的基因。有人建議，這樣的分離物可以被歸類為一種新的MRSA類型，指定OS-MRSA，如果隻測試抗微生物藥物的敏感性，在日常生活中可能被錯誤地歸類為MSSA。一般認為，在治療ossmrsa感染時，我們應該采取預防措施，因為使用-內酰胺類抗生素治療可能會導致耐藥MRSA的出現，這是由於存在台麵式晶體管基因[16]。從所有的菌株，2台麵式晶體管陰性菌株(MSSA)的mic值為>4，分別為3 μg/ml和6 μg/ml。

用苯唑西林MIC與PBP2a膠乳和PCR法進行了結果比較台麵式晶體管基因)

比較PCR得到的結果台麵式晶體管基因檢測(100%)金黃色葡萄球菌與PBP2 '膠乳凝集試驗結果一致的菌株分別為89.36%(42/47)株和97.87%(46/47)株台麵式晶體管PCR法，PBP2a乳膠法97.87%，莫西林MIC 89.36%。

來自47個金黃色葡萄球菌菌株中23株(48.94%)采用30 μ g/片頭孢西丁進行頭孢西丁圓盤擴散試驗台麵式晶體管陽性菌株占34%台麵式晶體管陰性株(14.9%)，未達到24株(51.07%):11株(23.41%)台麵式晶體管陽性株13株(27.66%)台麵式晶體管消極的壓力。從16株菌株中分離得到12株(25.5%)台麵式晶體管陽性菌株(34%)、耐藥菌株(抑製區直徑≤21 mm) 11株(23.4%):4株(17.4%)台麵式晶體管正的和7台麵式晶體管陰性(14.9%)為頭孢西丁敏感株(抑製區直徑≥22 mm)(表1)。

金黃色葡萄球菌菌株	Cefoxitine R	頭孢西汀S(敏感)	金黃色葡萄球菌 測試壓力
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌台麵式晶體管陽性(+)	12 (25.5%)	4 (8.51%)	16 (34%)
MSSA台麵式晶體管負	-	7 (14.9%)	7 (14.9%)
總計	12 (25.5%)	11 (23.4%)	23 (48.94%)

表1:使用30 μ g/片的頭孢西丁對所研究的菌株進行頭孢西丁圓盤擴散試驗結果。

82.6%(23例中19例)的檢測結果與PCR方法一致金黃色葡萄球菌株數(100%)12 (52.17%)台麵式晶體管陽性菌株(MRSA)分別為R和7株(30.43%)。台麵式晶體管陰性菌株(MSSA)對頭孢西丁敏感(S)。4例(17.4%)與PCR結果不一致。台麵式晶體管+菌株(MRSA) S到頭孢西汀。所有4種菌株均存在台麵式晶體管表達PBP2a的基因對唑西林敏感(唑西林MICs分別為0.38、0.75、2);一種是IS;4株菌株中有3株產生β-內酰胺酶。頭孢西丁盤式擴散試驗較早使用，但特異性較低，正如我們在結果(82.6%)中觀察到的那樣，也可能導致識別錯誤(17.4%的分離株結果不一致)，使一些MRSA菌株未被檢測到。由於β-內酰胺酶的過度產生，可能產生假陰性的結果，從而導致表型表達的苯西林耐藥。頭孢西丁圓盤擴散試驗檢測MRSA和msa: 23例金黃色葡萄球菌檢測菌株(100%)來自女巫16台麵式晶體管陽性菌株(69.57%)，頭孢西丁紙片擴散法檢出12株(52.17%)為MRSA, 7株(30.42%)為MSSA。

用PCR法檢測MRSA(對於存在台麵式晶體管基因)和表型測試

在47株分離株中，通過表型和分子方法鑒定出的MRSA比例如下:PCR 57.45%， PBP2a乳膠反應55.32%，Oxacillin MICs試驗53.2%，頭孢西丁紙片擴散52.17%。PBP2a乳膠反應法的結果與PCR法的結果一致台麵式晶體管基因(97,87%)、莫西林MICs試驗和頭孢西丁盤式擴散試驗與PCR法的一致性(靈敏度)分別為89.36% (82.61%)台麵式晶體管基因。如果隻進行經典的表型試驗(頭孢西丁圓盤擴散試驗和唑西林MICs試驗)，表型和基因型試驗之間的不一致結果表明在鑒定中可能存在混亂，並表明需要進行PBP2a乳膠法和基因型試驗(PCR法)來檢測台麵式晶體管基因。

討論

在過去十年中，MRSA菌株已成為嚴重的醫院病原體，並在世界許多地區傳播，因為它能夠獲得對抗菌化療[17]的耐藥性。因此，快速識別這些微生物和檢測甲氧西林耐藥對促進有效治療、防止感染分布和降低患者死亡風險[18]至關重要。甲氧西林耐藥率金黃色葡萄球菌在其他研究中，用唑西林盤擴散法測定的患病率為47.6%;然而，45.1%的金黃色葡萄球菌隔離是台麵式晶體管-陽性。

甲氧西林耐藥與甲氧西林敏感的檢測金黃色葡萄球菌(MRSA和MSSA)具有重要的臨床意義。甲氧西林耐藥的檢測相對簡單，因為它是由一個單一的決定因素，青黴素結合蛋白2a '定義的，它存在於各種葡萄球菌盒式染色體mec攜帶的有限的遺傳變異中。在過去的幾十年裏，MRSA和MSSA的診斷已經有了顯著的發展，並且已經從基於培養的表型方法向分子檢測的強烈轉變，特別是考慮到mec基因的存在和表型耐藥[20]之間的密切相關性。

流行病學調查顯示，由MRSA引起的感染在全球範圍內呈上升趨勢。此外，許多研究表明，在當地環境中MRSA分離株正在增加[22]。

處理MRSA細菌最重要的挑戰是減少經驗治療或預防中的抗生素選擇，因為這些分離物通常具有多藥耐藥[23]。發現PBP2a膠乳凝集法比唑西林MIC試驗和頭孢西丁圓盤擴散法更敏感。PBP2a膠乳凝集方法具有吸引力、成本效益高、操作相對簡單、易於應用於微生物診斷實驗室等優點。其他表型方法在MRSA檢測中的差異對患者管理有不利影響，因此突出了檢測準確性的重要性。異抗性或易感和耐藥無性係的存在，可能導致傳統藥敏試驗的診斷錯誤。MRSA分子鑒定方法的進展(台麵式晶體管基因檢測)，強調實驗室需要重新評估傳統表型方法在MRSA診斷中的作用。快速實驗室診斷和藥敏檢測對於治療、管理和預防MRSA感染至關重要。使用分子方法檢測MRSA避免了未分離MRSA的數量和不必要的先發製人的隔離天數，降低了MRSA的傳播和感染率，降低了MRSA相關的死亡率，並因縮短患者住院時間而節省了成本。分子方法(PCR技術)是用於病原菌株鑒定和試圖找到菌株[24]的流行病學相關性的主要工具。

MRSA在醫院的存在對患者和醫院管理都是有害的。因此，需要對MRSA進行快速鑒定。MRSA分離株通常耐多藥，因此在治療MRSA感染時應考慮抗菌藥敏試驗結果[25]。分子技術和傳統技術的聯合使用為醫生和衛生保健工作者提供了直接影響治療[26]的寶貴信息。耐甲氧西林菌產生的感染數量金黃色葡萄球菌可以全程限製防控措施。因此，必須對這些醫院的醫務人員進行適當的監督，並製定合理的抗生素處方政策。對照試驗必須確定在醫院護理單位使用該技術的控製策略的潛在醫療和經濟效益[27]。

結論

表型方法(PBP2a乳膠反應、惡唑西林MICs、頭孢西丁圓盤擴散試驗)與基因型方法(存在台麵式晶體管結果表明，PBP2a乳膠反應具有很高的靈敏度(97.87%)，在資源限製條件下，可作為MRSA檢測的PCR的替代方法。在所有表型方法中，僅PBP2a乳膠反應具有與PCR方法相似的敏感性和特異性。

確認

作者感謝希臘查尼亞“Agios Georgios”總醫院的工作人員和羅馬尼亞克盧日-納波卡“Iuliu Hatieganu”醫學和藥學大學對本研究完成的支持。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

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出版的曆史:

收到日期:2020年6月24日

接受日期:2020年9月8日

發表日期:2020年9月19日