摘要

病毒依賴生物體來完成其生命周期，針對病毒的疫苗和抗病毒藥物有很多，但一些病毒如HIV對疫苗或抗病毒藥物沒有表現出任何敏感性或效果。最近，研究人員正在關注CRISPR/Cas9，這是一種允許在生物細胞中進行基因組編輯的技術。這項技術改變了基因工程的概念，可以在未來的治療中應用於修複遺傳疾病。除了針對人類基因組外，它還可以應用到病毒遺傳物質的特定位點，從而治愈病毒感染，因此，用於治療SARS-CoV-2作為治療感染冠狀病毒的緊急解決方案，在世界上感染冠狀病毒的數量越來越多。在這裏，我們討論了最近關於使用CRISPR增強和對抗人類病毒感染的研究，重點是CRISPR和HIV, CRISPR/Cas9研究，挑戰，並探索未來應用它的機製。最後，CRISPR技術是抵抗病毒感染工程的革命性發展。但這項技術在應用於人類之前還需要進行越來越多的研究。

關鍵字

CRISPR / Cas9;冠狀病毒;COVID-19;SARS-CoV2;病毒感染;艾滋病毒

簡介

病毒依靠宿主細胞組分上的胞內病原體進行複製。它們連接受體的細胞表麵進入細胞，因此，加強細胞功能和細胞器複製[1]。

宿主細胞可以通過感知病原體相關分子模式(PAMPs)來對抗感染，包括病毒核酸、碳水化合物或蛋白質，以感知感染宿主細胞中的病毒病原體，觸發抗病毒基因[2]的表達。

抗病毒策略的可用性僅限於特定的病毒類型，如冠狀病毒、(艾滋病毒)人類免疫缺陷病毒。這些病毒很容易變異，在感染的早期階段不容易發現。因此，目前可用的抗病毒方法是無效的[3]。

最近的研究依賴於利用微生物抗病毒防禦機製來提高對真核病毒的免疫力，例如，大多數古生菌和細菌都有針對噬菌體在其生命周期的不同階段的防禦抗病毒機製，這被稱為先天免疫。此外，細菌有幾個獨立的機製來保護自己免受病毒感染或侵入性DNA，如相關的質粒。其中一種機製是阻斷吸附;因此，細菌通過突變或屏蔽受體來阻止噬菌體與細胞受體的結合，從而導致感染。另一方麵，噬菌體的DNA注射無法進入細胞。其他係統直接作用於侵入性DNA，如限製/修飾和(與CRISPR相關)。失敗的感染係統是一種無私的防禦，它會導致細胞在受傷時死亡。因此，這些防禦係統可以彼此獨立運行。因此，它阻止了噬菌體吸附和基因組插入，受體突變;也取消感染宿主細胞死亡[4]。

1987年，Yoshizumi Ishino和他的同事意外地發現了一種新的基因修改的精確技術，但他們不知道如何解釋他們當時看到的東西。隨著分子基因學的發展和科學家們對許多生物DNA的解讀，科學家們在2002年觀察到，日本科學家談論的這些奇怪的部分存在於許多類型的細菌中，一位荷蘭科學家稱之為(CRISPR)。CRISPR/Cas9是一種簡單高效的基因組編輯工具，其技術應用在蟲害時期[5]得到了快速的發展。

此外，CRISPR/Cas9技術可用於滅活病毒感染，如人類細胞中的人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)。然而，病毒的表達和複製是通過改變原病毒階段的非編碼或編碼序列而停止的，這表明CRISPR/Cas9技術可能是一種新的治療傳染性病毒的策略，特別是艾滋病毒和COVID-19[5,6]。

12月下旬，一種新的冠狀病毒株出現了，被稱為SARS-CoV-2。截至2020年5月14日，該病毒已在全球造成4258666人感染和294190人死亡。中國、法國、德國、美國和許多國家都在努力尋找有效的藥物，但仍在試驗中，沒有產生任何限製新冠病毒傳播的治療方法[7-10]。

因此，本修訂版將討論使用CRISPR增強和對抗人類病毒感染的最新進展，並提供例子來招募CRISPR技術對抗人類病毒感染。此外，它將洞察使用基因組編輯如CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas13d技術來提高主動抗病毒防禦的應用。此外，我們將展示使用CRISPR/Cas技術增強和對抗人類病毒感染的挑戰，並提出克服這些障礙的具有挑戰性的策略。

病毒定義和感染

病毒是最小的傳染性因子，它依靠宿主完成複製，但並不生活在有機體或宿主之外。病毒可以對任何類型的生命形式造成損害，如動物、植物和微生物，如細菌[11]。

病毒的分類取決於遺傳物質，包括:(i)帶有衣殼(病毒外殼)的DNA，如噬菌體。(二)RNA物質遺傳和包膜蛋白外套，酶和一些病毒外表麵有脂質，如HIV。(iii)根據病毒[12]的簡單結構或更複雜的結構進行分類。

一些研究提到，在生命進化史上，病毒的起源尚不清楚:因此，很少有病毒是從轉移到細胞的DNA質粒進化而來的，而其他病毒可能是從細菌(如噬菌體)進化而來的。它們依靠宿主的細胞進行複製和傳播。病毒感染是威脅全球公共衛生的最重要來源之一。宿主細胞已經形成了強大的抗病毒防禦，包括先天和適應性免疫機製，如識別病毒(pamp)的能力。但許多病毒可以避開宿主的防禦或削弱它[3,12]。

已經改進了各種對抗病毒的策略，還有直接針對病毒中抑製任何病毒複製的特定位點的策略，以及針對病毒複製和持續[3]所需的宿主因子的策略。

作為一種機會性病原體，病毒已經發展出許多不明確的策略來操縱宿主細胞進行感染和複製。

CRISPR技術

聚類規則間隔短回文重複序列是在細菌基因組中發現的DNA序列的一部分大腸杆菌[1]。

CRISPR序列是從噬菌體的DNA片段中發現的，用於防禦任何之前感染的傳染病。例如，一種類型的CRISPR-Cas，如CRISPR-Cas 2係統，需要一個tracrRNA在crRNA的成熟過程中發揮作用。因此，這個雜交體充當了核酸內切酶Cas9的向導，Cas9將入侵的核酸裂解。同時，該間隔物還能增強CRISPR係統的適應性和基因特異性失活機製。間隔是與噬菌體或質粒DNA同源的序列短片段(26 - 72 bp)。然後在隨後的感染過程中，從類似噬菌體中識別受損的DNA。因此，CRISPR/cas9係統是原核生物抗病毒的重要防禦係統[1,14-19]。

Cas9 (CRISPR相關蛋白9)是一種依賴CRISPR序列作為目錄的酶，它可以識別並裂解與CRISPR序列互補的特定DNA鏈。CRISPR序列與Cas9酶協同工作，編輯生物體內的基因。這種編輯過程有廣泛的應用，包括基礎生物學研究、生物技術產品的改進，如食品、藥品和工業生物學。值得注意的是，CRISPR作為生物技術在2012年主要由Doudna-Charpentier和Church-Zhang的作品提供。也可用於疾病的治療[5,20]。

CRISPR是一種基因或基因組編輯工具。它比以前的DNA編輯技術更快、更便宜、更準確，在基因工程中有廣泛的應用[5,21]。

從80年代發現這項技術到現在，PubMed上超過17744篇和Science Direct上19819篇發表的文章都提到了CRISPR[20,22]。許多初步研究已經使用CRISPR功能滅活人類細胞係中的基因，修改用於製造生物燃料的酵母以增強其產品，還對作物品係進行基因改造以增強抗蟲能力、感染能力和增加產量。此外，CRISPR還被用於改變按蚊的結構，從而防止了瘧疾等疾病的傳播。其中一項研究表明，當靶向基因(AgdsxF) dsx-女性時，由CRISPR-Cas9跨越靶向的內含子4-外顯子5的邊界，從而阻斷了AgdsxF的功能形成，從而引起對該突變等位基因的純合子完全不育，從而靶向更低的瘧疾風險[22,23]。2019年，美國科學家使用CRISPR實驗性地治療了一名患有遺傳疾病的患者。患者患有鐮狀細胞病;她是個女人，34歲。來自中國的研究人員還使用該技術對人類細胞進行了基因改造。根據去年發布在網上的中國醫學文件，深圳南方科技大學的一個團隊招募了一對夫婦，試圖創造出世界上第一批基因編輯嬰兒。他們計劃消除一種名為CCR5的基因，希望使後代對艾滋病毒、天花和霍亂具有抵抗力。 Although they still did not present complete evidence of this achievement [1,24,25].

CRISPR-Cas9生物學

許多細菌直接通過CRISPR位點和伴隨的CRISPR相關(Cas)基因改進了高級rna引導的適應性免疫係統，從而提供對任何敵人[26]的獲得性免疫。

新興的CRISPR/Cas工具技術可以應用於對病毒的研究和實驗，擴展到宿主模式之外。

該技術的方法用於生成兩者在體外而且在活的有機體內作為模式生物或非模式生物來研究病毒傳染，編輯病毒基因組，並改進有潛力對抗病毒疾病載體和改進抗病毒藥物的基因驅動係統(圖1)。

圖1:CRISPR/Cas9在基因工程中的應用。

利用細胞係建立實驗室係統是研究病毒感染的寶貴工具。但這些係統在全麵了解宿主生理學、病理學、免疫和感染[1]期間的傳播方麵存在局限性。

從首次發現基因組編輯的機會開始，CRISPR技術就迅速成為一種精巧而強大的工具，用於廣泛的生物基因組操作，因為它易於造型，使用簡單，效率高。與傳統的介導DNA編輯技術不同，CRISPR/ Cas9係統有可能對基因編輯技術施加影響，並從根本上改變基因編輯技術，從而改變我們對基因工程的理解[5,28,29]。

CRISPR避免了依賴蛋白質結構域的更複雜的基因組編輯策略的需要，如DNA的蛋白質工程-識別每個DNA目標位點的結構域被修飾[30]。因此，深刻支持其適用於大規模基因組篩選或操作，以及在科學界的不同采用[27,30,31]。

在圖1中，cas基因組編輯使生成在體外而且在活的有機體內研究病毒發病機製的模型。這項技術並不局限於編輯模式生物的基因，如老鼠、蛔蟲和果蠅，但它也可以應用於非模式生物，如猴子、蝙蝠、雞和其他動物。此外，CRISPR在工程大型DNA病毒(如天花)的基因組方麵也很有用。此外，CRISPR已被用於改變蚊子的結構，從而防止了瘧疾[1]等疾病的傳播。

CRISPR作為適應性免疫

在原核生物中，CRISPR/Cas9係統對噬菌體和其他傳染性遺傳元素[3]提供適應性免疫。

CRISPR技術幹預免疫，最終導致對外來核酸的序列特異性幹擾。最後，Cas9酶識別並摧毀與病毒[3]序列互補的外源遺傳元件。

CRISPR用於對抗人類致病性病毒

人體免疫缺陷病毒(艾滋病毒):許多關於使用CRISPR/Cas9抗病毒病毒的研究已經發表。盡管抗逆轉錄病毒療法(ART)可以阻止病毒複製，但它對具有免疫記憶的t細胞CD4潛伏感染的幹擾是無效的，而且到目前為止還沒有任何功能性疫苗[32,33]。

最近的研究表明抗病毒的CRISPR/Cas9係統可以使潛在感染細胞的基因組失活在體外艾滋病毒。從而導致感染的(功能性)治愈[32,34,35]。

CRISPR/Cas9靶向病毒原體長末端重複區(LTR)被證明可以成功地抑製HIV基因表達並清除感染細胞中的原病毒。另一項研究聚焦於CRISPR/Cas9靶向病毒如HIV的基本基因[32,33]。

Yin L等人[36]探索了Cas9/gRNA對HIV-1感染的強大抑製作用，這是由於RNA或DNA病毒水平的顯著降低。此外，Limsirichai P等人[37]解釋說，CRISPR激活係統有可能增強基於細胞的延遲模型中的HIV-1表達。

CRISPR技術與cART技術的結合，可能在未來引領HIV-1感染的新療法。第一份報告在活的有機體內Kaminski R等人進行了抗hiv CRISPR療法的實驗。他們在臨床環境中使用相關病毒(AAV)載體共同表達兩種抗hiv Cas9療法，增強了傳遞和療效在活的有機體內模型[32,34](圖2)。

圖2:利用CRISPR對抗人類病毒的策略。

在圖2中，我們注意到使用CRISPR應用程序對抗人類病毒的四種一般策略。在這裏，我們回顧了兩種最重要的直接靶向感染細胞病毒基因組的策略，即通過根除或使納入宿主基因組的病毒DNA失效，從而破壞病毒的工作[32,38-40]。

最後，CRISPR技術已經成為備選方法的選擇，因為它在HIV治療的一部分，可以有效地修改靶向HIV-1基因組。

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)世界目前正在經曆一種新型冠狀病毒大流行(COVID-19)疾病，它是由嚴重急性冠狀動脈呼吸綜合征2 (SARS-CoV-2)[41]引起的。

許多研究中心表示，科學家和研究人員需要在大約12至20個月內開發出安全有效的新冠病毒疫苗，才能獲得減少感染擴散的疫苗。因此，數百萬人將被感染。因為根據世界衛生組織每天公布的統計數字，這種病毒的特點是傳播迅速和傳染性強，並伴隨著世界上死亡人數的增加。因此，迫切需要開發創新的方法來對抗未來可能出現的一種廣泛傳播的病毒[42,43]。

因此，我們在這裏使用的Cas13d蛋白的特點是體積小，Cas13d蛋白的中位尺寸比Cas13a-Cas13c小190 ~ 300倍。此外，Cas13d效應器的小尺寸、最小的靶向限製和模塊化調控進一步擴展了CRISPR工具箱用於RNA操作。因此，它依賴於這種酶直接靶向並裂解所有病毒陽性感RNA，從而抑製病毒功能和複製[42,44-46]。

有研究發現SARS-CoV-S Spike與SARS-CoV-2 Spike之間存在聯係，即SARS-CoV-2突變在接觸氣道表麵後可與敏感細胞的受體表麵結合[47-55]。

ACE2作為感染的中介體發揮著關鍵作用，可能介導病毒進入靶細胞和病毒繁殖。SARS-CoV-2與ACE2的結合不如SARS-CoV冠狀病毒(ACS2)與ACE2的結合強，但仍遠高於病毒感染所需的閾值[54,56-59]。

另一項研究發現，SARS-CoV-2必須與ACE2結合才能進入海拉細胞9。其他研究顯示ACE2表達與SARS-CoV感染呈正相關在體外(60 - 62)。

以往對引起嚴重急性呼吸綜合征(SARS)的冠狀病毒的研究發現，它們通過表麵抬高蛋白與肺泡內的ACE2結合，進而引起肺損傷，甚至肺功能衰竭。ACE2可能是SARS-CoV-2的細胞受體，但是否是唯一的細胞受體還有待進一步研究[63-66]。

此外，Cas13d在人細胞中的高催化活性為靶向SARS-CoV-2進行特異性病毒RNA基因組降解和病毒基因表達抑製提供了一種潛在的機製。這是因為它具有體積小、催化活性強、特異性高等優點。因此Cas13d是靶向並摧毀RNA病毒的最佳選擇[41,44-46]。

結論CRISPR- cas13d技術可以抑製SARSCoV-2與ACE2結合，這是因為CRISPR技術可以引導SARSCoV-2抑製血管緊張素轉換酶(ACE)，通過截斷ACE2受體而不被SARS-CoV-2識別，從而阻止病毒進入細胞。從而降低SARS-CoV-2與ACE2受體之間的結合水平，Cas13d可以攜帶能夠識別基因組中前者的gRNA，從而導致從基因組中切割出原病毒，使無SARS-CoV-2細胞。因此，Cas13d可以在不影響細胞的情況下去除整體感染(圖3)。因此，這可能會減少感染冠狀病毒的機會。

圖3:使用CRISPR-Cas13d對抗SARS-CoV-2 (COVID-19)。

在圖3中，左圖顯示了使用CRISPR阻止SARS-CoV-2進入細胞的方法。當SARS-CoV-2遇到免疫細胞時，它必須與免疫細胞表麵的受體結合。這種被稱為ACE2的受體就像一把鎖，SARS-CoV-2將鑰匙插入其中，打開進入細胞的門。ACE2的一個微小變化就會阻止密鑰的插入。最後，被截斷的受體無法被SARS-CoV-2識別，從而阻止病毒進入細胞。而右上Cas13d攜帶的gRNA可以識別基因組中的前一個病毒，從而從基因組中切割出原病毒，使SARS-CoV-2細胞脫離，因此Cas13d可以在不影響細胞的情況下去除綜合感染[54,67]。

人類抗病毒CRISPR療法的限製

新技術在使用之前自然會出現限製和安全方麵的問題。將基於crispr的技術應用於臨床。從而減少宿主免疫係統的檢測。大多數情況下，未知的觸發因素會導致病毒重新激活以及隨後的病毒產生和傳播，從而導致更多的問題。此外，CRISPR技術在感染的潛伏階段是無效的。使用CRISPR技術對抗艾滋病毒和SARS-CoV-2仍麵臨許多挑戰。然而，在開始直接使用該技術對抗人類病毒之前，必須進行更多的研究和實驗來確定該技術的缺點[32,68,69]。

未來的前景

病毒依靠生物體進行複製和傳播。然而，受感染的細胞通過感知pamp來抑製病毒複製，隨後觸發抗病毒基因的表達。因此，CRISPR/Cas係統在真核物種的病毒生物學研究中產生了巨大的影響[3,70]。

許多研究對利用CRISPR/Cas技術進行dna靶向提出了警告，在使用該技術對抗病毒時需要考慮到[3,71]。

逃逸突變可產生耐cas9的變異，並可能導致具有更大致病性的變異病毒的出現。這可能導致高抗病毒的出現[3,72]。

此外，一些研究表明，針對某些基因組特異性位點，例如一些植物病毒基因組中的非編碼基因間序列，會導致對病毒複製有害的突變的出現。這反過來又證實了仔細確定靶病毒基因組序列有助於減少逃亡突變體的形成，從而消除它們[3,71]。

結論

盡管CRISPR/Cas技術在工程防禦真核病毒方麵的全部潛力尚未被充分利用，但這項技術在工程抵抗人類和植物病毒方麵是一個巨大的進步。

有許多初步的研究集中在改進基於某些類型的CRISPR/Cas9係統的抗病毒策略。但是，加強和對抗人類病毒感染仍有很大的需要。此外，它將揭示關於DNA在真核生物基因組中位點特異性整合的潛力的新知識，開啟CRISPR技術的額外基因組工程。

上圖左圖展示了使用CRISPR阻止SARS-CoV-2進入細胞的方法。當SARS-CoV-2遇到免疫細胞時，它必須與免疫細胞表麵的受體結合。這種被稱為ACE2的受體就像一把鎖，SARS-CoV-2將鑰匙插入其中，打開進入細胞的門。ACE2的一個微小變化就會阻止密鑰的插入。最後，被截斷的受體無法被SARS-CoV-2識別，從而阻止病毒進入細胞。而右上方Cas13d攜帶的gRNA可以識別基因組中的前一個病毒，從而從基因組中切割出原病毒，使SARS-CoV-2細胞脫離，因此Cas13d可以在不影響細胞的情況下去除綜合感染[54,67]。

確認

我們要感謝Laith Al-Eitan博士、Shima Ataa、Hanan Aljammal和Aiman Yaseen對我們的幫助。同時，我們把這篇文章介紹給我們的父母。同時，Asaad也要感謝DAAD對他的幫助。

利益衝突

作者聲明不存在利益衝突。

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Aritcle類型:評論文章

引用:Ataa AMA, Ataa AMA(2020年)使用CRISPR增強和抗擊人類病毒感染，如HIV和SARS-Cov-2。J新興病毒5(2):dx.doi.org/10.16966/2473-1846.151

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出版的曆史:

收到日期:2020年4月17日

接受日期:2020年5月11日

發表日期:2020年5月19日