摘要

背景:以檢測不到HBsAg和檢測到抗hbc為特征的隱性(隱性)乙型肝炎病毒感染(OBI)繼續對血液安全構成巨大威脅。我們調查了腎移植患者OBI的患病率和OBI的HBV基因型。

方法:從喀土穆州不同中心的腎移植患者中收集了100個樣本。采用ELISA法檢測標本表麵抗原(HBsAg)和核心抗體(HBc)，采用PCR和Real - time PCR檢測HBV DNA，采用多重嵌套PCR檢測HBV基因型。

結果:共檢測100份臨床標本，其中ELISA檢測HBsAg陰性97份(97%)，HBc抗體陽性37份(38.1%)。37例HBc抗體陽性標本PCR檢測HBV DNA均為陰性(0.0%);Real - time PCR僅檢出19份(51.4%)陽性DNA樣品;而在24份(64.9%)樣本中檢測到不同HBV基因型(A、D、E)及其合並感染。男性抗hbc陽性率(42%)高於女性(33%)。采用multi - plex Nested PCR方法，男性和女性隱性HBV患病率基本相等，分別為65.2%和64.3%，而采用Real - time PCR方法，女性隱性HBV患病率為57.1%，高於男性隱性HBV患病率(47.8%)。

結論:結果顯示蘇丹喀土穆腎移植患者中隱匿HBV的中度發生率。這些結果也表明，隱匿性HBV可能不能用傳統的PCR檢測，而可以用Real - time PCR和多重嵌套PCR檢測。多重嵌套PCR檢測還可以通過檢測病毒基因型，以更高的頻率檢測隱匿型HBV，而這些病毒基因型是單獨使用Real - time PCR檢測不到的。這一理念對於避免通過透析機或輸血的意外傳播非常重要。

關鍵字

腎移植患者;乙型肝炎病毒基因型;隱匿性乙型肝炎病毒;表麵抗原;Anti-HBc抗體

簡介

人類乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個重大的健康問題，是腎髒和肝髒疾病的主要因素。據推測，全世界有超過5億人感染乙肝病毒，每年有超過100萬人死於乙肝病毒感染的影響[1,2]。

如今，腎移植患者因感染而導致的發病率和死亡率比腎移植出現後最初幾十年的發病率和死亡率要低。然而，感染仍然是腎移植受者健康的重大威脅，主要是因為感染與器官排斥反應相關。在這方麵特別重要的是在腎移植受者[3]的發病率和死亡率中發揮重要作用的病毒。

隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)可被定義為一種特定形式的HBV感染，其中患者乙型肝炎表麵抗原(HBsAg)呈陰性，但抗hbc抗體呈陽性，同時肝髒和血清中HBV DNA呈陽性。OBI首次被懷疑是在20世紀70年代，當時通過輸血或腎髒患者傳播HBV感染發生於血清學提示既往HBV感染但HBsAg清除的捐贈者[4,5]。OBI可能與宿主的免疫反應和/或與其他疾病因子[4]的聯合感染有關。在OBI病例中檢測到啟動子pre-S2/S區域自然發生的突變[6,7]。後來觀察到，這些突變可導致HBsAg表達修飾和大HBsAg/小HBsAg比值增加，導致抗原分泌[8]減少。

多項研究表明，不同的HBV基因型與不同的轉歸相關，如HBV基因型D與暴發性肝炎有關，而基因型B與肝硬化有關[9-11]。

本研究旨在確定蘇丹喀土穆州腎移植患者中隱性HBV和HBV基因型的流行率。

方法

在本研究的時間框架內(2015年)，從蘇丹喀土穆Salma博士和Ibin-Sina醫院的移植和血液透析中心招募了100名腎移植患者。血液樣本收集在EDTA容器中，以3000轉/分離心5分鍾。獲得的血漿樣本被標記並儲存在-20°C，直到進一步分析。

血清學

商業ELISA試劑盒包括HBsAg夾心ELISA (Cut-off =(平均NC × 2.1;OD = 450海裏;>1.0陽性)和抗hbc競爭性ELISA (Cut-off=(平均NC × 0.5;OD = 450 nm;陽性<1.0)(診斷自動化/Cortez診斷公司。根據製造商描述的程序使用。所有HBsAg陰性和HBc抗體陽性的樣本進一步進行DNA提取。

聚合酶鏈式反應(PCR)

使用商用試劑盒(Analytik Jena, Germany)根據製造商說明從患者血漿材料中提取DNA。簡單地，將200µl的裂解液CBV/Carrier Mix加入2.0 ml反應液中，加入200µl的血漿樣品和20µl的蛋白酶K，混合後70°C孵育10分鍾。隨後，將400 μ l的結合溶液SBS添加到樣品中，然後將得到的溶液的所有裂解混合物應用到一個柱中。加入2次500µl的HS洗滌液和650µl的LS洗滌液洗滌，用60µl的預熱無rnase水洗脫核酸，-20℃保存備用。

PCR方法是用HBV HBsAg基因特異性引物對血漿中提取的DNA進行處理。所使用的引物包括正向引物

5 ' - tcggaaatacacctcctttccatgg3 ' HBV基因組(353- 1377)和反向引物3'GCCTCAAGGTCGGTCGTTGACA-5 ' HBV基因組(702-1681)，根據Mohammed AA等[12]進行優化的HBV擴增PCR反應。10µl的擴增產物在2%瓊脂糖中進行凝膠電泳直接分析。使用UV單獨TS凝膠文檔係統(德國耶拿分析公司)對產品進行可視化。表麵抗原基因擴增子的預期大小為350 bp。

多重嵌套PCR

基於雙管多重嵌套PCR方法的基因分型係統?使用類型特異性引物根據pre-S1到S基因分配乙型肝炎基因型A-F。HBV引物S1-2和P1是通用的外引物。引物B2作為內義引物，與其他HBV基因型a、B、C的反義引物組合在一個名為Mix a的複用係統中。引物B2R作為反義內引物，與HBV基因型D、E、F的義引物組合在一個名為Mix B的複用係統中。所使用的HBV基因型特異性引物是基於基因型內這些序列的保守性設計的，並根據[13,9]優化了用於HBV擴增的多重嵌套PCR反應。混合A和B的係統隻傳遞了一個包含不同參數的程序。樣品在凝膠文檔係統上可視化。Mix a基因型的預期條帶大小為a -68bp、B-281 bp和C-122 bp, Mix B基因型D-119 bp、E-167 bp和F-97 bp[9]。

實時聚合酶鏈反應

采用乙肝病毒DNA定量熒光診斷試劑盒(快速HBV, PCR-熒光探針)進行實時熒光PCR檢測。中國)根據製造商的說明。簡單地，將每個血漿標本，陽性對照和陰性對照，定量參考標準品A、B、C、D的5µl直接轉移到PCR反應管中，與5µl DNA裂解緩衝液充分混合，孵育10分鍾。

在另一個PCR管中，用38µl的HBV PCR mix、2µl的酶mix和0.2µl的內控物製備PCR-主混合物。然後將lysat與PCR主混合物混合。單個反應的最終體積為50µl。熱循環條件為50°C 2分鍾，94°C 2分鍾，初始變性，94°C 45個周期，15秒變性，57°C 30秒退火延伸，最後在25°C冷卻10秒。使用轉子-基因Q實時PCR儀(Qiagen, Germany)進行反應。

統計分析

所有數據采用windows軟件包的社會科學統計軟件包(IBM SPSS 20.0版本)進行統計分析。概率≤0.05為有統計學意義的結果。Kappavaue的評估如下，值<0不一致;0 - 0.20輕微;0.21 - -0.40公平;0.41 - -0.60溫和;0.61-0.80和0.81-1幾乎完全一致。

結果

HBsAg和hbcab的檢測

共檢測100份樣本HBsAg, ELISA檢測結果97份(97%)HBsAg陰性。對97例HBsAg陰性的標本，采用ELISA法檢測抗hbc。其中60例(61.9%)抗hbc檢測陰性，37例(38.1%)抗hbc檢測陽性(表1)。根據性別，檢測出抗hbc的男性23例(62.2%)，女性14例(37.8%)(表1)。

性別	Anti-HBc		總計
	積極的	負
男性	23 (62.2%) (42%) *	32 (53.3%) (58%) *	55 (56.7%) 100%
女	14 (37.8%) (33%) * *	28 (46.7%) (67%) * *	42 (43.3%) 100%
總計	37 (38.1%) * * *	60 (61.9%) * * *	97例(100%)

表1:不同性別的抗hbc頻率。
*占男性總數的%;** %的女性;HBsAg陰性專利的*** %。

HBV DNA及基因型檢測

采用PCR、Real - time PCR和多重嵌套PCR對37份HBsAg陰性、抗- hbc陽性的樣本進行HBV DNA檢測和HBV基因型檢測。PCR法檢測0例(0.0%)HBV DNA, Real - time PCR法檢測19例(51.4%)HBV DNA, Multiplex Nested PCR法檢測24例(64.9%)HBV基因型(A、D、E)單一或混合。根據性別，15例男性(65.2%)和9例女性(64.3%)采用多重嵌套PCR檢測DNA, 11例男性(47.8%)和8例女性(57.1%)采用Real - time PCR檢測DNA(表2和表3)。多重嵌套PCR檢測的HBV基因型及其數量如下:0(0%)、D-0(0%)、E-9(37.5%)、D / E-13(54.1%)、A / D 1(4.2%)和A / D / e 1(4.2%)。40歲以上年齡組的隱性DNA檢測頻率最高，15歲以下年齡組未檢測到隱性DNA(表4)(圖1-3)。

圖1:多重嵌套PCR檢測HBV基因型的瓊脂糖凝膠結果(8道:100 bp梯;巷1:陰性對照;巷2、3、4、5、6、7:混合基因型D和E)。

圖2:圖形描述線性範圍的定量參考A, B, C, D標準曲線檢測(10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷用Sansure試劑盒檢測乙肝病毒，快速HBV Real - Time PCR檢測。

圖3:用Sansure試劑盒、乙型肝炎病毒DNA定量熒光診斷試劑盒對陽性對照、陰性對照、定量參考和陽性樣本進行線性範圍的圖形描述。

性別	總測試	聚合酶鏈反應	多重嵌套(c)聚合酶鏈反應	實時聚合酶鏈反應(d)
男性(一)	23	0 (0%)	15 (65.2%)	11 (47.8%)
女(b)	14	0 (0%)	9 (64.3%)	8 (57.1%)
總計	37	0 (0%)	24 (64.9%)	19 (51.4%)

表2:應用PCR、多重嵌套PCR和Real - time PCR分析不同性別HBc陽性患者隱匿HBV的頻率。
^(一)Real - time PCR- multiplex Nested PCR (P<0.05);^(b)Real time PCR multiplex Nested PCR (p=0.015)
^(c)多重嵌套PCR (p=0.47);^(d)Real - time PCR (P<0.05)

樣品/測試	聚合酶鏈反應	多重嵌套PCR	實時聚合酶鏈反應
積極的	0 (0%)	24 (64.9%)	19 (51.4%)
負	37 (100%)	13 (35.1%)	18 (48.6%)
總計	37 (100%)

表3:采用PCR、多重嵌套PCR和Real - time PCR檢測37例納入研究的患者隱匿HBV的總頻率。

按年齡劃分的年齡組	攜帶HBV病毒的患者人數(%)
	總測試	聚合酶鏈反應	多重嵌套PCR	實時聚合酶鏈反應
≤15	6 (16.2%)	0 (0%)	0 (0%)	0 (0%)
15 - 40	11 (29.7%)	0 (0%)	9 (81.8%)	7 (63.3%)
≥40	20 (54.1%)	0 (0%)	15 (75%)	12 (60%)
總計	37 (100%)	0 (0%)	24 (64.9%)	19 (51.4%)

表4:用PCR、多重嵌套PCR和Real - time PCR檢測隱匿HBV的頻率。

聚合酶鏈反應	多重嵌套PCR(一)		實時聚合酶鏈反應(b)
	積極的	負	積極的	負
積極的	0	24	0	19
負	0	13	0	18
總計	0	37	0	37

表5:多重嵌套PCR和Real - Time PCR結果與PCR結果的交叉製表。
^(一),(b)Kappa值= 0.000

聚合酶鏈反應		實時聚合酶鏈反應		總計
		積極的	負
多重嵌套PCR	積極的	15	9	24
	負	4	9	13
總計		19	18	37

表6:Real - time PCR與多重嵌套PCR結果交叉製表。

采用多重嵌套PCR方法，男性的檢出率不顯著高於女性(p值=0.47)，而Real - time PCR方法，男性的檢出率不顯著高於女性(p值=1)。與Real time PCR相比，多重嵌套PCR檢測到的雌性(p值=1)不顯著高於Real time PCR，而雄性(p值=0.015)顯著高於Real time PCR。Real - time PCR和Multiplex Nested PCR與Real - time PCR的Kappa值為0.0，表示不一致，但Multiplex Nested PCR和Real - time PCR之間的Kappa值為0.292(表5和表6)。

討論

本研究旨在確定蘇丹喀土穆腎移植患者中隱匿性乙型肝炎和乙型肝炎基因型。97例(97%)HBsAg陰性，其中37例(38.1%)HBc抗體陽性。Gutierrez C等、Duseja A等和Sofian M等分別在委內瑞拉、印度和伊朗報道了類似的結果[14-16]，但這些作者未能在他們的試驗對象中檢測出隱匿性乙型肝炎。然而，Mohammed AA等人[12]能夠;使用和我們一樣的引物;在蘇丹喀土穆州3例(3.3%)血液透析患者中檢測隱性HBV。在本研究中，我們分別用多重嵌套PCR和Real - time PCR檢測了24.7%和19.6%的腎移植患者的OBI。

在我們的研究人群中，PCR未能檢測隱性乙肝病毒尚不清楚，但這可能表明多重嵌套PCR和實時PCR在檢測隱性乙肝病毒感染方麵具有更高的敏感性。本研究中采用Multiplex Nested PCR基因型(24.7%)和Real time PCR(19.6%)檢測的隱性HBV患病率與德國、意大利、巴西、墨西哥等不同國家報道的血液透析、腎移植患者等人群的隱性HBV患病率在0 ~ 58%之間相似[17-20]。

在HBc陽性患者中，Real time PCR檢測OBI的高患病率(51.4%)和巢式檢測OBI的高患病率(64.9%)可能是由於我們的患者在腎移植前經曆了不同時期的血液透析。這可能增加了他們獲得HBV和隨後隱匿性HBV感染的風險。

本研究結果高於Peres AA等[21]和Bae E等[22];誰分別發現了2%和2.7%的患病率

既往未見應用多重嵌套PCR檢測腎移植患者隱匿HBV基因型的報道，既往研究多采用傳統PCR檢測乙肝表麵抗原基因或其他乙肝基因，這可能提示傳統PCR檢測腎移植患者OHB的方法需要重新評估。

在本研究中，檢測了3種不同的基因型(A, D和E)。單一型感染僅出現在E基因型，2或3基因型混合感染占大多數。這可能與基因突變、基因變異或其他原因有關。E-9基因型(37.5%)、D/E-13基因型(54.1%)是我們研究中的主要感染類型，這與埃及Maysaa ESZ等人在血液透析患者中進行的一項研究形成了鮮明對比，該研究報告的基因型為C(44.4%)、a(27.8%)和B(22.2%)。

使用多重嵌套PCR進行乙肝病毒基因分型比測序簡單、容易和便宜，但基於核苷酸序列的測序和係統發育分析可產生最準確的基因分型結果。然而，係統發育分析並不是在資源有限的實驗室進行診斷檢測的合適方法，它更適合有先進分子檢測的發展中國家。另一方麵，實時聚合酶鏈反應(Real - time PCR)可能是在發展中國家檢測隱匿性乙肝病毒更合適的方法，但正如本文所指出的，可能會遺漏一些感染。

結論

隱性HBV在喀土穆州腎移植患者中呈中度流行，隻能通過多重嵌套PCR和Real - time PCR檢測。此外，我們的研究可能表明隱性HBV檢測可能需要使用多種技術。

倫理審查

該研究獲得了蘇丹喀土穆州高等教育和科學研究部中央實驗室倫理審查委員會(ERC)的批準。知情同意來自成年患者或兒童的父母或法定監護人。

同意出版

不適用。

數據和材料的可用性

數據共享不適用於本文，因為在當前的研究中沒有數據集分析。

相互競爭的利益

作者沒有競爭利益需要聲明。

資助聲明

高等教育和科學研究部中央實驗室支持這項針對肝炎病毒的工作(2016HB10002-10, 2016HB10002-12)。

致謝

我們感謝Ibin-Sina醫院和Salma博士中心的移植和血液透析，讓我們能夠收集患者的血漿樣本。這項工作得到了蘇丹喀土穆高等教育和科學研究技術部中央實驗室的資助。

作者的貢獻

MOM進行了樣品采集、ELISA、多重嵌套PCR、Real - time PCR等工作，並撰寫了稿件。KME幫助分析數據，並參與了手稿的準備和編輯工作。IME對這項研究的構想和設計作出了貢獻，並幫助起草了手稿。AME對研究的構思和設計、手稿的起草都有貢獻。所有作者閱讀並批準了最終稿件。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Mustafa MO, Enan KA, Elkhidir IM, El Hussein ARM(2019)蘇丹喀土穆州腎移植患者中隱匿性乙型肝炎病毒和乙型肝炎基因型。J新興病毒5(1):dx.doi.org/10.16966/2473-1846.147

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出版的曆史:

收到日期:2018年11月20日

接受日期:2019年1月18日

發表日期:2019年1月25日