Jiangqin趙＊Jikun劉王薛英迪拉Hewlet＊
分子病毒學實驗室，美國食品藥品監督管理局生物製劑評價與研究中心*通訊作者:趙江勤，美國食品藥品監督管理局生物製劑評價與研究中心分子病毒學實驗室，電話:240-402-6746;電子郵件:jiangqin.zhao@fda.hhs.gov
分子病毒學實驗室，美國食品藥品監督管理局生物製劑評價與研究中心，美國，電話:240 - 402 - 9587;電子郵件:indira.hewlett@fda.hhs.gov
2014年初，西非發現了大規模的埃博拉病毒疫情，自那時以來該病毒一直在該地區流行，導致了許多報告的病例和死亡。全球旅行、移徙、新感染原及其變種的出現增加了生物恐怖主義的風險，並對國家安全和公共衛生構成嚴重威脅。同時檢測多種潛在生物恐怖主義製劑的分析方法具有很大價值，但目前的可用性有限。在本研究中，我們報道了一種基於金納米顆粒(NP)的快速和特異性基因組微陣列測定法(nanomicroarray)的開發，用於埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒的檢測和篩查。設計了埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒的特異性捕獲和中間寡核苷酸，並在陣列平台上與這些病原體的PCR產物進行了評估。基於np的納米微陣列檢測可以通過在同一平台上顯示不同的獨特模式，在單一檢測中檢測和區分埃博拉、馬爾堡和拉沙基因組序列。這裏所述的新方法可能有助於監測包括新型生物恐怖主義劑在內的新病原體的威脅，並可作為應急準備和應對公共衛生的一部分。
診斷;Filovirus;出血熱病毒;埃博拉病毒;馬爾堡;拉沙;監測;Nanomicroarray;生物恐怖主義的代理人
NP:納米顆粒;RT-PCR:逆轉錄聚合酶鏈反應;埃博拉病毒病;MVD:馬爾堡病毒病;hfv:出血熱病毒;NATs:基於核酸的檢測;MTA:材料轉讓協議;下一代測序
2014年，西非發現大規模埃博拉病毒病(EVD)暴發，報告病例超過28,616例，死亡11,310例[1,2]。埃博拉疫情於2013年12月在幾內亞爆發，並蔓延到包括利比裏亞、尼日利亞和塞拉利昂在內的鄰國。EVD也通過被感染的旅行者傳播到其他國家或大陸，歐洲國家和美國已經報道了EVD病例[1,3]。根據世衛組織2018年2月12日的報告，在過去的疫情中，EVD病例死亡率在25%至90%之間變化(平均死亡率為50%)[4]。由於EVD的早期症狀與普通流感相似，因此使用快速、靈敏和準確的診斷技術進行正確診斷至關重要，以確保患者得到及時治療，防止疾病惡化，緩解症狀，提高免疫力，消除病毒。EVD的症狀在接觸病毒後2至21天開始出現。2018年5月，剛果西北部的赤道省爆發了一種新的EVD流行病，可能對當地居民以及前往該地區的國際遊客構成嚴重風險。自2014年埃博拉疫情爆發以來，一種高防護效力的埃博拉疫苗rVSVZEBOV已進入臨床試驗[5,6]，並於2018年5月第一期分發，用於EVD應急準備。在現有的EVD檢測方法中，聚合酶鏈式反應(PCR)是一種強大的分子診斷工具，可以滿足EVD檢測的挑戰。然而，在資源有限的情況下，由於其成本和對穩定工作條件和訓練有素的專業人員的要求，診斷EVD不太有利。
自我意識、預防措施和疾病監測是控製埃博拉病毒等致命疾病傳播和保護公眾健康的基本方法[7]。在2001年美國發生炭疽攻擊後，美國政府采取了這些措施，以管理可被用作生物威脅的傳染因子，包括天花、炭疽、鼠疫、肉毒杆菌中毒和出血熱病毒(hfv)的病原體。病毒如絲狀病毒(埃博拉病毒和馬爾堡病毒)、拉沙沙粒病毒、朱寧沙粒病毒、馬丘波沙粒病毒、瓜納裏托沙粒病毒和薩比亞沙粒病毒被CDC列為A類病原體[9]。這些病毒在自然界中廣泛分布，容易感染人類，臨床上很難與其他疾病過程區分。例如，像埃博拉和馬爾堡這樣的絲狀病毒可能存在於某些種類的果蝠、受感染的患者或靈長類動物中，並通過直接接觸受感染宿主的血液、器官或其他體液傳播[7,11]。世衛組織記者2017年10月18日指出，馬爾堡病毒病(MVD)的病死率在過去疫情中從24%到88%不等(平均病死率50%)[12]。不幸的是，目前還沒有被證實有效的藥物或疫苗來幫助對抗MVD。即使在宿主[13]死亡後，埃博拉病毒仍在體內活躍，因此，新的感染可通過與死亡宿主的組織或體液接觸發生。由於這些病毒的死亡率高，而且有可能被用作生物武器，因此所有這些病毒都被列為生物恐怖主義毒劑[7,14]。許多病毒性和細菌性疾病可能具有與病毒性出血熱相似的症狀，因此，在疾病暴發期間，正確識別由這些不同類型的病原體引起的感染和合並感染是一項巨大的挑戰。
臨床篩查、診斷、分型和鑒別多重合並感染的標準方案需要使用不同的引物組和多重反應。自上次埃博拉病毒爆發以來，為診斷該病毒開發了許多免疫分析和核酸檢測(NATs)，如RealStar®Zaire埃博拉病毒RT-PCR試劑盒(德國漢堡Altona診斷公司)[15]、GeneXpert®埃博拉檢測試劑盒(美國加利福尼亞州森尼維爾造王變星)[16]、FilmArray®BioThreat/埃博拉檢測板(美國猶他州鹽湖城BioFire)[17]和ReEBOV抗原快速檢測(美國科羅拉多州Broomfield Corgenix)[18]。這些檢測方法可有效檢測患者血清、血漿或全血中的埃博拉病毒，RT-PCR檢測比抗原捕獲法[19]檢測埃博拉病毒早1 ~ 2天。然而，由於PCR引物突變或失配，NATs可能對新出現的病毒亞型無效，從而阻礙了其在臨床的應用。一項研究報告了兩種多重PCR和RTPCR酶雜交試驗(mPCR-EHA和mRT-PCREHA)，用於同時檢測CDC“A”類DNA和RNA生物恐怖劑，然而，該試驗需要生物酶反應和標準熱循環劑[20]。為了利用NATs的高特異性，同時繞過其局限性，我們開發了一個結合納米技術和無pcr全基因組納米微陣列的診斷平台。該技術以前被用於快速和多重檢測流感病毒感染，包括甲型流感禽流感H5N1和乙型流感病毒[21]。在這項工作中，我們將該技術用於常見的hfv的多重檢測，包括埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒。我們證明，該平台可以在一次測試中快速、同時檢測和識別不同的HFV基因組，可以直接檢測病毒DNA或RNA，而不需要生物酶催化的擴增反應。
埃博拉病毒(紮伊爾，76)、馬爾堡病毒(Musoke變種)和拉沙病毒(Josiah株)的PCR產物是通過材料轉讓協議(MTA)從Jonathan S. Towner博士(CDC, Atlanta, GA)獲得的。PCR進行總量的30µL包含15µL 2 x PCR緩衝(伸肌發燒友Reddy PCR和主人混合、ABgen房子,薩裏,英國),2.5 pmol正向和2.5 pmol反向引物(見表1),反應條件是一個周期在94°C, 5分鍾,然後,35周期在94°C, 30秒50°C, 40秒68°C, 1.0分鍾和7分鍾一個周期在68°C。PCR產品量化使用安捷倫2100生物分析儀(安捷倫科技公司,威爾明頓DE)和使用下一代測序(NGS)進行測序，然後使用納米微陣列檢測。NGS分析和生物信息學的細節在我們以前的出版物[21]中有描述。在單個或混合PCR產物中，所有PCR擴增子都被準確和正確地分類為埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒。捕獲寡核苷酸和中間寡核苷酸的序列是按照先前的方法[21]設計和製備的。簡單地說，通過使用國家生物技術信息中心(NCBI)提供的核苷酸序列，我們使用MEGA 5.3和Vector NTI Advance TM 11 (Invitrogen, Foster City, CA, USA)對每個埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒基因組進行了多次序列比對。對三種病毒基因組中每一種的核苷酸序列進行進一步排列，以確定用於檢測和區分的重要保守區域。設計了多個捕獲和中間寡核苷酸(通常分別為4或5個)，以補充整個基因組或測試片段的保守區域。埃博拉病毒基因組PCR片段位於11624 ~ 12683 bp之間(GenBank號:AF086833)，馬爾堡病毒基因組PCR片段位於6500 ~ 7757 bp之間(GenBank號:NC_001608)。 The PCR fragment for Lassa virus covers the glycoprotein gene between 499 and 1504 bp (GenBank No: M15076). These critical designs ensure that the target gene to be multiply captured on the nanomicroarray and consequently hybridized with multiple intermediate oligonucleotides detected by the gold nanoparticle probe. The designed capture oligonucleotides were modified with 5’-amino-C6-modifier while a 25-mer poly (A) tail added at the 3’ end of intermediate oligonucleotides during synthesis (Integrated DNA Technologies, IA). Capture oligonucleotides that did not bind to any known sequence of Ebola, Marburg, and Lassa viruses were included as array internal positive controls. The oligonucleotides sequences are listed in table 1. Nanomicroarray was designed in a triple-spot format (Figure 1A) and the capture oligonucleotides were printed on CodeLink® activated slides using an OmniGrid Accent® printer (Genomic Solutions Inc., Marlboroug, MI, USA). Procedural details of the nanomicroarray printing, processing, and the assay were described previously [21].
圖1:圖片來自Verigene IDTM檢測係統。(A)帶有陽性對照捕獲(紅色圓圈閉合)、陰性對照捕獲(空白圓圈閉合)、埃博拉病毒(藍色圓圈閉合)、馬爾堡病毒(黃色圓圈閉合)和拉沙病毒(綠色圓圈閉合)基因捕獲(每個基因有四個不同的捕獲寡核苷酸，每個捕獲寡核苷酸在三個副本中發現)的納米微芯片布局。表1所示的數字表示從一個基因的不同捕獲序列。(B)在每個陣列中檢測到的捕獲寡核苷酸標記為cEbo(埃博拉病毒)、cLas(拉沙病毒)和cMab(馬爾堡病毒)。顯示單個或多個埃博拉、馬爾堡和拉沙基因PCR產物的銀染色圖像。
設計、打印和評估了埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒的每個基因的納米微陣列。納米微芯片格式是通過在三個重複點上打印自身捕獲的4寡核苷酸(1到4來自四個不同區域)，代表埃博拉、馬爾堡和拉沙病毒的典型病毒模式，如圖1A所示。每個子陣列包含三個基因點用於多重檢測。3個病毒基因PCR產物(埃博拉病毒紮伊爾株1212 bp, 76;馬爾堡病毒Musoke變種1257 bp;和983 bp的拉沙病毒，Josiah株)在陣列中雜交，在相應基因特異性捕獲寡核苷酸打印區域觀察到特異性信號譜(圖1B)。我們觀察到，PCR擴增子顯示出不同的信號模式，表明每個捕獲的寡核苷酸與目標模板結合的親和力不同。如圖1B所示，cEbo3與埃博拉病毒基因親和力最低;cLas4與拉沙病毒基因結合無親和力，而cLas1、2、3與拉沙病毒基因結合有較強親和力;馬爾堡病毒基因中寡核苷酸cMab2和cMab3的結合親和力強於寡核苷酸cMab1和cMab4。 The unique fingerprint pattern of the captures for each array represents Ebola, Marburg, or Lassa virus and can correctly identify and differentiate from each other. The different affinity of each capture oligonucleotide may be caused by poor oligonucleotide synthetic or microarray printing process. In the right panel of figure 1B, a mixed PCR product from Ebola, Marburg, and Lassa viruses were tested and a similar image profile for a typical gene was observed in the areas printed with corresponding genespecific capture oligonucleotides. Although there is a different image signal intensity observed in the capture oligonucleotides between the three target genes, however, no cross-hybridization was observed when the single target or multiple targets and multiple intermediate oligonucleotides were incubated in the assay. For laboratory sequence confirmation, the mixture of PCR products was also tested in the NGS assay and each gene was correctly identified (data not shown). We conclude that the current nanomicroarray assay can simultaneously detect and discriminate the three HFVs tested. One benefit of this nanomicroarray assay is that it can randomly and simultaneously detect multiple HFVs in a single subarray from an unknown sample and allow discovery of new emerging strains.
| 低聚糖ID | 目的 | 序列(5＇到3＇） | 位置 |
| Ebo_F | 聚合酶鏈反應 | CACCAATTGTATTGGACCA | 11624 - 11642 |
| Ebo_R | 聚合酶鏈反應 | AATGTTTGGCAATACTATATTTAAA | 12835 - 12811 |
| Las_F | 聚合酶鏈反應 | TCAGTATGAGGCAATGAGCTGCGA | 499 - 522 |
| Las_R | 聚合酶鏈反應 | AGGCTGTTTGTAGAGTCCACAGGA | 1504 - 1481 |
| MabF | 聚合酶鏈反應 | ACGAATGACACTGGATGCTTCGGT | 6500 - 6578 |
| MabR | 聚合酶鏈反應 | TCCAAGCACTTTGCATGTTCCTCC | 7757 - 7734 |
| cEbo1 | 捕獲 | ACTCCCTTAATCCGCAACTACGCAACTGTAAACTCCCGAA | 11684 - 11723 |
| cEbo2 | 捕獲 | GGTATCAGGCATCAGTATTCAAAGAAGCGGTTCAAGGGCA | 12215 - 12254 |
| cEbo3 | 捕獲 | ATTATGCTCAAAGTACACTGAGAGGAAGGGCCGATTCTTA | 12501 - 12540 |
| cEbo4 | 捕獲 | CTTCTCAAGGCACTGTCAGGCAATGGATTCTGTCCTGTTG | 11818 - 11857 |
| iEbo1 | 中間 | AGTTCTTGAGTGATGTACCAGTGGCGACATTGCCCATAGA * | 11762 - 11801 |
| iEbo2 | 中間 | GGTTTGTTCATGATGATTTAATAGACATCTTAGGCTATGG * | 12098 - 12137 |
| iEbo3 | 中間 | ATAGCAGAGATTGAGGATCCAGTTTGTTCTGATTATCCCA * | 12346 - 12385 |
| iEbo4 | 中間 | TGGAGATGACGCCACAACAACTTTGTGAGCTATTTTCCAT * | 12653 - 12692 |
| cLas1 | 捕獲 | TTATGAGGATGGCTTGGGGTGGGAGCTACATTGCTCTTGA | 627 - 666 |
| cLas2 | 捕獲 | AGACCATCTCCCATCGGTTATCTCGGGCTCCTCTCACAAA | 758 - 797 |
| cLas3 | 捕獲 | TACTTGAACGAGACCCACTTTTCTGATGATATTGAACAAC | 1232 - 1271 |
| cLas4 | 捕獲 | ACAAGTTTCTATCTTATTAGCATCTTCCTTCACCTAGTCA | 1367 - 1406 |
| iLas1 | 中間 | GAAAGATTAGTGTGCAGTACAACCTGAGTCACAGCTATGC * | 534 - 573 |
| iLas2 | 中間 | AGAGATATTTATATTAGTAGAAGATTGCTAGGCACATTCA * | 803 - 842 |
| iLas3 | 中間 | AAATGACCAACTTATAATGAAGAACCATCTACGGGACATC * | 1090 - 1129 |
| iLas4 | 中間 | CAGCAAGTATTGGTACCTCAACCACACAACTACTGGGAGA * | 1153 - 1192 |
| cMab1 | 捕獲 | CTCCGTCCAAAATACCCTCACCACTGCCCACAGCCCGTCC | 6619 - 6658 |
| cMab2 | 捕獲 | AGGAACCCTATACAACTTCAGATGCGGTCACTAAGCAAGG | 6766 - 6805 |
| cMab3 | 捕獲 | TTCAGCACCCTCTCTGTATCACTACAAAACACCACCAATT | 6990 - 7029 |
| cMab4 | 捕獲 | AACACTGCCTACTCTGGAGAAAATGAGAACGATTGTGATG | 7440 - 7479 |
| iMab1 | 中間 | CCAACTGATGCCACCACACTCAACACCACAGACCCAAACA * | 6681 - 6720 |
| iMab2 | 中間 | CCCACAACACCACTGCAATCTCTACTAACAACACCTCCAA * | 6943 - 6982 |
| iMab3 | 中間 | CCAACAGGAAATCTTACCACAGCAAAGAGCACTAACAACA * | 7095 - 7134 |
| iMab4 | 中間 | AGGAGGATGACCTGGCAGCAGGGCTCAGTTGGATACCGTT * | 7504 - 7543 |
表1:用於捕獲、中間和PCR的寡核苷酸序列。
*在每個中間寡核苷酸的3'端添加25聚(A)尾。馬伯:馬爾堡病毒;拉斯維加斯:拉沙病毒;
公祭活動:埃博拉病毒;F:向前;R:反向;我:中間寡核苷酸;c:捕獲寡核苷酸
標準的核酸檢測具有極高的敏感性和特異性，但在設計病原體特異性引物和探針時需要對病原體基因組的先驗知識，這在識別新型或轉基因病原體時是一個限製。real-time PCR檢測多種病原體樣本耗時、勞動強度大，且需要生物安全水平較高的設備，阻礙了其在普通臨床的應用。據報道，在人傳人過程中出現了一種基因組發生變化的埃博拉病毒新變種，該基因組變異可能會影響病毒檢測和候選治療方法[22]的效果。利用目前的納米微陣列平台，通過多個捕獲寡核苷酸靶向靶基因的廣泛區域，以及通過招募納米顆粒探針進行靈敏檢測的多個中間寡核苷酸，可以大大改善我們麵臨的挑戰。如前所述，納米微陣列檢測可以直接檢測不到100 fM的純化PCR片段和103.TCID50無靶點擴增的流感病毒RNA樣本單位[23]。在目前的研究中，由於材料的限製，我們無法檢測埃博拉病毒、馬爾堡病毒和拉沙病毒樣本的基因組病毒RNA。
為了控製新出現的生物恐怖主義製劑，如hfv，需要繼續投資於診斷化驗、疫苗和治療製劑的開發。在生物攻擊的情況下，可能會使用多種致命的生物恐怖劑的組合。早期診斷和鑒別作為所使用武器的特定生物劑對於生物恐怖襲擊監測至關重要，以便能夠采取立即應對措施，防止生物劑進一步擴散，降低發病率和死亡率，並盡量減少對公共衛生的經濟影響。因為像埃博拉病毒這樣的HFV病毒會引起常見的非特異性症狀，大量的感染者，特別是那些生活在偏遠地區的人，可能會忽視HFV的診斷，導致許多未報告的病例。為了解決這一問題，我們提出了一種診斷算法，利用納米微陣列和NGS分析平台的組合來識別hfv的未知風險。為確定疑似埃博拉病毒、馬爾堡病毒或拉沙病毒感染的病毒類型，從患者樣本中提取病毒RNA，並使用納米微陣列直接分析，以篩選和確定特定病毒。一旦發現一種新的、新出現的或合並感染的病毒，將進一步進行隨機反轉錄PCR，為陽性樣本生成全基因組擴增子，該擴增子可以在納米微陣列試驗中重新檢測，以確認最初的發現，或送往中心實驗室進行NGS試驗和數據分析，以最終序列確認。該算法可以同時識別、表征和區分多種生物恐怖主義病毒病原體，啟動立即應對措施，防止生物製劑的進一步傳播。通過使用微流體和生物傳感器檢測技術將目前的平台轉化為一種廉價、快速和多重點護理診斷平台，我們可以將納米微芯片檢測技術用於現場測試[24,25]。最佳的檢測方法應包括來自大多數hfv的靶基因，涵蓋其不同類型/分支和其他生物恐怖主義製劑，並易於由未經訓練的外行用戶進行現場樣本檢測，以便作為一種有效的準備工具，快速檢測和應對它們的暴露。 In summary, we have described the development of a nanomicroarray assay to simultaneously detect and distinguish Ebola, Marburg, and Lassa virus infections in a single test. This diagnostic platform could be used to refine current deadly viral surveillance strategies for effective monitoring of these viruses present in circulating populations, early prediction of disease potential, and efficient prevention for improving public health and national security
作者感謝Krishnakumar Devadas和Mohan Haleyurgirisetty博士對手稿的審閱。“這項工作得到FDA醫療對策倡議(MCMi)基金#147-09的支持。”本文中的調查結果和結論尚未由美國食品和藥物管理局正式發布，不應被理解為代表該機構的任何決心或政策。
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引用:趙傑，劉傑，王旭，Hewlett I(2018)利用納米微陣列技術多重檢測生物恐怖主義病原體埃博拉、馬爾堡和拉沙病毒。J新興病毒4(2):dx.doi.org/10.16966/2473-1846.145
版權:©2018趙傑，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。
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