娜戈Zali1Sounak Ghosh Roy1伊曼紐爾Datan1、2傑弗裏·麥克萊恩1、3勞倫·阿爾瓦雷斯1理查德·A·洛克辛1Zahra Zakeri1 *
1美國紐約城市大學皇後學院生物係和研究生中心*通訊作者:美國紐約城市大學皇後學院生物係電話:+1 718 997-3417;電子郵件:zahra_zakeri@hotmail.com
登革熱有五種血清型，這是一種致命的蟲媒病毒，有可能感染一半的人類。被一種以上血清型感染可產生抗體依賴性增強(ADE)，其後果是毀滅性的。我們先前的研究表明，登革2型病毒誘導自噬的能力對受感染細胞的存活和病毒在宿主中的持久性非常重要。在這裏，我們評估了所有4種已知感染人類的登革熱血清型的同源性，發現它們可以觸發犬腎(MDCK)細胞的自噬，並保護受感染細胞免受喜樹堿(CPT)等毒素的傷害。因此，盡管它們的氨基酸序列不同，但它們的功能是相同的。與整個病毒一樣，來自DEN2的NS4A通過激活ATM誘導自噬並保護細胞。這可能是登革熱在急性感染消退後仍在患者中存在的一種手段。所有血清型似乎都使用相同的機製。
登革熱;自噬;自動取款機;LC3;NS4A
的黃二十麵體包膜(+)單鏈(ss) RNA病毒家族是人類和其他哺乳動物嚴重疾病的元凶。這個科包括四個屬，其中最大的，最具臨床相關性的，黃病毒其中大部分是通過蚊子或蜱蟲傳播給人類的。其中蚊子傳播的病毒毒性最強登革熱(DENV——最嚴重的威脅)，西尼羅河病毒(西尼羅河病毒),日本腦炎(JEV)和黃熱病(YFV)[1]。
登革熱在100多個國家流行，近2/3的人口處於危險之中，每年報告病例4000萬例(世衛組織最近的統計數字)，估計造成每人9*109美元的全球衛生保健負擔[2-5]。四種不同抗原血清型(DENV 1-4)和多個亞表型起源於全球不同地區，主要集中在亞太地區[6]。然而，在過去半個世紀中，由於全球貿易、運輸、人類移徙和城市化的增加，特別是出現了衛生質量較差的人口密集地區[7]，這些血清型已廣泛傳播到熱帶和亞熱帶的流行地區。
線性非節段登革熱基因組是一個10.7 kb (+ss) RNA，產生3391個氨基酸長的多聚蛋白，經過病毒(NS2B-3)和細胞蛋白酶的共翻譯和翻譯後處理，生成3個結構蛋白和7個非結構蛋白[8- 11]。成熟的病毒粒子包含由衣殼蛋白和兩種糖蛋白的180個拷貝包圍的遺傳物質。氨基酸端構成結構蛋白:衣殼(C)、膜前體(prM)和包膜(E)，其餘基因組產生非結構蛋白(NS1、2A、2B、3、4A、4B和5)，形成病毒複製複合體(RC)[12,13]。
登革2型病毒可以在幾種細胞中誘導自噬;這種自噬保護細胞並增加病毒複製[14]。PERK通路是自噬的上遊效應子，介導自噬的誘導和保護[15]。共濟失調毛細血管擴張突變(ATM)激酶是一種DNA損傷反應蛋白，它被早期激活，可能激活PERK和自噬，導致感染細胞存活[15,16]。研究較少的非結構蛋白4A (NS4A)誘導自噬類似於完整的登革病毒，和完整的病毒一樣;NS4A保護受感染的細胞免受喜樹堿(CPT)等毒素的傷害，而其他病毒蛋白則不會[14]。ns4a誘導的保護主要在自噬缺乏的細胞中丟失，因此將自噬與黃病毒複製[14]聯係起來。巨自噬是一種回收大分子和細胞器的作用[17,18]，在應激、饑餓或感染的細胞中最為活躍，包括:1)噬球成核(膜的募集);2) LC3II和ATG9蛋白在目標“貨物”周圍吞噬胞膜的擴張;3)細胞膜閉合進入自噬體; 4) Fusion of the autophagosome and lysosome into an autolysosome and 5) Degradation of the cargo and permease-mediated efflux into cytosol [19-21]. The prime mediators of autophagy signaling are sensors of cell energy (AMPK-Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase) and nutrition (mTOR-Mammalian Target of Rapamycin). In a healthy cell, mTOR phosphorylates ULK1 and ATG13, blocking autophagy, whereas the upstream AMPK removes mTOR suppression, inducing autophagy [22-25]. Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM), a nuclear protein, upregulates AMPK and thus autophagy [26,27]. ATM is induced by DNA damage, reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS), and hypoxia and exported from nucleus, blocking the activity of mTOR through a phosphorylation cascade involving AMPK and other enzymes [20,24,26,28-34].
該病毒可以在貌似康複的患者或蚊子細胞中持續存在並傳播，為引發和維持流行病提供了重要手段[35-38]。病毒對受感染細胞的保護為病毒的存活提供了一種手段。在這裏，我們測量了MDCK細胞中不同血清型的持久性。登革病毒1-4可以在培養的細胞中存活長達兩周，這些病毒及其NS4A蛋白雖然氨基酸序列不同，但都能誘導自噬，保護腎上皮細胞免受應激源的傷害，否則應激源會誘導細胞凋亡。因此自噬是設計抗病毒治療的靶點途徑。
本研究的目的是確定所有DENV血清型及其NS4A蛋白共同的促生存機製。由於我們在之前的研究中已經將自噬的誘導與病毒感染的增加聯係起來[14,15]，我們研究了這些血清型感染的細胞中自噬及其上遊調控因子之間的關係。在我們之前的研究[14]中，NS4A被確定為denv誘導自噬的唯一貢獻者，因此我們也測試了來自所有這些血清型的NS4As誘導自噬和保護細胞免受毒素傷害的能力。我們的研究結果為開發針對所有血清型的抗病毒治療提供了重要的線索。
MDCK(由紐約法拉盛皇後學院Anastasia Gregoriades博士贈送)，HeLa: ggf - lc3(由法國維勒瑞夫Gustave-Roussy研究所Guido Kroemer提供)，在37℃Dulbecco最低必要培養基(DMEM)中保存，添加10% FBS, 1%青黴素/鏈黴素。C6/36蚊子細胞(Adolfo Garcia-Sastre，紐約西奈山醫學院，他也提供登革熱病毒和pCAGGS-HA質粒載體)保持在28°C Eagle的最小基本培養基Sigma中，1%非必需氨基酸(Sigma)， 2 mM l -穀氨酰胺和25單位/ml真菌區(Invitrogen)， 50單位/ml青黴素/鏈黴素)，均在5% CO2的空氣中。ATM抑製劑咖啡因(Sigma)在最終濃度為20 μ M時使用，不會引起自噬[39]。喜樹堿(CPT, Sigma)在最終濃度為5µM。細胞在感染前與抑製劑孵育1小時。
除非另有說明，在MOI(感染多重性)=5感染之前，將細胞播種並置於維持培養基中過夜，用1X磷酸緩衝鹽水(PBS)清洗。模擬感染包括用缺乏病毒的病毒培養基進行治療，然後加入新培養基。病毒株用冰冷的黃病毒稀釋液(1X PBS含有0.75%牛血清白蛋白V, pH 8.0)稀釋。稀釋病毒後，細胞孵育2小時。然後用維持培養基覆蓋細胞，孵育直到數據收集。
為了擴大登革熱2型病毒的存儲量，將未融合的C6/36蚊子細胞感染病毒，孵育6天。將培養基攪拌收集，與黃病毒冷凍培養基(0.75%牛血清白蛋白分數V, 0.12 M NaCl, 0.05 M H) 2:1混合3.薄3.， pH 9.0)， -80°C保存。然後用空斑試驗[40]測定病毒載量。計數空斑並測定病毒滴度。每個樣品重複三次。
來自MODOC和DENV 1-4的NS4A在哺乳動物(HeLa, MDCK)細胞中表達pCAGGS-HA質粒向量。topop質粒載體作為陰性對照。細胞被鍍膜至85%彙合，並在添加10%胎牛血清的無青黴素/鏈黴素的細胞類型適宜培養基中附著一夜。細胞轉染使用Lipofectamine 3000係統(賽默飛世爾科學公司)根據製造商的協議。轉染後，細胞在37°C下孵育至少16小時，然後收集或治療。
登革NS4A序列從GenBank (GenBank ID)中獲得:登革1 (AHI43749.1)、登革2 (AHI43753.1)、登革3 (AHL17464.1)和登革4 (AHN50410.1)。Modoc NS4A (NP_740265.2)來源NCBI。根據Mathew, et al.[41]和Trojnar, et al.[42]使用genous Basic 5.0.3軟件進行NS4A蛋白序列比對。采用Jukes Cantor、UPGMA等方法構建係統發育樹。用1000次試驗和111個隨機種子進行了係統發育樹的Bootstrap分析。
細胞被感染，並在24 HPI(感染後小時)暴露於CPT，在37ºC, 5% CO下額外培養24小時2用胰蛋白酶消化法收集，用0.4%台盼藍在1X PBS[43]中染色。活細胞(白色)和死細胞(藍色)用血細胞計計數，細胞活力表示為[(死亡細胞%)-(對照組死亡細胞%)]。
在48 HPI時，細胞用冰冷的1X PBS刮除和洗滌，然後在RIPA緩衝液中收集整個裂解物蛋白，並使用Bio-Rad蛋白測定法和超高譜III分光光度計(GE Healthcare)進行定量。Western blot采用SDS-PAGE [43]， β微管蛋白(Sigma-Aldrich)作為負載對照，LC3B一抗(Sigma-Aldrich)。使用ECL (GE醫療或細胞信號)檢測陽性信號，並使用超膜ECL放射攝影膠片(GE醫療)進行可視化。
細胞被播種到火焰消毒的玻璃蓋上(Globe Scientific Inc.)，讓其附著一夜，並如上所述進行感染和處理。治療/感染後，用1X PBS洗滌細胞，用新鮮、冰冷的4%多聚甲醛(Fisher)固定10分鍾，再次用1X PBS洗滌。然後，用Fluoromount (Sigma)將封麵安裝在玻璃載玻片上(Globe Scientific Inc.)。然後用共聚焦顯微鏡(Leica，德國)或熒光顯微鏡(Leitz)觀察嵌入細胞。
不同血清型登革病毒保護腎細胞並誘導自噬。在四種經過充分研究的登革熱血清型中，我們先前確定了登革2誘導自噬，從而保護細胞免受其他毒素或壓力源[14]誘導的死亡。自噬所提供的保護最有可能是使細胞繼續繁殖並產生登革病毒的機製。我們詢問自噬的誘導和保護是血清型2所特有的，還是這組黃病毒的特征。用MOI=5的登革1、2、3或4感染MDCK細胞24小時，然後用5 μ M CPT挑戰MDCK細胞24小時。必須指出的是，當MDCK感染登革2並監測其傳染性長達3周時，受感染的細胞仍以良好滴度產生成熟病毒(數據未顯示)。我們還觀察到其他血清型如DENV3具有類似的持續性感染(數據未顯示)。如圖1A所示，沒有一種血清型病毒殺死的細胞明顯多於模擬感染的對照組(根據台盼藍試驗測定，48 HPI後死亡率≤10%)。另一方麵，24小時後，CPT殺死約45%的MDCK細胞。然而，感染任何一種登革熱血清型的細胞可將cp誘導的細胞死亡減少到與單獨使用病毒處理相似的數量(+ Den1、2、3、4)。因此，所有4種血清型均可保護MDCK細胞免受CPT誘導的死亡。
圖1:登革病毒的血清型1-4可以保護腎細胞免受喜樹堿的侵害，並增加細胞的自噬。(A)台聚糖藍排除試驗顯示，cpt暴露的MDCK細胞感染登革1-4 (MOI 5, 48 HPI)具有較高的活力，24小時內殺死率從45%降低到5-15%，與單獨感染相當。(B)與模擬感染(Mock)相比，模擬感染和denv感染MDCK的全細胞裂解物的Western blot顯示，任何血清型感染的MDCK細胞中均增加了脂化(16 kDa LC3-II)。β-微管蛋白作為負荷對照。(C)穩定表達GFP-LC3 (HeLa:GFP-LC3)的HeLa細胞在感染任何單一血清型(+Den)後均顯示GFP-LC3點狀細胞形成增加，與內源性LC3-II增加一致，表明自噬增加。右欄是左邊圖片的3X(線性)放大部分，用方框表示。
為了確定感染任何登革熱血清型所提供的保護是否也來自自噬上調，正如之前在登革2[14]中觀察到的那樣，我們通過western blot檢測了內源性LC3-II的數量。48 HPI後，來自未感染和模擬感染細胞的全細胞裂解物顯示模擬感染細胞中低內源性LC3-II，反映了基礎水平(家務)自噬(圖1B)。然而，與模擬感染樣本相比，每一株登革熱病毒的感染都會增加LC3-II(圖1B)。使用穩定表達GFP-LC3 (HeLa: GFPLC3)的HeLa細胞進一步證實了各血清型的自噬誘導作用。在這個係統中，LC3-II在自噬體膜上的易位和積累導致了GFP的點狀分布。模擬感染的HeLa細胞主要表現為彌漫性GFPLC3，很少有LC3-GFP點狀細胞，表明健康細胞典型的低自噬(圖1C)。與登革2病毒的情況一樣，登革1、3和4血清型增加了空洞的形成，表明誘導了自噬(圖1C)，這一結果與western blot的結果一致(圖1B)。我們的結論是，自噬上調和MDCK細胞的保護在幾種登革熱病毒株中是保守的。
NS4A是一種小的疏水蛋白，以前被證明是唯一能夠誘導自噬的黃病毒基因，而自噬反過來又能防止喜樹堿(CPT)、staaurosporine (STS)、環己胺(CHX)等毒素，甚至是a型流感病毒[14]等細胞凋亡的生物誘導劑。
為了確定NS4A(誘導自噬/細胞保護)功能在不同登革熱血清型之間是否共享，我們使用genous Basic 5.0.3軟件程序比較了不同血清型NS4As之間的序列同源性。登革熱血清型中NS4A的氨基酸同源性中等(43%)，高於登革熱和Modoc之間的氨基酸同源性(圖2A和2B比較)。登革病毒1-4 NS4A的係統發育分析顯示，與Modoc病毒相比，登革病毒血清型之間的關係密切(圖2B)，這與黃病毒科這些成員的係統發育相一致。來自所有四種登革熱血清型的NS4A彼此之間的關係比它們與Modoc NS4A的關係更密切。將所有登革熱NS4A和登革熱血清型中每個位點的低替代率進行分組的100%一致支持表明了這一點(圖2B，一致支持度=節點值，每個位點的替代率=水平值)。在登革菌株中，登革1和登革3是姊妹類群，它們是地理上不同的菌株，形成了一個單係進化支，都起源於一個共同的近期祖先[44]。登革1和3 NS4A相關，一致支持度為88.6%，登革2和4聚集在4個毒株中，一致支持度為75.8%。登革熱病毒與Modoc病毒的同源性差，類似於其他遠親黃病毒，包括丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒和西尼羅河病毒，這些病毒通常作為外群[14,45]。
圖2:登革病毒1-4的NS4A蛋白是適度保守的。(A)眾所周知，登革病毒2和Modoc NS4A蛋白均可誘導自噬，其相似性為21%，表明保守性差(綠色=保守氨基酸)。特別是在登革熱中，43%的氨基酸在不同血清型的ns4a中共享。(B)登革熱病毒1-4血清型的NS4A與Modoc的NS4A關係較近。(C)來自所有登革熱血清型的NS4As在HeLa中的瞬時表達:與模擬感染細胞相比，GFP-LC3細胞產生更多的GFPLC3點狀細胞形成和更多的點狀陽性細胞。比例尺表示較大的照片為25 μ m，插圖為10 μ m。
我們檢測了轉染含有登革1、2、3或4 NS4A基因的質粒後，HeLa:GFP-LC3中LC3易位誘導自噬的情況。對照模型轉染(僅質粒載體)的細胞顯示清潔LC3-GFP斑點(圖2C，模擬)。與對照組相比，在大量轉染細胞中，所有登革病毒血清型NS4A均誘導LC3-GFP點狀蛋白形成，表明自噬體形成上調(圖2C + den1 - NS4A)。這些結果和上麵的結果一樣，表明所有血清型NS4A誘導腎細胞和HeLa細胞自噬的能力是保守的。盡管存在差異，但所有DENV血清型中的NS4A和Modoc誘導自噬並保護細胞免受cpt誘導的死亡，其程度幾乎相似[14,46]。
激活的ATM激酶增加自噬並保護被整個登革2病毒[15]感染的細胞。DEN2和MODOC NS4A都能保護MDCK細胞抵抗CPT，與自噬[15]適度增加相關。我們測試了ATM激酶是否會在NS4A過表達的細胞中產生同樣的作用，而不是感染細胞。來自DENV2或Modoc(鼠黃病毒)的NS4A基因被轉染到經過ATM抑製劑咖啡因預處理的MDCK細胞中，含或不含毒素CPT。在NS4A基因存在的情況下，MDCK細胞不受CPT毒性作用的影響;然而，NS4A的這種保護作用被咖啡因部分消除了。與cpt處理和ns4a轉染的細胞相比，在咖啡因存在的情況下，cpt處理和ns4a轉染的細胞的細胞死亡幾乎翻了一番(圖3A)。
圖3:在MDCK細胞中，ATM激酶是ns4a誘導的自噬所必需的，並能預防CPT。(A) MDCK細胞在暴露於CPT、咖啡因或CPT和咖啡因混合前，轉染編碼MODOC和DEN2 NS4A的質粒。病毒基因的過度表達保護細胞免受CPT的侵襲。然而，阻斷ATM激酶(通過咖啡因)降低了這種保護作用。[Mod=Modoc NS4A, Empty= Empty載體](B) HeLa:GFP-LC3細胞在轉染來自所有登革熱血清型的NS4A基因之前，先用咖啡因預處理。如圖2C所示，NS4A過表達誘導自噬。然而，咖啡因抑製GFP-LC3斑點的數量。
接下來我們評估了自噬。我們測試了NS4A蛋白，如完整的DENV2，是否可以介導HeLa: GFP-LC3細胞中atm依賴性自噬。我們先用咖啡因預處理HeLa: GFP-LC3細胞，然後用含有ns4a的質粒轉染它們，如圖2C所示，通過增加GFP-LC3點狀細胞的計數來誘導自噬。咖啡因預處理可顯著減少GFP-LC3小泡的數量。因此，像整個病毒一樣，所有ns4a都誘導自噬(圖3B)並保護cpt處理的細胞，這種反應可以通過咖啡因阻斷ATM激酶部分克服。
黃病毒對人類健康很重要，隨著最近寨卡病毒的出現，以及它可能在無症狀的個體中持續存在，我們需要確定黃病毒存活、複製和在哺乳動物細胞中持續存在的機製。這些病毒在內質網和自噬體等雙膜隔室中複製。我們認為，它們利用自噬途徑在培養的細胞中持續存在，並可能存在於個體中。因此，自噬對病毒存活和持續的重要性需要得到解決。
自噬對登革病毒的致病性有重要影響。DENV2感染激活肝細胞(Huh7)和成纖維細胞(MEF)中依賴atg5的自噬，導致病毒滴度增加。阻止自噬Huh7.a.1BHK21細胞係和AG129小鼠產生了熱敏感和非傳染性登革熱病毒粒子。缺乏自噬相關(ATG)基因或特異性自噬抑製劑，如spautin-1減少登革熱複製，導致對溫度敏感的病毒粒子突變，減少感染細胞的存活[47-49]。然而，自噬和DENV感染之間的關係取決於受感染的細胞類型。在病毒不直接感染的人單核細胞(U937)中，自噬的誘導降低了病毒複製。denv2介導的自噬保護犬腎上皮細胞(MDCK)和小鼠成纖維細胞(MEF)細胞免受毒性刺激，但不能保護小鼠巨噬細胞[14]，其中感染導致凋亡細胞死亡。因此，研究感染對不同來源細胞自噬狀態的影響是很重要的[47-49]。
登革血清型利用NS4A蛋白誘導自噬，至少有一種血清型(DENV2)通過控製自噬上調(ATM、內質網應激和ROS產生)和下調(mTOR)信號來實現這一目的[14,15]。自噬的增加通過限製細胞凋亡的激活增強了對毒性損傷的抵抗力，並促進了病毒的進一步複製。由於pi3k依賴的自噬與增加的細胞存活相關，識別NS4A作為主要因素有助於確定與登革病毒病理相關的途徑。本研究發現，來自所有四種血清型的NS4As通過激活ATM誘導自噬，這可能上調了AMPK-LKB1軸[50]。AMPK蛋白的藥理活性降低了三種黃病毒DENV、WNV和ZIKV的傳染性，表明該蛋白的抗病毒方麵在黃病毒[51]中是保守的。因此，對於denv感染細胞中DDR、內質網應激(UPR/PERK)與促生存內穩態過程(自噬)之間的關係，還需要進行更多的機製研究。在臨床方麵，病毒在看似康複的個體中持續存在，為接觸者的意外感染和未來流行病的出現創造了溫床。大量成熟病毒粒子在感染後3-4周仍存在於受感染的犬腎細胞中(數據未顯示)。病毒在體外存活的能力為研究持久性提供了一種手段在活的有機體內．持久性因細胞類型而異，可能依賴於atm介導的自噬。由於自噬負責增加細胞保護，這可能是一個有用的模型，以研究背後的機製持續感染。
最後，來自不同登革熱血清型的NS4As之間存在同源性(43%)和很強的係統發育關係，表明可能存在誘導MDCK細胞自噬和保護的靶區域，可能被確定為限製NS4A的活性。因此，我們的研究為疫苗設計提供了另一種方法，並將自噬作為設計抗病毒療法的目標途徑。所有血清型的這一共同特征可能被證明是多價治療的靶點。
我們的發現也很重要，因為我們發現了一個共同的途徑(atm誘導自噬)，不僅在不同的DENV血清型和它們的NS4A蛋白之間是保守的。這一結果可能有助於設計一種泛denv療法，其中可以繞過抗體依賴性增強(ADE)等障礙。由於ADE，大多數疫苗對繼發感染無效，在原發感染期間產生的抗體會促進繼發感染。由於我們已經確定了負責病毒持久性和傳染性的特定信號通路，我們的發現可能為傳統疫苗提供一種可行的替代方案——針對病毒利用的代謝靶點的抗病毒治療。
目前的研究為更多地研究被不同血清型感染的細胞之間保守的信號通路鋪平了道路。需要驗證的一個聯係是自噬通量和病毒感染性之間的聯係。雖然我們已經確定了ATM激酶在誘導自噬和保護細胞方麵的作用，但自噬通量是病毒產生所必需的還是僅僅是病毒感染的副產品還有待驗證。未來的研究方向應該是更深入地了解自噬介導的細胞保護對病毒傳染性的影響。
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引用:Zali N, Roy SG, Datan E, McLean J, Alvarez L等(2018)來自4種登革熱血清型的NS4A蛋白，序列差異很大，但通過ATM通路誘導自噬和保護哺乳動物細胞的功能相似。J新興病毒4(2):dx.doi.org/10.16966/2473-1846.144
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