簡介
聯合抗逆轉錄病毒療法(cART)治療人類免疫缺陷病毒(HIV)-1可抑製病毒複製，使HIV-1陽性患者血液中的病毒DNA處於不可檢測的水平，可預防t細胞減少引起的免疫缺陷。然而，在cART方案中斷後，病毒複製很容易在長壽命的儲庫細胞[1]中恢複。由於巨噬細胞是參與病毒儲存庫形成的主要細胞類型，因此了解靜息巨噬細胞的病毒感染模式很重要[2,3]。
病毒蛋白R (衝程體積)是HIV-1的副基因，編碼一種含有96個氨基酸的病毒粒子相關核蛋白，被認為可促進巨噬細胞的病毒感染[4-8]。結構分析表明，Vpr含有3個具有自二聚/寡聚活性的α-螺旋和一個柔性羧基(C)末端區域，該區域包含一段具有dna結合活性的堿性氨基酸[9-11]。Vpr具有多效性，可以多步刺激病毒複製[12,13]。病毒進入靶細胞後，病毒RNA在細胞質[14]中逆轉錄為線性雙鏈DNA (dsDNA)。合成的病毒基因組DNA (vDNA)包裹在病毒蛋白中形成預整合複合物(PIC)，隨後易位到細胞核並整合到宿主染色體中。vDNA的整合步驟由整合酶(integrase, IN)催化，整合酶在vDNA兩端組裝形成鏈轉移複合體，有利於建立持久感染[15,16]。整合的前病毒DNA作為病毒基因轉錄的模板，並與宿主基因組一起繁殖。
Vpr在G2/M期以及多種DNA損傷反應(DDR)，包括組蛋白H2AX磷酸化和多個DNA修複蛋白形成病灶，以及ataxia毛細血管擴張突變(ATM)、ATM和rad3相關(ATR)的激活;中心激酶分別對DNA雙鏈斷裂(DSB)和單鏈斷裂(SSB)/複製應激的響應[17-23]。關於vpr誘導G2/M阻滯促進病毒感染，有人提出Vpr在病毒複製過程中提供了適合病毒基因轉錄的細胞環境和/或延遲細胞死亡[12,13,24]。相反，Vpr在靜息中的生物學重要性(G0/ G1階段)巨噬細胞尚不清楚。史密斯等．等人報道dsb促進HIV-1感染和/或vDNA的整合[8,25,26]。我們還證明了vpr誘導的dsb為vDNA整合[27]提供了位點。雖然Vpr產生的dsb的模式還不清楚，但我們最近發現Vpr改變DNA結構並激活ATM和ATR通路[27]。結果表明，Vpr對dsDNA的解開導致了DNA的超盤繞，拓撲異構酶1 (Topo1)和dsb的積累。值得注意的是，dsDNA的解開招募了複製蛋白A (RPA) 70, RPA複合體的單鏈DNA (ssDNA)結合亞基，激活atr依賴的DDR[28]。由於DSB可能誘導多種細胞反應，包括細胞凋亡和免疫激活，因此vpr誘導的DSB很可能是多種獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)相關症狀的分子基礎。
本文綜述了Vpr與dsb相關的生物學功能，並討論了Vpr作為候選抗hiv -1化合物靶點治療hiv -1陽性患者的潛力。
1.Vpr調節多步驟病毒感染
1一個。反轉錄
HIV顆粒包含病毒蛋白，包括核衣殼(NC)、基質(MA)、IN、逆轉錄酶(RT)、Vif、Vpr和Nef蛋白[12,13]。Vpr通過與Gag[29]的p6結構域結合而被納入病毒顆粒。病毒RNA進入靶細胞後，通過逆轉錄複合體在細胞質中逆轉錄成線性的dsDNA，該複合體包含兩份病毒基因組RNA，以及RT、in、NCp7、MA、Vpr和細胞蛋白[15]。Vpr與逆轉錄複合體結合，並調節HIV-1 RT的數量和質量，這是一種容易出錯的rna依賴DNA聚合酶[15]。如果沒有Vpr，新合成的vDNA突變頻率較高[30,31]。Vpr的質量控製部分依賴於尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG) 2，它從DNA[32]中切除尿嘧啶堿基(圖1)。vDNA合成需要UNG2，因為DNA中的尿嘧啶堿基可能由dUTP的誤摻入或胞嘧啶的脫氨引起。值得注意的是，Vpr與UNG2結合並合並到病毒顆粒中。使用VprW54R-UNG2融合蛋白[32]證實了UNG2參與vpr依賴性突變抑製。Vpr在氨基酸54處的色氨酸殘基對於與UNG2的相互作用及其與病毒顆粒的結合是必不可少的。將VprW54R-UNG2融合蛋白加入病毒顆粒後，vDNA的突變率降低，與Vpr野生型病毒的突變率相當。 Interestingly, however, a catalytically inactive mutant of UNG2 fused to VprW54R also suppressed mutation in cells infected with the Vpr-defective virus. Further analysis revealed that p32, a subunit of the RPA complex that associates with UNG2, prevents mutation of vDNA by a mechanism different from that of UNG2 [32]. Although the precise role of p32 is unclear, it may protect vDNA from host nucleases.
圖1:Vpr參與病毒複製的多個步驟。
HIV-1進入後，與Vpr相關的病毒RNA(藍色波浪線)逆轉錄成雙鏈vDNA(黑色和紅色波浪線)。Vpr通過與輸入素-α (Imp-α)相互作用促進vDNA的結合。Vpr通過利用細胞轉錄因子促進LTR的病毒基因(或基因組RNA)轉錄。轉錄的基因組RNA被合並到新的病毒粒子中。此時Vpr將UNG2(和RPA32)轉移到新的病毒粒上，抑製了後續逆轉錄的突變率頻率。相反，Vpr促進蛋白酶體介導的UNG2降解。細胞外Vpr刺激TLR4/MyD88通路，激活IKK，繼而NFκB核轉位。Vpr除與TLR4結合外，還通過與TAK1相互作用直接激活NFκB。Vpr通過與ANT/VDAC結合，誘導cyt c從線粒體膜間隙釋放到細胞質。Apaf-1和cyt - c(凋亡體)複合物激活capspase-9，-3依賴性凋亡細胞死亡。 This intrinsic apoptosis induction is facilitated by Bax expression, while Vpr is known to downregulated Bax by inhibiting p53 activity. A part of figure was generated through the use of QIAGEN’s Ingenuity® Pathway Analysis (IPA®, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity).
相反，UNG2抑製vDNA合成[33-35]。UNG2將apobec3g誘導的脫氨胞嘧啶轉化為一個堿基位點，導致嘌呤/嘧啶核酸內切酶裂解。因此，Vpr誘導UNG2的蛋白酶體降解。UNG2在病毒複製中的作用存在爭議，但Vpr通過調節UNG2的這兩種功能來促進vDNA的合成。
Gleenberg等．據報道，Vpr通過直接與RT[36]相互作用來幹擾逆轉錄，而Lyonnais等．觀察到Vpr誘導合成DNA的橋接和凝結，促進其核輸入[37]。雖然Vpr和RT的生物學重要性還不完全清楚，但Vpr、RT和IN之間的密切功能聯係可能將逆轉錄和核輸入聯係起來，然後是染色體整合。
1 b。核輸入和長端重複的再活化
Vpr可促進HIV-1在靜息巨噬細胞中的複製，但對於病毒在增殖細胞中的複製是可有可無的[4-8]。在靜息狀態的巨噬細胞中，vDNA必須獨立於細胞分裂並在不破壞核膜的情況下導入細胞核。vDNA與病毒和宿主蛋白質結合形成PIC。據報道，在PIC中存在的四種病毒蛋白(RT、in、MA和Vpr)中，Vpr通過直接與輸入素-α結合來促進PIC的核輸入[38,39](圖1)。或者，Vpr可能使用依賴於輸出素-1的核輸出信號[40]在細胞質和細胞核之間穿梭。Vpr的核質穿梭不僅需要Vpr摻入新產生的病毒粒子，而且還需要在組織巨噬細胞中有效複製HIV-1。Vpr與核孔複合物結合，尤其是核孔蛋白p54、p58和hCG1，並在核膜中積累[41,42]。有趣的是，HIV-1 DNA的整合發生在靠近核孔的細胞核中，在那裏一係列細胞基因具有轉錄活性[43,44]。確定Vpr是否通過與核孔複合物相互作用來調節vDNA整合到轉錄活性染色質是很重要的，因為病毒整合時的染色質狀態是HIV-1[45]生命周期的關鍵決定因素。
Vpr激活HIV-1的長末端重複序列(LTR)，促進病毒複製和發病[12,13,46](圖1)。Vpr最初被報道可以重新激活潛伏的前病毒DNA，隨後在HIV-1 LTR[46]的U3區域發現了幾種激活元件- NF- at、糖皮質激素反應元件(GREs)、NF-κB、Sp1、活化反應元件和TATA盒子。Vpr與Sp1-DNA複合物相互作用，並可能通過穩定sp1 -啟動子複合物[47]來轉激活sp1結合啟動子。莎瓦亞等．報道Vpr以Sp1依賴的方式激活LTR，而p53抑製LTR[48]的激活。此外，Vpr抑製p53的轉錄活性，被認為可以促進hiv -1感染細胞的複製而不誘導凋亡[48]。Vpr結合並增強幾種轉錄因子的活性，如。糖皮質激素受體(GR)、轉錄因子IIB和p300[12,13,46]。Vpr與GR複合物，並以依賴於Vpr[49]氨基酸64-68(螺旋-2)的LXXLL GR結合基序的方式激活HIV-1 LTR和含有GR的啟動子。此外，Vpr與p300和TFIIH的聯合可誘導GRE激活[50]。此外，Vpr形成了Vpr - gr - poly (adp -核糖)聚合酶-1 (PARP-1)的三級複合體，並通過阻止NF-κB[51]的共激活物PARP-1的核定位來抑製NF-κB。然而，據報道，Vpr通過增強TAK1和IKK的磷酸化來激活NF-κB。這些發現表明Vpr通過調節NF-κB活性促進病毒複製[52,53]。
Vpr在病毒感染和複製過程中激活LTR。星野等．細胞外Vpr以TLR4/ myd88依賴的方式激活NF-κB，並誘導IL-6的產生，隨後潛伏期HIV-1[54]的再激活。Vpr通過促進組蛋白去乙酰酶1和3的蛋白酶體降解，誘導潛伏感染細胞中LTR的再激活，從而導致病毒基因的沉默[55,56]。
此外，Vpr與Tat合作，通過同時占據LTR[57]內的多個結合位點來激活HIV1 LTR。值得注意的是，Vpr而不是Tat增強了未整合vDNA的Nef表達，這表明Vpr在病毒感染[58]的早期階段發揮了作用。
1 c。細胞凋亡誘導
Vpr通過其c端與滲透性過渡孔複合物(PTPC)的兩個候選因子:腺嘌呤核苷酸易位器(ANT)和電壓依賴性陰離子通道(VDAC)相關，從而破壞線粒體功能並激活內在凋亡通路(圖1)等．報道了合成Vpr通過PTPC[59]誘導線粒體膜通透。此外，Vpr的c端與Bax合作，增加含ant脂質體的滲透性。vpr誘導的線粒體膜通透性導致細胞色素c (cyt c)從膜間隙釋放。由此產生的由cyt c、dATP、Apaf-1和procaspase-9組成的凋亡小體激活procaspase-9和-3，介導凋亡DNA的斷裂。雖然提出了一個明確的凋亡級聯在體外data [59]， Vpr可能扮演不同的角色在活的有機體內因為Vpr與DNA或RNA[59]預孵育可以阻止Vpr誘導的細胞凋亡。安德森等．報道了vv誘導的凋亡細胞死亡依賴於Bax，而不是ANT[60]。此外，Bax的激活需要DDR的激活，這涉及到atr介導的BRCA1磷酸化和隨後的GADD45α的上調[61]。然而，bax介導的凋亡是否與vpr誘導的DDR激活耦合存在爭議。相比之下，孔蒂等．據報道，低水平Vpr通過上調Bcl-2和下調Bax在CD4+ t細胞係中發揮抗凋亡作用[62]。因此，Vpr在不同細胞類型中的作用值得進一步研究。
1 d。Vpr調節免疫反應
Vpr直接或間接地調節免疫反應。受感染細胞分泌的外源性Vpr通過誘導凋亡和細胞周期阻滯抑製免疫應答[12,13]。在間接作用方麵，Vpr增加樹突狀細胞中TNF-α的表達，導致CD8+ t細胞凋亡[63]。此外，Vpr在CD4+ T細胞中上調了獨特長16結合蛋白1和2 (ULBP1/2)，它們是自然殺傷細胞2族成員D (NKG2D)的配體，同時也激活了ATR激酶[64-66](圖2)。ULBP1/2的上調增加了NK細胞的細胞溶解活性，促進了被感染細胞的清除。相反，Vpr影響的CD4+ T細胞中TGF-β和IL-12產量的增加和減少，分別通過下調CD107α和幹擾素(IFN)-γ來抑製NK細胞的活性[67,68](圖2)。Vpr對免疫係統具有複雜的影響，其對清除感染細胞的影響有待進一步研究，以了解Vpr在T細胞衰竭中的作用。
圖2:Vpr同時調節細胞內和細胞外環境
HIV-1感染巨噬細胞可激活cGAS/STING和NFκB, Vpr可增強其活性。ISGs的上調導致組織炎症。此外，Vpr可誘導葡萄糖和穀氨酸代謝異常。細胞外穀氨酸濃度升高表現神經毒性作用，可誘導神經細胞死亡。通過HIV-1感染CD4+ t細胞，ATR活性以Vpr依賴方式升高。ATR激活誘導了NKG2D配體ULBP1/2的上調，從而增加了nk細胞的細胞毒活性，而Vpr則異常調節了hiv -1感染的CD4+ t細胞細胞因子的產生。因此，Vpr抑製nk細胞的活性，其特征是CD107α和IFNγ的表達減少。TGF-β，一種免疫抑製因子;IL-12，一種免疫刺激細胞因子。部分圖是通過使用QIAGEN公司的匠心®路徑分析(IPA®，QIAGEN紅木城，www.qiagen.com/ingenuity)生成的。
單核細胞來源的巨噬細胞和樹突狀細胞的轉錄組分析顯示，Vpr通過上調ifn刺激基因(ISGs)來影響細胞免疫應答:MX1、MX2、ISG15、ISG20、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFI27、IFI44L和TNFSF10[67,70](圖2)。重要的是，在CD4+細胞中，Vpr增加了由cgas依賴的HIV-1 DNA感應誘導的I型ifn和ISGs的表達，這可能有助於高免疫激活和艾滋病的進展[71]。有趣的是，用重組Vpr處理小鼠巨噬細胞樣細胞，通過激活cGAS/STING通路和動員長插入元件-1 (LINE-1)，一種豐富的內源性逆轉錄轉座子，誘導IFN-β的產生[72]。在單核細胞來源的巨噬細胞中，Vpr調節蛋白的蛋白質組學分析顯示Vpr幹擾葡萄糖和穀氨酸代謝[73]。Vpr通過增加丙酮酸激酶肌2型的表達來調節糖酵解途徑，丙酮酸激酶肌2型磷酸化STAT3的酪氨酸705，進而上調HIV-1 LTR[73]。值得注意的是，穀氨酸代謝失調，包括穀氨酸脫氫酶2的下調和穀氨酰胺酶C的上調，可能通過穀氨酸的神經毒性作用與hiv相關的神經認知障礙(HAND)有關[74](圖2)。再加上它對神經元的促凋亡作用，這些結果表明Vpr是一種新型治療策略的靶點[75-80]。
2.G2/M期與DNA損傷反應的激活
細胞具有複雜的DNA損傷反應係統，以抵消外源性和內源性DNA損傷的細胞毒性作用，包括DNA單鏈或雙鏈斷裂、化學修飾和複製應激。在眾多的DDR參與者中，ATM、ATR和DNA- pkcs (DNA依賴蛋白激酶催化亞基)作為最上遊的激酶，並激活下遊事件，包括修複DNA損傷和激活細胞周期檢查點[23]。逆轉錄病毒整合和DDR之間的關係最初是由Daniel研究的等．(81、82)。IN通過將vDNA的3 '端轉移到缺口的宿主基因組DNA中來催化vDNA的整合，因為IN誘導的兩側DNA鏈上的缺口被細胞DNA修複機製識別為dsb[15,81,82]。鑒於vDNA與宿主DNA的連接需要處理DNA末端，逆轉錄病毒DNA的整合必須涉及宿主DNA修複途徑，這在FEN1去除皮瓣DNA鏈的過程中觀察到[83]。此外，大量證據表明細胞DSB修複通路的作用不可或缺。依賴於dnapk的非同源端連接的DSB修複是vDNA整合和感染細胞存活所必需的[84]。劉等．據報道，ATM活性是hiv -1感染的CD4+ T細胞存活所必需的[85]。數據表明，微同源性介導的末端連接(即在dsb末端使用短的同源DNA序列補丁)參與vDNA的整合或新生成的dsb的修複[86]。
重要的是，外部因素誘導的DNA損傷增加了病毒的傳染性，特別是在靜止細胞(包括靜息巨噬細胞)中[8,25,26]。HIV-1 LTR在G2階段，這意味著vpr誘導的細胞周期阻滯優化了病毒複製的細胞環境[12,13,24]。然而，HIV-1輔助蛋白Vif可誘導G2 /M細胞周期阻滯，這表明通過誘導DDR促進病毒感染並非Vpr所獨有[87]。此外，vpr誘導的DDR在靜息巨噬細胞中的生物學重要性尚不清楚，因為這些細胞位於G0/ G1並表達低水平ATR和Chk1[21]。Smith等人報道dsb促進HIV-1感染和/或vDNA的整合[8,25,26]。我們還報道了DNA損傷劑促進靜息細胞的病毒感染[8,27]。此外，DSB位點可以為vDNA的整合提供平台，從而促進vDNA的整合[8,27]。值得注意的是，即使是缺乏in活性的in - d64a突變病毒也能整合到DSB位點。雖然dsb引導的病毒整合在整個病毒感染中是一個小群體，但它可能阻礙cART完全消除病毒[8,27]。
2 a。ATR激活與vpr誘導的泛素化
Vpr最初被報道抑製HIV-1感染的T細胞在G2CDC2是一種周期蛋白依賴的激酶，與周期蛋白B複合[88]。vpr誘導的細胞周期阻滯依賴於ATR激酶，並伴有典型DDR的激活，包括組蛋白H2AX的磷酸化和BRCA1、53BP1、RAD51和FANCD2位點的形成[17-22,89]。雖然Vpr誘導了DDR，包括DSB修複蛋白的焦點形成和RPA的積累[21,27]，但ATR最被強調的是接近Vpr誘導的DDR模式，因為ATM在Vpr誘導的G中不是必需的2/M arrest[21]。
vpp誘導的DDR需要vpp結合蛋白(VprBP)/ DNA損傷結合蛋白1 (DDB1) (cullin e3 -泛素連接酶複合物的組成部分)使細胞蛋白泛素化[90-93]。VprBP或DDB1的缺失可以消除Vpr誘導的DDR激活，Vpr的Q65R突變體不能與VprBP結合，因此沒有誘導DDR[90,91]。Belzile等．據報道，vpr誘導的DDR需要k48鏈接的細胞蛋白泛素化，這表明在蛋白酶體降解中起著關鍵作用[93]。盡管做了很多努力，但導致vpr誘導的DDR的因素和vpr依賴泛素化的真實靶點尚不清楚。UNG2首次被確定為ddr相關因子，可被vpr誘導的泛素化降解[94]。由於UNG2介導堿基切除修複，vpr誘導的UNG2降解可能會增加DNA損傷的程度[94]。這種情況適用於螺旋狀轉錄因子(helicaselike transcription factor, HTLF)，一種參與修複受損複製叉的轉位酶[95]。Klockow等．據報道，rna誘導沉默複合體(RISC)的一種核酸內切酶亞基Dicer可能抑製病毒複製，是vpr誘導泛素化的候選靶點[96]。DNA損傷後，RISC立即生成小rna並激活DDR[97-99]。因此，如果RISC係統被Vpr破壞，DNA損傷將會增加。此外，端粒酶的RT亞基端粒酶逆轉錄酶可能是vpr誘導泛素化的靶點[100]。如果是這樣，Vpr可能破壞端粒DNA的穩定。在vpr表達細胞中觀察到，這種vpr誘導的端粒DNA不穩定性可能與染色體斷裂/融合/橋周期有關[101]。
2 b。複製fork和SLX4參與v生成的DDR
最近，我們發現SLX4是Vpr結合因子，從而提高了對Vpr功能的認識[89]。SLX4是一種結構特異性內切酶，與Mus81/Eme1複合物，在DNA複製和重組中間產物的分解中發揮作用[102,103]。因此，SLX4的下調誘導了DDR，這是DNA損傷積累的結果。相反，Laguette等人提出SLX4複合物被Vpr過早激活，並通過切割DNA鏈直接誘導DDR[89]。除了DDR激活外，vpr激活的SLX4還降解過量的vDNA，以阻止細胞免疫感應的激活，促進病毒複製[89]。
vpr誘導的DDR可能涉及DNA複製，因為後者類似於DNA合成抑製劑羥基脲和aphidicolin[21]引起的DDR。事實上，vpr誘導的DDR依賴於ATR, ATR是一種在DNA複製過程中被rpa包裹的ssDNA激活的激酶。有趣的是,吉普賽等．小染色體維持(MCM) 10是MCM複合體的一個組成部分，在DNA複製起始和鏈延伸中起作用，被認為是Vpr的一個新靶點[104]。他們證明Vpr誘導MCM10的蛋白酶體降解是Vpr誘導細胞周期阻滯的必要步驟。
3.vpr誘導的DDR和dsb的集成模式
Vpr誘導細胞周期在G2/M期通過atr依賴的DDR激活[17,21]，DDB1/ vprbp依賴的泛素化[90-93]，停滯複製的[21]，以及RPA和SLX4的募集[21,27,89]。然而，導致這些細胞反應的關鍵分子事件尚不清楚。我們發現Vpr改變了dsDNA的結構，這可能揭示了這些因素之間的聯係。我們的研究結果概述如下(圖3)。
圖3:vpr誘發DDR和DSB的模式
首先，Vpr結合並解開dsDNA。dsDNA的部分解開促進了RPA70的加載，從而激活atr依賴的DDR。然後，vpr誘導組蛋白H2B泛素化引起染色質重塑，促進RPA70的加載，導致ATR通路充分激活。另一方麵，dsDNA的解開積累了DNA的超盤繞，它招募Topo1進行鬆弛。Topo1的過量積累誘導Topo1和DNA的共價複合物，其中複製和/或轉錄機製發生碰撞，並誘導DSB。vpr誘導的DSB被vDNA整合靶向。SLX4參與了停滯複製叉的分解和topo1結合DNA的切除，從而導致DDR。此外，SLX4是降解過量vDNA以逃離cGAS/ sting免疫感應所必需的。部分圖是通過使用QIAGEN公司的匠心®路徑分析(IPA®，QIAGEN紅木城，www.qiagen.com/ingenuity)生成的。
3 a。dsDNA的解開是vproduce DDR的第一步
首先，原子力顯微鏡和超線圈294實驗顯示Vpr誘導了超線圈DNA[27]的形態變化。突變分析表明Vpr c末端的4個精氨酸是拓撲變化所必需的。此外，Vpr通過解開dsDNA，誘導RPA70加載到dsDNA上(圖3)。這些發現支持了我們的假設，即Vpr對dsDNA的結構改變觸發了rpa依賴的ATR激活。
為了證明Vpr在細胞中發揮類似的作用，我們在人類細胞中使用了LacO/ LacI係統[105,106]。使用該係統，lacr融合Vpr可以被拴到包含LacO陣列[27]的染色體區域。我們首先分析了Vpr是否使用補骨脂素來解開相應區域，補骨脂素是一種DNA插層交聯劑，優先與負超螺旋DNA結合[107,108]。lacrufused Vpr以c端拉伸依賴的方式增加了dsDNA在LacO重複序列上的解開。接下來，我們用染色質免疫沉澱法分析了RPA70在LacO重複序列上的積累。結果表明，RPA70的積累也依賴於Vpr的c端延伸。由於rpa包裹的ssDNA的形成觸發ATR激活，vpr誘導的dsDNA解開可能導致DDR激活。
3 b。Vpr誘導DSB的機製
在體外Vpr增加了DNA的超卷曲。超盤狀DNA的積累招募Topo1，通過切割/結紮周期放鬆超盤狀DNA，調節DNA複製、轉錄和修複[109]。Topo1的過量積累導致Topo1與DNA共價複合物(Topo1- cc)的穩定形成，通過與複製叉或轉錄機製碰撞誘導dsb[110]。在靜止細胞中，dsb可能是由後一種機製誘導的。
正如預期的那樣，Topo1-cc在表達Vpr的細胞中積累(圖3)。一致地，Vpr表達以topo1依賴的方式增加了dsb的數量[27]。使用LacO/LacI係統，我們證明了Topo1-cc和dsb聚集在Vpr-tethered LacO重複序列上。此外，vDNA被整合在v產生的DSB位點上，這表明Vpr在提供vDNA整合位點方麵發揮了作用。vpr定向病毒整合的重要性尚不清楚，因為它隻占HIV-1總感染的一小部分。vpr導向的病毒整合可能會影響整合位點的選擇。因此，Vpr通過與HP1相互作用而在著絲粒上積累是有趣的[111]，因為這些區域的異色狀態可能有助於潛伏的病毒感染[112,113]。
與之前的報道一致，Topo1功能障礙導致轉錄過程中DNA/RNA雜化(R-loop)的形成[114]，Vpr的表達促進了R-loop[27]的積累。此外，RNaseH1的過表達降低了Vpr對DDR的激活。雖然vpr誘導的Topo1-cc積累機製尚不清楚，但由於線粒體功能障礙，vpr誘導的DNA負超盤繞和/或活性氧的產生可能會增加Topo1-cc的自發生成。DNA的氧化修飾在連接步驟捕獲Topo1-DNA複合物[115]。
3 c。組蛋白H2B是vpr依賴性泛素化的候選靶點
我們利用光漂白實驗後熒光恢複的GFPtagged histone H2B，分析了組蛋白H2B在染色質中的遷移能力[27116]。Vpr表達野生型，而不是泛素化缺陷突變體(Q65R)，顯著增加了組蛋白H2B的流動性(圖3)。有趣的是，Q65R在RPA70加載方麵有缺陷，但在dsDNA解開方麵有能力。Vpr始終誘導組蛋白H2B賴氨酸120的泛素化，賴氨酸120是DDB1/ vprbp依賴修飾的目標殘基[27,117]。最後，在表達Vpr Q65R突變體的細胞中，用誘導染色質鬆弛的曲古黴素A處理可以恢複RPA70的缺陷負載[27118]。這些數據表明，組蛋白H2B是vpr依賴性泛素化的靶點，組蛋白H2B泛素化後的染色質重構促進了染色質的RPA負載。
3 d。SXL4參與vpr誘導的DSB, Topo1是靜息巨噬細胞中vDNA整合所必需的
在形成Topo1-cc之後，激活SLX4，通過其核酸內切酶活性解決了停滯的複製叉，並去除Topo1-cc[102,103](圖3)。由於Topo1調控失調產生的r -環通過核苷酸切除修複誘導dsb和atm依賴的DDR[109,110,114,119]。這也發生在靜息巨噬細胞中，不表達ATR/Chk1[21]。事實上，單核細胞來源的巨噬細胞中Topo1的下調減弱了vpr介導的病毒傳染性增強[27]。這些觀察結果表明Topo1-cc與Vpr在靜息巨噬細胞中的作用有關。雖然Vpr誘導dsb和ATM依賴的DDR[8,11,22,27,120]，但ATM激活的參與在Vpr誘導的DDR中被忽略了，因為ATR活性在Vpr誘導的DDR中更強，並且Vpr誘導的細胞周期異常通過下調ATR[21]而減弱。目前的數據清楚地表明，dsb和ATM激活對於理解Vpr[27]的功能非常重要。
未來的視角
在後art時代，艾滋病的進展可以被抑製，但hiv -1感染者仍然容易發生相關的各種並發症，如HAND和惡性腫瘤[121-123]。這是由於存在cart -難治避難所，包括腸道相關淋巴組織、淋巴結、組織巨噬細胞和中樞神經係統[2,3]。在這些避難所中，病毒複製是流產的但持續的，並且幾種病毒蛋白，包括Vpr，可能會持續產生。事實上，據報道，cART患者的血清中Vpr含量高達數百ng/mL[124-126]。值得注意的是，血清中的可溶性Vpr具有生物活性，並誘導LINE-1的逆轉錄轉位[126]。由此可見，Vpr以涉及Topo1的方式誘導dsb，可溶性Vpr誘導Topo1-cc和dsb[27]的形成。
topo1介導的DNA損傷可能是幾種神經退行性疾病的原因[127]，這表明Vpr參與了HAND的發展。此外，hiv -1陽性患者淋巴瘤的發病率很高[121]。由於血清中的Vpr誘導血細胞中的dsb，它可能是惡性腫瘤發展的危險因素。有趣的是，Vpr可誘導CD4+ T細胞中NKG2D配體的表達[64-66]。此外，DDR上調了NKG2D配體的表達[128]，這意味著可溶性Vpr參與了細胞介導免疫的擾動。包括PD-L1在內的免疫檢查點分子的表達因DNA損傷以ATM/ATR/ chk1依賴的方式上調[129]，支持Vpr在hiv相關癌症發展中的作用。雖然Vpr在增殖淋巴細胞的病毒整合中是可有可無的[5-8]，但Vpr抑製細胞凋亡和免疫反應可阻止感染細胞的清除，導致惡性轉化[12,13]。因此，Vpr是開發新型抗hiv -1藥物的目標，旨在改善hiv感染者的生活質量。
致謝
這項工作得到了JSPS KAKENHI資助號JP26860313的部分支持，國家全球健康和醫學中心的研究資助(25A-108)和(21A-129)。
利益衝突
作者宣稱他們沒有利益衝突
作者的貢獻
kii和yi寫了論文。所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。
用於搜索和選擇信息的方法
PubMed幾乎用於檢索包括“Vpr”的詞條的文獻
