圖1:GAG序列的係統發育——從RVGC中提取了28個非冗餘GAG序列(見方法)。利用距離矩陣近鄰連接算法構建了係統發育。GAG序列被劃分為三個不同的分支。與對照相比，在MS中過表達的GAG序列由RNA-seq確定，以紅色字體顯示。
全文
Bhetariya PJ1 *Kriesel JD1費舍爾KF2
1美國猶他州鹽湖城猶他大學醫學院傳染病科內科2美國猶他州鹽湖城猶他大學醫學院病理學係
*通訊作者:美國猶他州鹽湖城猶他大學醫學院傳染病科內科Preetida J Bhetariya電話:801 - 585 - 7314;電子郵件:preetida.bhetariya@utah.edu
背景:研究表明，人內源性逆轉錄病毒(HERVs)與多發性硬化症(MS)的發病機製有關。本研究的目的是廣泛評估MS患者患病腦白質樣本中HERV核心(GAG)和包膜(ENV)基因的表達，並與正常對照進行比較。
方法:檢索到28個HERV GAG基因序列和88個ENV基因序列，按係統發育進行分類，並分組為支。針對每個分支設計一致qPCR引物，對33個MS和9個正常對照冷凍腦樣本進行定量PCR。MS樣本包括慢性進展(n=5)、原發性進展(n=4)、繼發性進展(n=14)、複發緩解(n=3)和未分類的MS確診病例(n=7)。使用神經元內參基因RPL19對每個樣本中的GAG和ENV RNA水平進行定量和歸一化。分析MS與對照組的表達差異。
結果:與對照組相比，與HERV-E和HERV-K對應的GAG分支1A、3B和3C表達量顯著增加，而GAG分支3A表達量降低。MS組HERV ENV分支2、3A、3B的表達量顯著增加，對應於RTVL、HERV- e、HERV- k和MSRV (HERV- w)。但MS組與對照組的相對表達差異較小，差異小於1.5倍。
結論:MS組HERV-E、RTVL和HERV-K10家族的GAG和ENV表達明顯增加。但MS組與對照組的相對表達差異較小，差異小於1.5倍。這些結果表明，在這些冷凍腦樣本中，HERV GAG和ENV區域的表達在MS和對照組之間沒有太大的差異。
人類內源性逆轉錄病毒;HERV;qPCR;多發性硬化;原發性進行性多發性硬化;嘔吐;信封;基因表達
多發性硬化症(MS)是一種自身免疫性疾病，其特征是大腦和脊髓的多處病變伴有斑塊。這種疾病與一種炎症過程有關，這種炎症過程攻擊並破壞了大腦和脊髓軸突周圍的髓鞘。多發性硬化症的病因尚不清楚，盡管這種疾病被認為是由環境因素在易感遺傳背景下作用引發的。全基因組關聯研究(GWAS)已經確定了許多易感位點，主要與免疫過程[1]相關。人白細胞抗原(HLA)免疫基因簇，特別是HLA- drb1 *1501，是本病的主要遺傳危險因素[2,3]。
根據多發性硬化症的流行病學，包括地理模式、孤立的暴發和遷移研究，病毒長期以來一直被懷疑是病因[4-6]。目前還沒有直接證據表明外源性逆轉錄病毒參與了MS，但內源性逆轉錄病毒可能是MS發病的一個重要因素。逆轉錄病毒在MS發病機製中發揮作用的可能性從20世紀80年代就開始被考慮，當時Perron在從MS患者的輕腦膜細胞中顯示了逆轉錄酶(RT)活性和逆轉錄病毒顆粒[7-10]。從那時起，根據Douville RN, Nath A[11]的評論，在MS患者的血液、腦脊液和腦組織中檢測到herv。人類內源性逆轉錄病毒(HERVs)是人類基因組的一部分，約有98000個ERV元素和片段[12-14]。據信，herv是史前外源性逆轉錄病毒的殘餘，在進化過程中通過種係感染[15]整合到人類基因組中。在中樞神經係統中已經檢測到來自HERV-W家族的幾種基因轉錄本和蛋白質，它們與神經炎症有關[16- 18]。自身免疫性疾病[19]患者的人血清中可檢測到與來自herv的GAG或ENV抗原反應的抗體，且抗體水平升高。
此前，我們對冷凍人腦標本進行了RNA-seq，結果顯示，在進展性MS與正常對照之間，某些HERV結構域的表達存在統計學上的顯著差異[20,21]。重要的是，這種信號的檢測需要使用一種被稱為“綜合映射”的生物信息學方法，該方法將所有可檢測到的對齊計數到給定的測序讀數，而不僅僅是最特定的匹配。此外，按結構域聚合測序hit提示GAG(核心)和ENV(包膜)結構域的表達與MS疾病過程相關。這項研究的目的是量化選定的HERV GAG和ENV結構域在MS患者冷凍冷凍保存的大腦樣本中的表達，並與正常對照進行比較。在這裏，我們進行了幾個qPCR實驗，以了解HERV GAG和ENV基因的整體表達情況，它們被分為多個HERV分支。
材料和方法
一個大腦標本。
從落基山MS中心組織庫(Westminster, CO, USA)和加州大學洛杉磯分校人腦和脊髓液資源中心(Los Angeles, CA, USA)獲得MS斑塊的低溫保存白質(N=33)和無任何腦部疾病患者的正常白質對照腦標本(N=9)。MS樣品包括;慢性進展性MS (CPMS, n=5)，原發性進展性MS (PPMS, n=4)，繼發性進展性MS (SPMS, n=14)，複發緩解性MS (RRMS, n=3)。無臨床亞型的MS確診病例(未分類MS, n=7)也納入了共33例MS樣本的研究。這些標本以及伴隨的臨床和病理信息(表1)在裝運前被去鑒別。該研究計劃已提交給猶他大學健康科學中心IRB進行審查。由於該研究隻涉及未被識別的屍檢材料，因此被發現不受IRB的審查和監督(IRB #00028658)。
| 集團 | 標本 | 采購經理人指數 | 年齡 | 性 | 收集一年 | 臨床病史/ MS類型 | 樣品的位置 |
| 正常對照組 | 5 | 2 | 55 | F | 1989 | NA | 大腦 |
| 202 * | 4 | 57 | 米 | 1983 | 術後感染 | 大腦 | |
| 214 * | 4 | 56 | 米 | 1981 | 心髒病 | 大腦 | |
| 3236 | 16 | 67 | 米 | 2002 | 食道癌 | 額WM | |
| 3276 * | 19 | 54 | 米 | 2002 | 心髒病 | 額WM | |
| 33 * | 5 | 69 | 米 | 1983 | 肺部疾病 | 大腦 | |
| 3371 * | 16 | 52 | 米 | 2002 | 肺癌 | 額WM | |
| 3348 * | 9 | 76 | F | 2002 | 心髒病、糖尿病 | 額WM | |
| 3540 | 11 | 68 | 米 | 2003 | 肺癌 | 額WM | |
| 女士 | 159 | NA | 53 | 米 | 1983 | 慢性進行性 | WM |
| 164 | NA | NA | 米 | 1983 | 不保密的 | WM | |
| 216 | 5 | 71 | F | 2003 | 不保密的 | WM | |
| 2096 | NA | NA | 米 | NA | 二次進步 | 室周的WM | |
| 2485 * | 9 | 69 | 米 | 1997 | 主要的進步 | 額WM | |
| 2696 * | 21 | 86 | F | 1998 | 主要的進步 | 室周的WM | |
| 2742 | 17 | 60 | 米 | 1998 | 主要的進步 | 室周的WM,小腦 | |
| 2743 | 23 | 59 | F | 1998 | 二次進步 | 皮層下WM | |
| 2758 | NA | 60 | 米 | 1999 | 二次進步 | 室周的WM | |
| 2778 | 39 | 61 | F | 1998 | 二次進步 | WM,顳葉皮層 | |
| 2800 | 9 | 64 | F | 1998 | 二次進步 | WM,額葉皮層 | |
| 2946 * | NA | 59 | 米 | 1999 | 二次進步 | 室周WM，頂葉 | |
| 2966 | NA | 55 | F | 2000 | 二次進步 | 室周的WM | |
| 3010 | NA | 49 | F | 2000 | 二次進步 | 額葉WM，額葉 | |
| 3056 | 10 | 61 | 米 | 2000 | 複發彙款 | WM,額葉皮層 | |
| 3093 | 18 | 68 | 米 | 2000 | 不保密的 | 腦室周圍WM，基底神經節 | |
| 3161 * | 20. | 51 | F | 2001 | 二次進步 | WM, frontal-parietal | |
| 3250 | 17 | 75 | 米 | 2002 | 二次進步 | 室周的WM | |
| 3289 | 29 | 54 | F | 2001 | 不保密的 | 室周的WM | |
| 3413 | 10 | 38 | F | 2002 | 複發彙款 | 室周的WM | |
| 3422 | 12 | 62 | 米 | 2002 | 複發彙款 | 室周的WM,小腦 | |
| 3474 | 9 | 70 | F | 2002 | 慢性進行性 | 室周的WM | |
| 3502 | 16 | 78 | 米 | 2003 | 二次進步 | 室周的財報 | |
| 3509 * | 11 | 74 | F | 2003 | 主要的進步 | 室周的WM | |
| 3831 | 21 | 82 | F | 2004 | 慢性進行性 | 枕WM | |
| 3835 | 29 | 65 | 米 | 2004 | 慢性進行性 | 室周的WM | |
| 3867 | 13 | 75 | 米 | 2004 | 二次進步 | 室周的WM | |
| 3891 | 25 | 53 | 米 | 2005 | 慢性進行性 | 枕WM | |
| 3894 | 32 | 71 | 米 | 2004 | 二次進步 | 頂葉WM | |
| 3928 | 10 | 53 | F | 2004 | 二次進步 | 枕WM | |
| 4201 | 14 | 75 | F | 2006 | 不保密的 | 枕WM | |
| 4212 | 19 | 50 | F | 2006 | 不保密的 | 額WM | |
| 4218 | 15 | 63 | F | 2006 | 不保密的 | 額WM |
表1:本研究中使用的冷凍大腦樣本的特征。
*先前RNA測序研究中使用的標本[21]。
NA=無法從參與的腦庫獲得的信息
PMI=死後時間間隔(即從死亡到收集組織標本的時間間隔)，四舍五入到最接近的小時
b. HERV數據庫和引物設計
逆轉錄病毒基因目錄(RVGC)是通過將Gypsy 2.0數據庫中的蛋白質結構域與人類基因組(NCBI build 37.p13)[22]進行比對而編譯的。RVGC包含與GyDB 2.0結構域數據庫中包含的人類基因組序列具有可檢測到的蛋白同源性(BLASTX):核心(GAG)、包膜(ENV)、逆轉錄酶(RT)、整合酶(INT)掃描- a2、kraba、dUTPase、RNase H、蛋白酶(AP)和色素結構域(CHR)(補充數據)。RVCG條目的命名形式為:_ U(表S1)。
深度測序顯示，MS樣品中GAG、ENV等HERV結構域存在過表達[20,21]。基於這些結果，利用Clustal Omega[23]對RVGC中的28個GAG和88個ENV基因序列進行了比對。通過尋找序列的最長開放讀框來確定每個序列的方向。在對齊之前，如有必要，將所有域序列校正為感知方向。通過鄰居連接構建GAG和ENV的係統發育(圖1和圖2)。係統發育中的主要節點被用於定義GAG和ENV結構域內的分支(圖1和圖2)。
為了擴增人類基因組中多個相似的GAG和ENV位點，引物被設計成枝特異性的，而不是位點特異性的。為此，從Clustal Omega多重比對中提取的分支一致序列用於推導qPCR引物對，使用Primer3[24]。這些引物對的長度為20-24 bp，退火溫度為58-60℃，預測不存在低能量的自二聚體，預計可產生100-120bp的擴增子。用BLAST將引物序列與人類基因組進行比對，以預測可能的擴增子[25]。選擇特異結合進化支特異性一致序列的引物，以減少其與其他進化支的雜交。分別為GAG和ENV分支設計了若幹引物對。本研究使用的引物序列如表2所示。
| 域 | 引物對 | 序列(5 ' 3 ') | 反向序列(5 ' 3 ') |
| 嘔吐 | 進化枝1 | GCAACATCTTGGAGCCTTG | ATCTGCCTTAGAGCCTGGGA |
| 進化枝1 b | ATCTTGGAGCCTTGCCACAA | ATCTGCCTTAGAGCCTGGGA | |
| 進化枝1 c | AACATCTTGGAGCCTTGCCA | ATCTGCCTTAGAGCCTGGGA | |
| 進化枝2 | GCCTTCACATATTCTGTAATT | GCAAGGTTGCAAGATGCAGCTC | |
| 進化枝3 | CAAATGCCCCTGAGAGAGCA | TTCCAGTTGAGAAGGTCGGC | |
| 進化枝3 b | CCACCAGATAACCACACCCC | TGCTCTCTCAGGGGCATTTG | |
| 進化枝3 c | TTAAGAGGACAGGCAGCAGC | GGGGTGTGGTTATCTGGTGG | |
| ENV | 進化枝1 | TGGGAAAACAGAATGGCCCT | AAGGCCCTTGTTATGCTCCC |
| 進化枝1 b | TCCATGGACTGACAGTGGGA | AAAGCAATTCCAGCAGCCAC | |
| 進化枝2 | AGACCCACCAGTCAAATGGC | TTTGGTGTGATCCCACCTGG | |
| 進化枝3 | GCGGTAAGTCTTTGCAAGGC | CCAGAATGGCTCCAGACATGT | |
| 進化枝3 b | CTGGACAATCAGGACCCACC | GGCCTTGCAAAGCCTTTGTT | |
| MSRV | CTTCCAGAATTGAAGCTGTAAAGC | GGGTTGTGCAGTTGAGATTTCC | |
| 控製 | RPL19 | ATGTATCACAGCCTGTACCTG | TTCTTGGTCTCTTCCTCCTTG |
| RPL13 | CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA | TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA | |
| 哥倫比亞大學 | ATTTGGGTCGCGGTTCTTG | TGCCTTGACATTCTCGATGGT |
表2:本研究設計的引物
c. RNA提取和cDNA合成
使用6毫米無菌圓形皮膚活檢穿孔刀片(VWR, Radnor, PA, USA)從冷凍塊中獲得研究標本。將組織標本(每個約100毫克)在無菌稱量船上用無菌刀片細切均勻化，全部置於幹冰上，然後放入rna裂解緩衝液中。RNA提取使用RN易脂質組織迷你試劑盒(Qiagen，希爾登，德國在Qubit 2.0熒光計儀器(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)上使用RNA高靈敏度(HS)檢測試劑盒(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, CA, CA)進行量化。提取的RNA使用TURBO無dna試劑盒(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)進行dna酶處理。用Qubitds DNA HS檢測試劑盒對經DNA酶處理的標本進行核酸定量檢測。使用Omniscript RT (Qiagen, Hilden, Germany and Germantown, MD, USA)，根據製造商說明使用隨機六聚體，共使用500 ng RNA進行逆轉錄(RT)反應。得到的cDNA被aliquote並保存在-20°C。
先前用於神經組織基因表達研究的幾個參考基因被考慮用於本研究:泛素C (UBC)、RNA聚合酶II多肽(RP II)、核糖體大亞基蛋白19 (RPL19)、β-2-微球蛋白(B2M)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)[26,27]。用質譜和對照標本的qPCR法測定每個候選內參基因的RNA表達水平。使用geNorm應用程序確定最佳內參基因[28]。由於RPL19在所有標本中表達量變化最小，因此選擇RPL19作為內參基因。
從3個GAG和3個ENV分支的一致序列分別設計了5對引物，共30對引物。通過檢測qPCR反應的熔化曲線，確定合適的引物對進行研究。具體來說，我們使用了12對引物進行單次均質擴增產物的研究。支持數據中顯示了每個引物對(包括參考候選基因)的標準曲線。
d. qPCR和數據分析
每個反應都在無模板和無rt控件的情況下重複運行。根據MIQE指南[29]考慮平均Ct值進行分析。對照和質譜樣品(各5µl)放在一起，連續稀釋2倍。該稀釋序列用於獲得每個感興趣基因的Ct標準曲線(補充數據)。校正曲線的斜率在.95-1.29和R2考慮<0.95進行分析。對於每個平板，PCR擴增效率由標準曲線計算，公式為:PCR效率=(21 /坡-1) × 100%(補充數字)。從每個對照和MS樣本的標準曲線計算基因表達值，每個樣本的RPL19表達歸一化。每個引物對的中位表達值分別為對照組和MS組。MS組的表達中值與對照組的表達中值相除，得到表達變化(倍數變化)。Mann-Whitney u檢驗用於檢測[30]組間的差異。當p< 0.05時，我們認為差異有統計學意義。
a.冷凍大腦樣本
研究樣本特征如表1所示。33個MS樣本與9個正常對照進行比較。由於從腦庫來源獲得的正常對照有限，對照標本的數量低於質譜樣本。死後間隔(PMI)，即死亡到收集大腦樣本之間的時間，範圍為2-39小時。MS組的PMI(µ=17 h)明顯長於對照組(µ=9.5 h, p=0.0002)。年齡、性別和收集年份在兩組間無顯著差異。
b. HERV GAG和ENV係統發育
圖1顯示了相關GAG序列按係統發育分為三個不同的分支。根據吉普賽數據庫的注釋，這些進化支包括GAGs，它們屬於家族或亞家族HERV-K10, K-HERV和HERV-E(表S1所示)。使用ENV序列的鄰居連接樹進行係統發育也發現了三個獨立的分支(圖2)。MSRV/HERV-W (AF331500.1)，也被包括在ENV係統發育[31]中。ENV序列屬於HERV-K10、K-HERV、HERV-E、逆轉錄病毒樣元素異亮氨酸(RTVL-Ia)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)和以人B淋巴細胞為特征的d型逆轉錄病毒鬆鼠猴樣逆轉錄病毒(SMRV-H)家族[32,33](表S1)。
圖2:ENV序列係統發育-從RVGC中提取了88個非冗餘ENV序列(見方法)。利用距離矩陣近鄰連接算法構建了係統發育。ENV序列按方框劃分為三個不同的分支。與對照相比，在MS中過表達的ENV序列由RNA-seq確定，以紅色字體顯示。
c。表達分析
對GAG和ENV結構域的12個分支特異性引物進行了測試。MSRV-ENV引物序列由H. Perron[32]提供。每對引物都對彙集的RNA提取物(來自所有對照和質譜樣本)進行qPCR檢測。在網上使用Mega BLAST對這些引物對進行分析。這顯示了一個異質性的預測擴增子群體，映射到表S1中指定的多個不同的人類染色體位置。
由於RPL19在樣本中表達變異最小，因此選擇RPL19作為內參基因進行歸一化表達。HERV每個靶向GAG結構域的歸一化基因表達水平如圖3所示。數據被總結為相對折疊變化(log2)用於每個引物對。與對照組相比，MS樣品(N=33)中GAG分支1A、3B和3C的表達量顯著增加，而GAG分支3A的表達量顯著降低。MS子型在每個分支中的GAG表達模式與MS組整體的表達模式相似(圖S1)。GAG表達顯著變化的幅度很小，折疊變化僅為0.74-1.25。
圖3:MS與對照中GAG結構域的表達-每個引物對歸一化表達的差異顯示為Log2 (MS中值/對照中值)。用非參數Mann-Whitney檢驗比較MS患者(N=33)和對照組(N=9)的表達值，確定表達差異的顯著性。統計上顯著性比較的p值顯示在圖表上。
在研究的ENV分支中，MS組和對照組的表達差異也很小，折疊變化小於1.5(圖4)。ENV分支1的表達無差異。MS組ENV分支2 (fold-change 1.33)、分支3A和3B (foldchange 1.2-1.27)、ENV MSRV/HERV-W (fold-change 1.15)表達均較對照組增加。MS子型在每個支係中的ENV表達模式與MS組整體的表達模式相似(圖S2)。
圖4:MS與對照的ENV域表達-每個引物對的歸一化表達的差異用Log表示2(MS /控製中值中位數)。用非參數Mann-Whitney檢驗比較MS患者(N=33)和對照組(N=9)的表達值，確定表達差異的顯著性。有統計學意義組的P值被提及。
本研究比較了從MS患者收集的冷凍腦組織標本中用qPCR檢測的HERV GAG和ENV結構域表達與神經係統正常對照的差異。雖然本研究顯示了HERV表達的幾個顯著差異，但這些差異的幅度相對較小(小於1.5倍)。這些結果表明，在這些冷凍腦組織樣本中，HERV GAG和ENV區域的表達在不同類型的MS和對照組之間沒有太大差異。
Repbase[14,34]分類的35個人類HERV家族中約有40,000個HERV元素。通過微陣列[34]研究了20個HERV家族代表性成員在幾種不同的正常人體組織中的轉錄活性。我們試圖從這些冷凍大腦樣本的cDNA中克隆和擴增特定的HERV位點，但沒有成功，可能是由於我們試圖研究的HERV序列具有高度同源性(數據未顯示)。因此，采用了一種更非傳統的方法，利用相關herv(進化支)之間的對齊。
具體來說，本研究采用了一種比對方法，利用HERV係統發育(圖1和圖2)設計了一致的引物序列(表2)，擴增了多個不同的HERV ENV和GAG區域。這些區域在本研究中被指定為分支和子分支，來自分布在許多不同HERV家族中的28個GAG和88個ENV域序列(表S1)。我們采用的方法並沒有正式排除MS腦組織中某些非常特定的HERV位點可能升高的可能性。相反，我們感興趣的是獲得MS腦組織中HERV表達的廣泛概述，以補充我們之前的測序數據。
herv約占人類基因組[35]的8%。它們廣泛分布在人類基因組中，大多數不能產生病毒顆粒。HERV最近被證明是基因轉錄[36]的組織特異性增強子，一些人類蛋白質是HERV“馴化”的結果。合胞素就是一個例子，它是一種重要的蛋白質，能夠促進胎盤的發育[37,38]。herv被認為是諸如癌症、自身免疫性疾病和神經係統疾病[39]等慢性疾病的病因輔助因子。來自HERV-W家族的兩個完整的ENV orf被認為與MS有關:MSRV和ERVWE1(合胞素-1)[10]。
我們的團隊最近報告了一項RNA-seq研究，顯示一些herv和其他複古元素在一小組冰凍MS和對照腦組織樣本中顯著過表達。該研究發現GAG序列映射到GAG Clade 1 (HERV-K10, K-HERV)和ENV序列映射到ENV clades 2 (RTVL-Ia)和3 (K-HERV)的過表達(圖1和圖2)。然而，這些發現被目前的qPCR研究部分證實，ENV clades 3A和3B (HERV-K和HERV-E)的表達在MS患者[17]的血液、脊髓液和大腦樣本中ENV MSRV (HERV-W)水平升高。我們確實確認了這一發現，但MSRV表達增加的幅度相對較小——隻有1.15倍的變化)。
這項研究有許多固有的假設。首先，選擇HERV GAG和ENV區域進行評估，因為多項報告顯示，這些是最有可能參與免疫發病機製的逆轉錄病毒基因[17,40-43]。其次，我們假設從吉普賽2.0數據庫到RVGC的GAG和ENV基因崩塌足以代表所有GAG和ENV HERV結構域。第三，我們假設從HERV GAG和ENV的係統發育中設計的引物對被劃分為相關的序列(分支)，提供了樣本中這些結構域RNA的合理表示。最後，我們假設這些死後樣本，通常是在死後幾小時采集的，準確地反映了死前組織的RNA含量。毫無疑問，細胞RNA在人死後不是靜止的，這顯然是我們研究的一個局限性，但神經係統正常或患病的人的新鮮大腦樣本根本無法進行比較。我們的MS樣本的PMIs明顯長於對照組，這可能導致MS組的表達量比對照組減少更多，導致低估了組間的表達差異。然而，任何PMI對表達的影響都應該通過RPL19歸一化來消除，據推測，RPL19的退化速度與我們測量的HERV結構域相似。所有這些假設都可以被批評，但該研究的目的是提供MS白質樣本中HERV表達的廣泛觀點。
MS組HERV-E、RTVL和HERV-K10家族的GAG和ENV表達明顯增加。但MS組與對照組的相對表達差異較小，差異小於1.5倍。這些結果表明，在這些冷凍腦樣本中，HERV GAG和ENV區域的表達在MS和對照組之間沒有太大的差異。這項工作隻是部分證實了先前從類似的冷凍MS大腦標本中獲得的測序數據。
這項工作由NIH/NINDS的R21NS077023撥款資助，“原發性進行性多發性硬化症大腦中病毒序列檢測的深度測序”。一些後續工作由國家MS協會資助，資助號#RG4807A4。
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Aritcle類型:研究文章
引用:Bhetariya PJ, Kriesel JD, Fischer KF(2017)人內源性逆轉錄病毒在多發性硬化斑塊中的表達分析。J新興病毒3(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.133
版權:©2017 Bhetariya PJ，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。
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