圖1:冷凍腦標本的命中率比較。
從14個正常對照、14個脫髓鞘(包括2個NMO)和7個其他神經疾病(OND)冷凍保存的腦標本中提取RNA。製備cDNA文庫，進行深度測序。使用單詞大小為28 bp的Mega BLAST將高質量的序列匹配到非冗餘病毒數據庫。對於每個樣本和日誌中高質量讀取的總數，將命中(與數據庫匹配)歸一化10轉換，提供“日誌命中率”。“非脊椎動物病毒(噬菌體、植物和昆蟲病毒)和克隆載體的序列被移除。”病毒類群在任何樣本中都沒有顯著富集(如VZV, EBV和腸道病毒)沒有顯示。
全文
Kriesel JD1 *Bhetariya PJ1陳漢堡王2威爾遜T3.費舍爾KF3.
1美國，內科，傳染病科2耶魯大學生態與進化生物學係，美國康涅狄格州紐黑文
3.美國猶他州鹽湖城猶他大學醫學院病理科
*通訊作者:John D Kriesel，美國傳染病科內科，電話:801-585-7314;電子郵件:john.kriesel@hsc.utah.edu
背景:我們的團隊已經使用深度測序來識別人類大腦標本中的病毒RNA簽名。我們之前使用這種方法檢測了死亡捐贈者腦組織中的HSV1、GBV-C和麻疹病毒序列。對一組死於進展性MS的患者的腦標本進行了深度測序，揭示了一些人類內源性逆轉錄病毒(HERV)結構域表達增加的證據。
目的:鑒定與MS發病機製有關的RNA序列和新抗原
方法:對12例進展性MS、2例視神經脊髓炎(MS/NMO =脫髓鞘組)、14例正常對照組和7例其他神經疾病(OND)對照組冷凍腦標本的RNA進行深度測序。將得到的單端50 bp序列(reads)與表示GenBank中所有120萬條病毒記錄的非冗餘病毒數據庫(NRVDB)進行比較。通過鑒定與Gypsy 2.0複古元素數據庫中包含的域同源的人類遺傳位點(GRCh37.p13)，製備了逆轉錄病毒基因目錄(RVGC)。Reads與RVGC和人類轉錄組與Bowtie2相一致。由此產生的病毒點擊率(VHRs)由高質量讀取的數量標準化。人類基因的表達，包括HERVs，是用袖扣測定的。兩組之間的比較使用了錯誤發現率。
結果:每個標本可獲得50 ~ 1.31億次高質量讀數。與NRVDB的讀數比較表明，脫髓鞘和OND標本對某些逆轉錄病毒序列的VHRs高於對照組。逆轉錄病毒域平均證實了這一點。基因表達分析顯示，部分HERV序列表達存在差異。與正常對照相比，單個讀取映射顯示脫髓鞘樣本中有一個包膜和一個逆轉錄酶序列記錄顯著富集。限製性較低(綜合)的讀圖顯示，脫髓鞘組有2個整合酶、2個核心、2個包膜和3個KRAB序列過表達。
結論:這些數據表明，一些內源性逆轉錄病毒序列在脫髓鞘腦組織標本中明顯過表達，但這種過表達的幅度很小。這與HERV激活作為先天免疫反應的一部分的概念是一致的。
深度測序;RNA-seq;下一代測序;內源性逆轉錄病毒;HERV;多發性硬化;進步的女士
多發性硬化症(MS)是一種原因不明的慢性脫髓鞘疾病，在美國影響大約40萬人的大腦和脊髓。中樞神經係統的一些病毒感染可導致脫髓鞘，包括犬瘟熱(狗)、麻疹(亞急性硬化性全腦炎，SSPE，人類)和流感(人類)。［1］．基於疾病的流行病學，包括地理分布、孤立暴發和遷移研究，病毒一直被懷疑是MS的病原體[2-5]。導致人類疾病的新病毒不斷被發現，包括丙型肝炎(1989年)，冠狀病毒NL63 (2004),bocavirus(2005)和鼻病毒C組(2007)[6- 9]。新型人類多瘤病毒和角質層病毒最近被深度測序確定為人類嚴重疾病的病因[10-12]。國家多發性硬化症協會本身為在多發性硬化症和相關疾病中尋找病毒提供了一個極好的理論基礎。
過去的血清學研究為逆轉錄病毒參與MS發病提供了一些證據[14,15]。其他研究小組已確定人類內源性逆轉錄病毒(HERV)，包括HERV Fc1和HERV- w可能是MS病原體[16-24]。參與控製逆轉錄病毒複製的人類基因的多態性，包括TRIM5、TRIM22和BST2，與發生MS[25]的較高風險相關，最近的流行病學研究表明，MS和HIV是相互限製的;也就是說，根據年齡、性別和其他因素調整後，HIV患者發生MS的頻率低於預期[26-28]。
我們的團隊使用深度測序(也稱為下一代測序)來檢測供體腦組織中的微生物序列。這項強大的新技術可以在一名MS受試者的大腦中識別出GBV-C，並在幾名腦炎患者的大腦中識別出HSV或麻疹病毒[29,30]。深度測序應用於低溫保存的進展性MS和NMO腦標本與正常腦和腦炎腦標本對照。
方法
主要的進展性多發性硬化症病例是從人腦和脊髓液資源中心(洛杉磯退伍軍人管理局，加利福尼亞州)和落基山多發性硬化症中心(恩格爾伍德，科羅拉多州)腦庫申請的。案件由這兩個機構的主任挑選。我們研究了11例原發性進展性MS (PPMS)、1例繼發性進展性MS (SPMS)和2例重度進展性視神經脊髓炎(NMO)患者的標本。之所以特別選擇進行性MS和NMO病例，是因為它們往往是MS相關疾病中最嚴重的亞型。同時對14例正常對照和5例腦炎冰凍腦標本進行了研究。另外兩份未鑒定的冷凍腦炎標本從丹佛科羅拉多大學的Don Gilden博士處獲得。標本采集於死亡後一天內，新鮮冷凍或在液氮中快速冷凍，並與神經病理診斷相關。該研究計劃已提交給猶他大學健康科學IRB進行審查。這項研究由猶他大學健康科學IRB(#00028658)審查並批準。由於本研究隻涉及去識別的死後材料，因此被發現無需同意、審查和監督。
這些樣本被分為三組:
- 髓鞘脫失(N = 14)
- 原發性進展性多發性硬化症(N = 11)
- 繼發性進展性多發性硬化症(N = 1)
- 視神經脊髓炎(N = 2)
- 正常對照組(n=14)
- 其他神經疾病(OND) (n=7)
- 皰疹性腦炎(N = 3)
- 其他/未知腦炎(N = 2)
- 亞急性硬化性泛腦炎(N = 2)
用RNeasy脂質組織Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, Cat No. 2)從冷凍大腦中提取[29]RNA。/ ID: 74804)。提取的RNA用DNase在柱上孵育15分鍾。由此產生的RNA被提交到猶他大學高通量基因組共享資源進行測序。在測序之前，RNA在Agilent生物分析儀納米芯片(Agilent Technologies, USA)上進行分析，並如前麵所述評估RNA豐度和完整性。[29]樣本進行逆轉錄，文庫使用Illumina TruSeq試劑盒(Illumina, San Diego, CA)製備。為了確保可能的病毒RNA基因組的包含，沒有進行寡核苷酸dT選擇。為了避免可能的富集內在偏差，沒有進行rRNA耗盡。
測序結果為Illumina HiSeq 2500，單端50 bp。對FASTQ格式序列進行優質過濾，保留高質量(HQ)序列。將與人類基因組(NCBI構建GRCh37.p13)或人類轉錄組相匹配的Reads從HQ Reads中移除，得到“篩選Reads”。篩選Reads使用MegaBLAST (v2.2.26)與非冗餘病毒數據庫(NRVDB)相匹配，字數為28 bp。
逆轉錄病毒基因目錄(RVGC)是通過BLASTX在Gypsy 2.0數據庫(GyDB)中識別與核心逆轉錄病毒結構域具有可檢測相似性的人類基因組區域(構建GRCh37.p13)來製備的[34,34]，考慮了其他逆轉錄病毒數據庫進行分析，選擇Gypsy是因為存在注釋，可以將序列分類為逆轉錄病毒結構域。NCBI blast的2.2.26版本的BLASTx子程序使用默認單詞大小和評分，期望截止值為0.1。將長度超過受試者逆轉錄病毒結構域50%或更長的人類基因組序列放置在RVGC中。RVCG條目被命名為任意形式的唯一代碼:_U(見S1 RVGC表)。為了保持記錄，GyDB域與人序列對齊派生的RVGC條目(識別域)和源GI、起始位置和長度也在每個RVGC中快速編碼一個記錄名稱。已編譯的RVGC詳情可參閱補充數據。僅使用帶注釋的拚接位點[35]，使用表達分析管道Bowtie-Tophat-Cufflinks確定表達歸一化。袖扣範數質量參數被用作所有FPKM指標的碎片數。
使用開源網絡應用程序Vassar Stats[36]和Microsoft Excel for Mac 2011對研究人群的人口統計學特征進行統計分析。對連續變量(年齡、收集年份和死後時間間隔)采用單向無加權方差分析(ANOVA)檢驗，對離散變量(性別)采用雙尾卡方檢驗(Yates校正)，篩選組間差異的顯著性。對於每個分類單元，使用帶Bonferroni校正的z檢驗進行多重比較，比較每個脫髓鞘和OND標本與對照組之間的病毒命中率(VHR)。脫髓鞘或OND標本VHRs與對照無顯著差異的分類群被排除在進一步分析之外。使用Mann-Whitney u檢驗或Tukeys HSD檢驗來檢測兩組之間VHRs的具體差異。多重比較校正使用Benjamini - Hochberg程序完成，錯誤發現率(FDR或q)為0.05[37]。逆轉錄病毒結構域判別分析中樣本類型的分布采用2 × 2表[36]的雙尾fisher精確檢驗。
主題人口
研究樣本特征如表1所示。14例脫髓鞘標本與14例正常對照和7例OND標本進行比較。脫髓鞘組患者均為嚴重且進展性臨床疾病。11例為pms, 2例為NMO, 1例為繼發性進展性ms。死後間隔(PMI)，即從死亡到收集腦樣本的時間，範圍為2-26小時。兩組間PMI無顯著差異(p=0.66)。14例對照組、14例脫髓鞘病例中有13例、7例OND病例中有5例的年齡和性別信息可用。脫髓鞘9/13組(69%)中已知女性的比例與對照組6/14組(43%)無顯著差異(p=0.32)。受試者年齡37-93歲。脫髓鞘組年齡(平均58±13歲)明顯小於正常對照組(平均71±12歲，p=0.017)。標本采集於1981年至2010年間。 The year of collection was not significantly different between the groups (p=0.29).
| 集團 | 標本 | 采購經理人指數 | 年齡 | 性 | 收集一年 | 臨床病史 | 樣品的位置 | 神經病理學的閱讀 | 總部 讀取 |
| 正常的控製 | 202 | 4 | 57 | 米 | 1983 | 術後感染 | 大腦 | 正常的 | 91.5 |
| 214 | 4 | 56 | 米 | 1981 | 心髒病 | 大腦 | 正常的 | 94.7 | |
| 3276 | 19 | 54 | 米 | 2002 | 心髒病 | 額WM | 正常的 | 93.9 | |
| 33 | 5 | 69 | 米 | 1983 | 肺部疾病 | 大腦 | 正常的 | 89.1 | |
| 3371 | 16 | 52 | 米 | 2002 | 肺癌 | 額WM | 正常的 | 96.8 | |
| 3406 | 20. | 72 | F | 2002 | 心髒衰竭 | 顳WM | 正常的 | 89.3 | |
| 3465 | 20. | 93 | F | 2002 | 出血 | 顳WM | 正常的 | 105.2 | |
| 3482 | 14 | 79 | F | 2003 | 心髒病 | 顳WM | 正常的 | 97.5 | |
| 3543 | 12 | 73 | F | 2003 | 肺部疾病 | 頂葉WM | 正常的 | 105.2 | |
| 3348 | 9 | 76 | F | 2002 | 心髒病、糖尿病 | 額WM | 正常的 | 102.7 | |
| 3465 | 11 | 76 | 米 | 2003 | 心髒衰竭 | 枕WM | 正常的 | 107.3 | |
| 3637 | 13 | 76 | 米 | 2003 | 肺炎 | 額WM | 正常的 | 102.5 | |
| 3641 | 20. | 76 | 米 | 2003 | 胃癌和肝癌 | 頂葉WM | 正常的 | 85.3 | |
| 3698 | 17 | 84 | F | 2003 | 乳腺癌 | 顳WM | 正常的 | 90.3 | |
| 脫髓鞘(進行性MS和NMO) | 168 | 3. | 37 | F | 1984 | 項目組合管理係統 | 大腦 | 重新激活女士 | 89.7 |
| 2443 | 26 | 49 | F | 1997 | 項目組合管理係統 | 室周的WM | 淋巴細胞成套 | 99 | |
| 2485 | 9 | 69 | 米 | 1997 | 項目組合管理係統 | 額WM | 活躍的女士 | 63.3 | |
| 2696 | 21 | 86 | F | 1998 | 項目組合管理係統 | 室周的WM | 慢性多發性硬化斑塊 | 130.9 | |
| 2946 | 15 | 59 | 米 | 1999 | 項目組合管理係統 | 室周的WM | 慢性血管周的 炎症 |
88.9 | |
| 3161 | 20. | 51 | F | 2001 | 繼發進展性多發性硬化 | 室周的WM | 有源MS 淋巴細胞成套 |
89.9 | |
| 3185 | 14 | 50 | 米 | 2001 | 項目組合管理係統 | 室周的WM | 慢性MSplaque | 91.1 | |
| 3509 | 11 | 74 | F | 2003 | 項目組合管理係統 | 室周的WM | 慢性多發性硬化斑塊 | 87.2 | |
| 3816 | 21 | 47 | F | 2004 | 項目組合管理係統 | 額WM | 巨噬細胞和 淋巴細胞成套 |
91 | |
| 3840 | 23 | 61 | F | 2003 | 項目組合管理係統 | 額WM | 巨噬細胞和 淋巴細胞成套 |
95 | |
| 3931 | 10 | 74 | F | 2004 | 項目組合管理係統 | 室周的WM | 慢性活動性疾病 | 73.8 | |
| 5149 | 8 | 48 | 米 | 2010 | 項目組合管理係統 | 額WM | 活躍的女士 | 66.4 | |
| 108 | 2 | 56 | F | 1998 | 動 | 中腦和腦橋 | 脫髓鞘壞死 | 72.5 | |
| 290 | NA | NA | NA | NA | 動 | 胼胝體 | 與NMO相符的脫髓鞘 | 82.3 | |
| 反應控製 | 1418 | 5 | 68 | 米 | 1988 | MS-like疾病__ | 額葉皮質 | 慢性腦炎 | 76.8 |
| 4403 * | 18 | 77 | F | 2006 | HSV腦炎，中風 | 額葉皮質 | 活躍的腦炎 | 99.5 | |
| 4471 | 12 | 73 | F | 2007 | 拉斯穆森的腦炎 | 額葉皮質 | 無活性膠質瘤 炎症 |
49.4 | |
| 710 * | 8 | 58 | 米 | 1983 | HSV腦炎，慢性淋巴細胞白血病 | 額葉皮質 | 活躍的腦炎 | 50.1 | |
| 924 * | 24 | 86 | 米 | 1985 | HSV腦炎 | 額葉皮質 | 慢性腦炎 | 67.9 | |
| coloradoA | NA | NA | NA | NA | SSPE(麻疹) | NA | NA | 67.9 | |
| coloradoB | NA | NA | NA | NA | SSPE(麻疹) | NA | NA | 66.9 |
NA =信息不可用
視神經脊髓炎
其他神經疾病
PMI =死後時間(小時)
HQ閱讀=高質量閱讀(以百萬計)
原發性進行性多發性硬化症
亞急性硬化性全腦炎(麻疹感染)
WM =白質
*先前診斷為HSV腦炎
†MS未被病理證實
表1:冷凍腦標本的序列特征。
測序與分析
每個樣品的深度測序結果為49.4 ~ 1.301億條50 bp的高質量(HQ)序列。HQ序列的平均產量在正常對照組(µ= 96.5±7.1M)和脫髓鞘組(µ= 87.2±16.6M)之間沒有差異。與正常對照組和脫髓鞘組相比，OND組每個樣品產生的HQ序列(µ= 68.3±17.0M)顯著減少(p<0.01)。
從測序分析中生成了顯示對數轉換hr的熱圖(圖1)[38]。圖中隻顯示一個或多個標本顯著過量的病毒類群。與正常對照組相比，至少有一個脫髓鞘或OND標本中超過50個病毒類群。通過這種方式，消除了對人類和克隆序列的假陽性比對。GB病毒C先前顯示僅存在於標本3840中，是任何脫髓鞘樣本[30]中唯一明確存在的非逆轉錄病毒。OND樣本中真實的和虛假的病毒排列已經在前麵描述過。
在至少一種OND或脫髓鞘樣本中過度代表的50種病毒類群中，17種是皰疹病毒，9種是逆轉錄病毒。對各組間所有成員的VHRs進行統計比較(校正多次比較)。該分析顯示，與對照組相比，脫髓鞘組隻有3種逆轉錄病毒類群顯著過表達:人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)、人類內源性逆轉錄病毒(家族)和人類內源性逆轉錄病毒k。隊列中沒有艾滋病或HIV患者;因此，推測HIV-1的高VHR是由50 bp的reads對準與HIV-1相似的序列引起的。9種皰疹病毒候選類群在組間均無顯著差異。
逆轉錄病毒分析
脫髓鞘組明顯的逆轉錄病毒序列富集導致了更廣泛的逆轉錄病毒序列分析。一個叫做逆轉錄病毒基因目錄(RVGC)的新數據庫已經準備就緒(見方法)。RVGC含有類似蛋白編碼逆轉錄病毒基因的內源性序列:GAG、RT、ENV等。關於RVGC中所有序列記錄的具體信息，包括GenBank標識符、長度和位置(S1 RVGC表)是可用的。
根據逆轉錄病毒結構域類型(如GAG、RT、ENV)對與RVGC數據庫對齊的Reads進行分類。GAG是指病毒核心，RT是指逆轉錄酶，ENV是指包膜。掃描結構域的功能尚不清楚，KRAB可能是一種轉錄抑製因子[39]。CHR是指在許多逆轉座子積分[40]的c端發現的色域。
脫髓鞘、NMO和對照樣本的平均域型命中率(HRs)進行log2轉換，並在域型軸居中(圖2)。這些值被層次聚類(Pearson相關)，並在脫髓鞘和正常對照樣本[41]之間進行比較。由此產生的樣本聚類顯示脫髓鞘和對照樣本的相對分離為聚類的優勢節點(例如，9/10脫髓鞘樣本聚集在左側，12/16對照樣本聚集在右側;p = 0.004)。該數據集顯示，與正常對照組相比，脫髓鞘受試者大腦中廣泛的逆轉錄病毒基因過度表達。然而，逆轉錄病毒過表達的幅度很小，小於2倍，對於任何單個RVGC序列都不明顯。這種逆轉錄病毒基因表達模式在OND(腦炎)樣本中比脫髓鞘組更明顯。三組間神經組織控製基因RPL13、RPL19、UBC的表達差異無統計學意義。
圖2:逆轉錄病毒域判別分析。
對RVGC數據庫的測序命中(匹配)被分類到逆轉錄病毒域。意思是日誌2脫髓鞘(MS)、OND和正常對照標本RVGC中轉化和集中的命中率為逆轉錄病毒結構域類型。結果使用Cluster 3.0[41]進行聚類，在大多數脫髓鞘、對照組和OND標本中顯示出明顯不同的表達模式。
另外的分析表明，與正常對照組(N=14)相比，脫髓鞘組(N=14)和僅PPMS組(N=11)中一些特定的逆轉錄病毒基因明顯過表達。采用了兩種映射程序:“最佳對齊”，即每個讀數僅映射到RVGC一次，以達到其最佳匹配，以及“綜合對齊”，即統計所有報告的Bowtie 2對齊。分析結果如表2所示。在最佳比對過程中，隻有一個包膜基因和一個RT基因顯著過表達。綜合比對過程中，多個整合酶、GAG和包膜基因以及3個KRAB基因過表達;對11個PPMS標本的限製性分析顯示，與對照組相比，有2個ENVs和3個gag過表達。這些過表達基因的HERV注釋見表2。
| 方法 | 集團 | 基因 | 表達式1 | Ratio2 | 假定值 | 羅斯福(q) D:C3 | 識別領域 |
| 最好的對齊 | 髓鞘脫失 | ENV-U3 | 958 | 1.7 | 0.0001 | 0.006 | K-HERV |
| (N = 14) | RT-U105 | 300 | 1.7 | 0.0001 | 0.032 | MMTV | |
| 項目組合管理係統隻 | ENV-U3 | 952 | 1.7 | 0.0002 | 0.017 | K-HERV | |
| (N = 11) | RT-U105 | 311 | 1．8 | 0.00005 | 0.014 | MMTV | |
| 全麵調整 | 髓鞘脫失 | INT-U176 | 775 | 1.7 | 0.0001 | 0.036 | MuERV-L |
| (N = 14) | INT-U45 | 94 | 2.8 | 0.0003 | 0.044 | ||
| GAG-U21 | 52 | 2.5 | 0.0003 | 0.009 | K-HERV | ||
| GAG-U22 | 43 | 2．3 | 0.0011 | 0.018 | HERV-K10 | ||
| ENV-U59 | 1540 | 1.9 | 0.0009 | 0.037 | RTVL-Ia | ||
| ENV-U3 | 960 | 1.7 | 0.00007 | 0.006 | K-HERV | ||
| KRAB-U15 | 9880 | 1．8 | 0.001 | 0.017 | 帶鎖 | ||
| KRAB-U13 | 1027 | 1.7 | 0.001 | 0.017 | |||
| KRAB-U9 | 1982 | 1．5 | 0.006 | 0.037 | |||
| 項目組合管理係統隻 | ENV-U3 | 952 | 1.7 | 0.0002 | 0.019 | K-HERV | |
| (N = 11) | ENV-U59 | 1617 | 2 | 0.0009 | 0.04 | RTVL-Ia | |
| GAG-U21 | 56 | 2.7 | 0.00009 | 0.003 | K-HERV | ||
| GAG-U22 | 47 | 2.5 | 0.0006 | 0.009 | HERV-K10 | ||
| GAG-U8 | 242 | 1．5 | 0.004 | 0.041 | HERV-E |
1表達描述為FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript Per Million mapped reads) × 1000
2比率=脫髓鞘或PPMS組的平均表達量除以對照組的平均表達量
3.分別計算每種結構域類型(如RT、ENV、GAG等)的錯誤發現率(FDR) q值。
表2:脫髓鞘組過表達的特定逆轉錄病毒基因:使用bowtie2應用程序將50 bp reads與NCBI/GenBank中所有注釋的HERV序列進行端到端對齊，並進行端到端的默認設置。顯示脫髓鞘(進行性MS和NMO)組的平均表達水平(每百萬每千堿基，FPKM)。將Reads單獨映射到它們的最佳匹配RVCG序列(最佳比對)或2)使用每個報告的Bowtie2比對RVGC(綜合比對)。報告了p值和錯誤發現率(FDR)，以及實驗組和對照組之間的平均命中率之比。逆轉錄病毒的關聯是根據吉普賽2.0數據庫的注釋。
本研究采用深度測序和宏基因組分析技術，與正常對照組和OND(腦炎)對照組相比，全麵研究冷凍脫髓鞘腦樣本中的逆轉錄病毒表達。結果顯示在大多數結構域中HERV普遍過表達(圖2)。過表達的HERV和KRAB序列被特別鑒定出對應於幾個逆轉錄病毒結構域，包括核心、包膜、整合酶和逆轉錄酶(表2)。這些結果支持逆轉錄病毒序列在脫髓鞘腦樣本中與正常大腦相比過度表達的假設。然而，觀察到的逆轉錄病毒區域過表達的幅度很小，不到3倍，這一觀察的病理意義尚不清楚。
這項研究的數據與HERV過表達是人類免疫反應的一部分的概念是一致的。其他研究小組發現MSRV (HERV-W)或HERV-Fc1可能與MS發病有關[16,17,19,20,24,42]。有趣的是，目前的測序研究並沒有明確地證實這些發現(圖1)。相反，來自各種來源的其他一些HERV基因被證明顯著過表達(表2)。這突出了這些研究固有的困難，這些研究已經將多個相似的HERV納入人類基因組。在這裏執行的基因表達映射依賴於注釋序列從人類基因組構建37。在目前的測序研究中產生的數據是全麵的整個人類基因組，但它可能不如qPCR的特異性和定量。
人類內源性逆轉錄病毒(HERVs)是宿主種係古老逆轉錄病毒感染的殘餘，從父母垂直傳播給後代。盡管至少有一種HERV基因編碼合子素，合子素是胎盤[43]發育的一種重要蛋白質，但這些元素在人類基因組中的用途在很大程度上仍是推測性的。
有趣的是，一些動物ERVs有效地幹擾相關外源性逆轉錄病毒的複製[44,45]。由於相關的外源性和內源性逆轉錄病毒的存在，綿羊已被用於研究哺乳動物宿主內erv的進化。外源性(即水平傳播)致癌逆轉錄病毒，雅格西克特羊逆轉錄病毒(JSRV)會導致致命的肺癌。一個密切相關的原病毒，JSRV-20，在過去300萬年的物種形成期間進入宿主基因組羊屬．內源性JSRV有缺陷的Gag多蛋白導致了一個轉顯性表型，阻止了密切相關的複製外生JSRV[46-48]。也就是說，內源性逆轉錄病毒的表達有效地阻斷了外源性逆轉錄病毒的致命感染。這些動物數據有力地表明，erv的內源性和選擇是宿主用來對抗逆轉錄病毒感染的一種機製。在感染了(外源性)逆轉錄病毒HIV的患者中，(內源性)HERV-K的表達增加，顯示了對這一概念的支持，其中HERV-K包膜具有神經保護作用[49,50]。
大多數OND標本來自其中一種患者皰疹(3)或麻疹病毒(2)腦炎。HSV感染標本(4403、710、924)HERV結構域表達水平最高，如圖2所示。這與其他研究小組的結果一致，即HSV刺激MS患者[51]的pbmc中的逆轉錄酶，並且在細胞培養中HSV1誘導HERV-W表達[52,53]。
這種深度測序方法的一個局限性是，盡管有DNAse處理步驟，但RNA提取並不是完全無DNA的。對提取的大腦樣本的量子比特分析顯示，1-5%的分析材料是原始樣本中保留的DNA。在測序之前，RNA也在Agilent生物分析儀納米芯片(Agilent Technologies, USA)上進行了分析，並評估了RNA的大小、豐度和完整性。這為後續的分析提供了相對高質量的RNA，但不能絕對確定保留的DNA沒有影響研究結果。該研究的另一個局限性是，這些來自已故人類捐獻者的樣本必然與死後時間間隔有關。雖然脫髓鞘和對照標本之間的PMI沒有可檢測到的差異，但這一間隔可能允許所有樣品中的一些RNA降解。在測序反應中，這可能確實幹擾了HERV和其他逆轉錄病毒序列的檢測。
作者要感謝Rashed M. Nagra博士的幫助，他是洛杉磯人腦和脊髓液資源中心(加州大學洛杉磯分校腦庫)主任;科羅拉多州丹佛市落基山醫學中心主任John Corboy博士;以及科羅拉多大學的唐·吉爾登博士提供的冷凍大腦標本。來自亨斯邁癌症研究所Microarray Core Facility的Brian Dalley監督了cDNA文庫的製備和Illumina測序。
這項工作由NIH/NINDS的R21NS077023資助，“深度測序檢測原發性進行性多發性硬化症大腦中的病毒序列”。一些後續工作由國家MS協會資助，編號#RG4807A4。
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下載補充資料
下載臨時PDF
Aritcle類型:研究文章
引用:Kriesel JD, Bhetariya PJ, Chan BK, Wilson T, Fischer KF(2017)嚴重脫髓鞘疾病患者腦組織中逆轉錄病毒序列的富集。J新興病毒3(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.132
版權:©2017 Kriesel JD，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。
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