病毒學與新發疾病- Forschen

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研究文章
乙型肝炎病毒基因型G:來自非洲大陸完整基因組分析的第一份報告

煤塵H1 *Sonderup米2Gogela N2斯皮爾曼連續波2

1南非開普敦大學健康科學學院病理學係醫學病毒學/國家衛生係統司
 2南非開普敦大學健康科學係醫學部肝髒科

*通訊作者:南非開普敦大學健康科學係病理學係醫學病毒學/國家衛生係統Smuts H電話:+27 21 4045306;電子郵件:Heidi.Smuts@uct.ac.za


摘要

根據序列異質性可將乙型肝炎病毒分為10個基因型。HBV基因型G (HBV-G)的遺傳變異很小，常與其他HBV基因型共存。乙肝- g感染在世界各地都有發現，但很少在非洲發現。在9年的時間裏，3名患者在南非開普敦一家三級醫院的專科肝髒診所就診時被確診為HBV-G感染。本研究的目的是描述患者的臨床和實驗室特征，並對HBV-G全基因組進行測序，以確定與世界各地其他HBV-G分離株的係統發育關係。此外，通過多重類型特異性PCR和克隆確定了與其他HBV基因型的合並感染。所有患者(2例白種人和1例亞裔)均屬於與男性發生性行為的高危人群，且HBeAg陽性。2例患者合並感染HIV和HBV合並感染(HBV- a)，僅1例確診。來自白人和亞裔患者的2個南非完整基因組顯示HBV-G的特征，包括核心基因5 '端插入36個核苷酸，核前區有2個止密碼子，遺傳變異性低(0.5%)。在係統發育學上，基因組與參考HBV-G株聚集在一起。 This is the first report of the full characterization of HBV-G in South Africa.

關鍵字

非洲;基因型G;乙型肝炎病毒;臨床;分子鑒定

縮寫

HBV:乙型肝炎病毒;HCC:肝細胞癌;HBeAg:乙型肝炎e抗原;波爾:聚合酶;HBcAg:乙型肝炎核心抗原;HBV-G:乙型肝炎病毒基因型G;BCP:基礎核心啟動子;PC: Precore;男同性戀者:和男人發生性關係的男人。

簡介

據估計，全世界有3.5億人慢性感染乙肝病毒，近80萬人死於肝硬化或肝細胞癌。這種疫苗可預防疾病的最高流行率是在撒哈拉以南非洲和東亞，那裏5-10%的成年人受到慢性感染。在這些流行地區，乙肝病毒的傳播通常發生在生命的前5年，由受感染的母親傳給出生時的嬰兒，或從受感染的兒童橫向傳給未受感染的兒童。

乙型肝炎病毒是一種小的包膜部分雙鏈DNA原型病毒肝病毒科家庭。基因組編碼4個重疊的閱讀框:e抗原(HBeAg)，核心蛋白(HBcAg)，帶有逆轉錄酶的聚合酶(Pol)， RNase H和DNA聚合酶活性，3種形式(小、中、大)的表麵蛋白和轉錄反式激活蛋白(X)[2]。

病毒聚合酶缺乏讀證活性，導致複製過程中核苷酸錯誤結合，導致序列異質性。>7.5%的多樣性使HBV可分為9種基因型(a - i)[3,4]，其中可能有10種th(J)基於1例日本患者[5]的序列。4-8%的組間核苷酸差異允許進一步將A、B、C、D、F、H和I基因型分為35個子基因型[2]。

HBV基因型具有明顯的地理分布。A基因型分布在非洲、歐洲和美洲，B和C基因型主要分布在亞洲，D基因型分布在世界範圍內，F和H基因型分布在南美洲和中美洲[4-6]。A1亞基因型主要在非洲發現，在南非占75%的HBV感染[7]。人類遷移在HBV基因型的地理流行變化和新的亞基因型的引入中發揮作用[8,9]。

HBV基因型G (HBV-G)於2000年被確認為一種新的基因型[10]。它與其他基因型的不同之處在於，它在核心的5 '端插入了36個核苷酸，向蛋白質中添加了12個氨基酸。這種插入影響核心蛋白的表達、複製和病毒分泌[11,12]。此外，在前核區第2和第28位的1或2個停止密碼子可以阻止HBeAg的表達[10-13]。因此，HBV-G的單一感染是罕見的，因為HBV-G的複製需要HBeAg的供應反式通過與另一種HBV基因型如HBV- c[14]、HBV- f[15]、HBV- h[16]和通常的HBV- a合並感染[17-19]。重組形式也可能提供HBeAg[20]。HBV-G在某些高危人群中普遍存在，如男男性行為者(MSM)、注射吸毒者和HIV合並感染者[21,22]。

HBV-G的報道僅限於歐洲、美洲和日本[16- 18,23,24]。在PubMed和GenBank數據庫中搜索非洲存在HBV-G的情況時發現，2005年在南非的一名艾滋病毒感染者中出現了一例該基因型病例(登錄號為EU694179;Mphahlele未發表)。一項對47名加蓬兒童的研究發現，2例HBV- g[25]病例和1名尼日利亞患者在複雜HBV E/D和A3重組病毒[26]的核心區域有典型的36bp HBV- g插入。這些簡短的報告表明HBV-G可能存在於非洲。也有人認為HBV-G可能起源於西非或中非。

本研究報告了在南非開普敦一家三級醫院的肝髒診所就診的hbv陽性患者隊列中檢測到的3例HBV-G病例。對這2例患者的全基因組進行了測序，並與來自世界其他地區的HBV-G菌株進行了比較。

方法
病人

在9年的時間裏(2007-2015年)，在南非開普敦的Groote Schuur醫院的肝髒診所對209名hbv陽性患者的基因型進行了測定。3例(1.4%)患者被發現感染HBV-G(表1)。

l - 2007 p - 2014 m - 2015
年齡(年) 32 31 48
性別 男性 男性 男性
種族 高加索人 亞洲 高加索人
風險因素 二甲基碸 二甲基碸 二甲基碸
HBV日誌病毒載量(IU/ml)
10		 9日,2 3 > 8日 9、3
e抗原 積極的 積極的 積極的
HBsAg 積極的 積極的 積極的
乙肝病毒合並感染 ND HBV-A 沒有檢測到
乙肝病毒血清型 ND adw2 adw2
丙肝病毒狀態 ND ND 負
艾滋病毒狀況 積極的 積極的 負
淋巴細胞CD4+細胞計數(細胞/mm3) 319 347 ND
肝纖維化# 中等- 3/6 ND 嚴重- 5/6
ALT (U / L) 202 65 1043
AST (U / L) 141 66 1307

表1:南非HBV-G患者的人口學、臨床和危險因素。

DNA提取

根據製造商的說明(Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)，使用MagNA Pure LC自動提取方法從血清/血漿樣本中提取總核酸。

乙型肝炎病毒基因分型

采用半嵌套PCR擴增表麵和重疊聚合酶(S/pol)基因的一個區域:P6F (5 ' - cctgctggtggctccagtt -3 ')和P2R (5 ' - CTAGGAGTTGGCCAGTATGGAT-3 ')[28]用於第一輪，P7F (5 ' - gtggacttctctcaattttc -3 ')[29]和P2R用於第二輪，產生外部和嵌套擴增子大小分別為1230bp和1028bp。PCR在Swift熱循環儀(Esco Micro Pte. Ltd, Singapore)上進行，反應液為50µl，包含10µl提取的DNA, 15 mM Tris-HCL (ph8)， 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2， 0.2 mM脫氧核苷酸三磷酸(ABgene, Epsom, UK)，每種引物50 pmol和1.5 U超溫Taq聚合酶(JMR Holdings, Kent, UK)。第一輪擴增條件如下:變性在95°C加熱3分鍾，每分鍾95轉40次°C 15秒，50秒°C 25秒，72秒°C, 35秒，最後72秒°C延伸步驟7 min。第二輪放大與上述相同，退火溫度提高到55°C. PCR產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色和紫外照明進行可視化。

HBV-G全基因組擴增

使用通用引物和Chook等人描述的改進方案[30]將整個HBV基因組擴增為4個重疊片段。用4個外引物組和4個內引物組(1a、2a、3和4)分別擴增940bp、1131bp、959bp和748bp的擴增物，擴增物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙胺染色和紫外照明可見。

乙肝病毒合並感染

用多重型特異性PCR方法檢測2例混合感染患者。引物集N1靶向HBV基因型為A、B、F、G，引物集N2靶向HBV基因型為C、D、E。存在一個以上的條帶表明與2個或2個以上的基因型合並感染。

按照製造商的說明將S/pol PCR產物(nt 260-1190)克隆到pGEM-T載體(Promega公司，Madison, WI, USA)中，進一步嚐試識別M-2015患者的混合HBV感染。

測序

用PCR特異性引物直接對S/pol基因和全基因組擴增子進行雙向測序。使用Big Dye終結者循環測序試劑盒(Applied Biosystems, Foster City CA, USA)。通過BLASTn分析確定HBV基因型，並使用基於web的geno 2 pheno程序(http://www.geno2pheno.org/index。php)．HBV全基因組片段在DNABaser v.4中組裝（http://www.dnabaser.com)．在Mega 6.06[32]中，使用Gen Bank的完整HBV-G基因組和2個南非序列進行1000次自舉重新采樣，構建了最大似然係統發育樹。

核苷酸和氨基酸分析

核苷酸和氨基酸分析和多樣性使用Mega 6.06和HBV數據庫(https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb)[33]。

基礎核心啟動子(BCP)和核心啟動子(PC)突變

通過將南非HBV- g基因組與參考HBV序列進行比對，確定了常見的BCP和PC突變。

耐藥突變

聚合酶基因對拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替諾福韋和替比夫定的耐藥突變采用在線基因2pheno程序(http://www.geno2pheno.org)．

CpG島的分析

啟動子區DNA甲基化可能改變基因表達，在HBV的調控中起作用。使用冰毒引物程序分析了2個南非分離株的CpG島的完整基因組，(http://www.urogene.org/methprimer)[34]和結果比較其他HBV-G序列。

Inter-genotypic重組

使用SIMPLOT程序和引導掃描分析來確定任何可能的重組事件。

血清型賦值

使用在線突變報告工具(http://hvdr.bioinf.wits.ac.za/tools)[35]。對HBsAg翻譯序列的5個氨基酸位置(122、127、140、159和160)進行分析，已知這5個氨基酸位置指定血清學亞型[36]。

道德的聲明

該研究設計符合2013年《赫爾辛基宣言》，並獲得了開普敦大學人類研究倫理委員會的批準(參考編號761/2016)。

結果
HBV基因型分布

在三級醫院肝病專科門診就診的患者隊列中檢測到的HBV基因型流行率為HBV- a (108/209;51.7%)， hbv-d (78/209;37.3%)、hbv-b (8/209;3.8%)， hbv-e (7/209;3.3%)， hbv-c (5/209;2.4%)和HBV-G (3/209;1.4%)。未發現HBV- f、HBV- h、HBV- i或HBV- J基因型(圖1)。

圖1:南非hbv陽性人群的基因型分布。

病人

本組患者的臨床及流行病學特征見表1。2例合並感染HIV，淋巴細胞CD4+計數分別為319和347細胞/mm3.分別。所有人都是HBe ag陽性，這意味著必須有一個功能的前核心基因，或與另一個HBV基因型合並感染，以提供一個功能的核心反式．病毒載量相似，範圍從log108.3 - -9.3國際單位/毫升。患者表現為肝功能障礙，有中度至高的Ishak (HAI評分)和升高的肝酶。這些受試者的旅行史是未知的。這可能為病毒是在當地還是在國外獲得提供了一些證據。

HBV-G全基因組分析

在2例HBV-G陽性患者的4個重疊片段中成功擴增出HBV-G的全基因組。沒有血漿可用來擴增患者L-2007的HBV-G全基因組，通過pol/S區491 bp區測序和BLAST n分析確定該患者的HBV-G。

南非HBV-G全基因組長度為3248個核苷酸(nt)， 1905 - 1942年期間在核心蛋白5 '端有36個特異插入，2個終止密碼子分別為TAA (nt 1817取代CAA)和TAG (nt 1896取代TGG)，分別位於前核區2號和28號密碼子位置。前S在nt 2915處也有3nt缺失(CAT)。對完整基因組的引導掃描未發現重組事件(數據未顯示)(登錄號KY004110-KY004112)。

將南非分離株的遺傳變異性與GenBank數據庫中的40個全基因組序列進行了比較，該數據庫包括來自世界各地的序列。總體遺傳距離為0.1 ~ 1.9%(平均0.5%)。患者M-2015和P-2014與共識HBV-G分別有4和7個nt差異，兩個分離株T2057G、C2070T、T2143C和G2465A均有4個nt變化，導致核心蛋白的3個氨基酸變化(表2)。P-2014有另外3個nt變化，A636T、A645C和A1764G，導致表麵蛋白和X蛋白的氨基酸變化(表2)。與所有HBV-G序列相同的是，科zac序列(nt 1809-1812)為GCAC。

p - 2014 m - 2015
核苷酸 氨基酸 核苷酸 氨基酸 蛋白質
A636T Y161F 表麵
A645C E164A 表麵
A1764G T /我131

X
T2057G S53A T2057G S53A 核心
C2070T S57F C2070T S57S 核心
T2143C T2143C
G2465A A189T G2465A A189T 核心

表2:HBV-G患者基因組中核苷酸和氨基酸的變化。

對推斷HBeAg表型的常見BCP/PC突變位點的分析發現，除了HBV-G簽名1896A突變(導致TAG停止密碼子位於28號位置)外，患者P-2014與其他所有HBV-G基因組1764A相比，有1764G。

聚合酶基因中未發現拉米夫定或其他核(t) ide逆轉錄酶抑製劑藥物(包括阿德福韋、恩替卡韋、替諾福韋和替比夫定)的耐藥突變。

在P-2014患者中，編碼HBsAg的表麵基因A636T和A645C (Y161F和E164A)的2個變化與疫苗逃逸突變無關。使用突變報告工具，兩名患者被分配了血清型adw2基於122K, 160K,127P, 159A和160T位置的氨基酸殘基。所有其他參考HBV-G分離株都是adw2也

2個南非HBV-G基因組被繪製為CpG島I、II和III的存在。這些CpG豐富島內的甲基化可能在調節HBV基因表達中發揮作用。在nt 1163-1628和2350-2494的兩名患者中，分別隻存在CpG島II和III，這與其他HBV-G序列中發現的相似(圖2)。但這兩個島的大小和位置與其他HBV-G基因組略有不同，尤其是CpG島II，在南非基因組和92.5%(37/40)其他HBV-G完整序列中，在1345和1356核苷酸之間存在11個核苷酸間隙。CpG島II與增強子I和X基因啟動子重疊，而CpG島III跨越聚合酶基因的起始密碼子。

圖2:南非HBV-G患者CpG島的分布。

係統發育分析

HBV-G和其他基因型之間的遺傳多樣性在最大似然係統發育樹中顯示(圖3A和3B)。南非HBV-G株的2個完整序列聚集在一起，並與GenBank中所有HBV-G參考序列聚集在一起(訪問2016年4月20日)。以分支長度表示的遺傳距離在HBV-G中明顯小於其他基因型。L-2007患者的HBV-G與其他HBV-G序列形成了一個明顯的分支(圖3B)。

圖3:一個。2個南非HBV- g基因組全基因組的最大似然係統發育樹和HBV基因型A-H的代表性序列。
B。3例南非患者pol/S區490片段和HBV-G代表性序列的最大似然係統發育樹。

合並感染

為了確定患者M-2015和P-2014是否合並感染另一種HBV基因型，采用Liu等人[31]的多重基因型特異性方法。用患者P-2014的N1引物擴增508 bp和228 bp的PCR產物，表明HBV-A和HBV-G同時存在。患者M-2015未檢測到額外的PCR產物。為了進一步研究後者是否合並感染，我們克隆了一個930 bp的S/pol基因片段，並對15個克隆進行了測序。BLASTn分析顯示所有克隆都包含HBV-G特異性插入(數據未顯示)。

討論

我們首次從非洲大陸報道HBV-G患者的臨床細節和基因組特征。我們在南非開普敦從2007年到2015年的9年時間裏發現了3名HBV-G患者。所有人都是男同性戀者，年齡在30到50歲之間。2例患者合並感染HIV, 1例合並感染HBV-A。

合並感染患者的肝活檢顯示中度至重度纖維化。現有的數據雖然相互矛盾，但表明HBV-G感染與晚期纖維化相關，導致肝髒疾病進展更快，特別是在HIV合並感染中[22,37]。Calin等人[38]的一項研究比較了同時感染HBV-G或HBV-non -G的HIV患者，結果顯示沒有這種關聯，並提示同時感染其他肝炎病毒和較低的CD4+細胞計數可能發揮更重要的作用。此外，表達人類肝細胞的嵌合SCID小鼠在感染HVB-G和HBV-A時比單感染小鼠[39]時纖維化增加。在我們的報告中，HIV合並感染患者CD4+細胞計數相對較低，為319和347細胞/ mm3.1例(P-2014)也合並感染HBV-A。

HBV-G無法表達HBeAg，因為在2和28號位存在2個停止密碼子，導致前核基因被截斷，因此沒有功能[10,13,40]。本研究中所有3例患者均為HBeAg陽性，這表明需要同時感染HBV或重組病毒才能提供HBeAg的前體——前核蛋白反式．在患者P-2014中發現HBV- a伴HBV- g循環，但在患者M-2015中未檢測到其他HBV基因型，多重PCR檢測限為102－103.基因型為HBV-A、HBV-B、HBV-C、HBV-D、HBV-G和104和105HBV-F和HBV-E基因型分別為[31]。M-2015患者pol/S基因克隆和測序均未發現其他HBV基因型。Komatsu等人[41]和Gong等人[42]的研究表明，對16或20個克隆進行測序，分別檢測出5%和6%的輕微HBV突變人群。然而，Araujo et al.[15]篩選了400多個克隆，發現了4個非HBV-G克隆。此外，可以用公式1-10^ [10log[0.05]/ n克隆][13]以95%的確定性計算出檢測少數群體的能力。因此，僅對15個克隆進行測序可能不足以檢測循環低於10%的少量非HBV-G人群。在這方麵，使用能夠檢測在>10%處循環的低水平病毒種群的下一代測序技術可能是更合適的方法[43]。innoo - lipa HBV基因分型線探針檢測也可能檢測到混合感染[44]。由於M-2015患者HBV-G全基因組啟動掃描未發現重組事件，重組病毒不可能合成HBeAg。這些結果將表明，如果存在，混合感染病毒的傳播水平低於所使用的檢測方法的檢測極限。 In the third patient, L-2007, there was no more sample available to determine if co-infection with another HBV genotype was present.

HBV-G單一感染很少被描述。一荷蘭獻血者報告了一例短暫的單一感染，HBeAg、HBeAb和HBsAg陰性，低病毒載量為288 IU/ml[13]。一名短暫檢測到HBsAg、HBeAg和HBeAb血清學標記陰性的德國獻血者將HBV-G傳播給2名血小板受體[45]。Cornelissen等人最近的一項研究確定了阿姆斯特丹MSM患者中5例可能的HBV-G單一感染病例。雖然無法擴增出其他基因型，但根據HBeAg狀態，隻有1例患者可被認為真正僅感染HBV-G。由於HBeAg的存在，我們的患者不太可能是單一感染。

在分子水平上，基因組在前核基因的2和28位包含2個停止密碼子，阻止HBeAg的合成[10,13,40]。所有HBV-G分離株在BCP中都存在雙A1762T轉位和G1764A轉位突變在體外而且在活的有機體內研究表明，降低前核mRNA的轉錄，導致HBeAg[47]的表達和分泌減少。在其他基因型中，這種雙1762T/1764A突變通常在HBV慢性感染[48]的晚期發生。有趣的是，病人P-2014在這個位置有野生型1764G。隻有1762T或1764A突變的分離株很少有報道，1764A的出現被認為是1762T/1764A雙突變發展的中間產物，因為1764A突變通常先於第二個1762T突變的產生[47-49]。這兩種突變也導致重疊X基因的非同義變化，導致氨基酸K130M和V131I的取代，這可能會影響多功能調控蛋白[48]。所有HBV-G分離株在核心基因翻譯起始密碼子附近插入36nt，在起始蛋氨酸之後立即添加12個氨基酸(DRTTLPYGLFGL)。這個插入也會影響包覆信號(Ɛ)的二級結構，該信號是引導基因組前RNA進入複製[34]的核心粒子所必需的。前3個核苷酸(TAG)輕微改變了Ɛ信號[11]下莖結構的堿基配對。關於這個36nt插入對病毒複製、核心蛋白表達和病毒粒子分泌的影響，有相互矛盾的報道。Li等人[34]顯示在體外單獨使用HBV-G不僅具有複製能力，而且具有更成熟基因組的病毒顆粒的核心蛋白表達和分泌效率更高。雖然最近Cotelesage等人[50]、Gutelius等人[11]和Sakamoto等人[51]的研究證實了核心蛋白的過度生產，但這些研究表明，病毒複製受損，插入導致較大的核心蛋白發生結構變化，阻礙了包膜和病毒分泌。一個可能的原因是，隻有HBV-G具有這種插入物，它維持了顆粒組裝所需的核心生產，以應對低pg RNA水平[11]導致的低複製能力。

基因表達可由DNA甲基化調節，甲基化與CpG二核苷酸有關，這些二核苷酸被稱為CpG島[52]。當這些島位於啟動子區域時，可發生高甲基化，導致轉錄水平[52]的基因沉默。HBV有4個啟動子，cp, sp1, sp2和xp，以及增強子I和II，它們對這些啟動子[48]有刺激作用。根據HBV基因型的不同，基因組有2-3個傳統的CpG島，即CpG I、II和III，在一些HBV- b、HBV- c、HBV- d、HBV- f和HBV- h分離株中還發現了3個新的CpG島[53,54]。HBV-G隻有CpG島II和III，在本研究分析的40個完整HBV-G基因組中，92%的CpG II存在缺口或“分裂”，證實了Zhong等人[54]的數據。在A、D、E和F基因型中也觀察到這種“分裂”表型，分別為2%、30%、29%和50%[54]。這種“分裂”是如何發生的，其生物學和臨床意義尚不清楚。CpG島II位於RNA轉錄、蛋白質產生和病毒複製中起重要作用的調控區域[48]。CpG島III包含P基因起始位點和核心基因3 '端重疊。CpG島在不同HBV基因型中的分布和數量可能影響甲基化介導的基因調控，從而影響臨床結局。

對2例患者(P-2014和M-2015)的完整HBV-G基因組進行係統發育分析發現，它們聚集在一起，與GenBank數據庫中所有HBV-G參考序列的係統發育非常相似。這兩個南非分離株的遺傳同源性具有4個獨特的核苷酸變化，這表明可能有一個共同的來源，不像L-2007在係統發育上更遙遠，形成了HBV-G樹的一個獨特分支。係統發育樹和序列相似性不能提供HBV-G是否在本地獲得的信息。

Lindh[27]認為HBV- g可能起源於非洲，因為它與HBV- e關係最為密切，後者被認為是一種流行於西非和中非的非洲病毒，隻在世界其他地區起源於非洲的HBV攜帶者[7]中發現。這兩種基因型之間的差異最小，為11%，並且在前S區有一個幾乎相同的30 nt片段，在該蛋白的氨基端有3 nt缺失[27,36]。因此，HBV-G可能通過與HBV-E[27]的重組事件獲得了30 nt片段。此外，這兩種基因型的遺傳多樣性程度都很低，它們都形成了一個單一的單係群體，沒有子基因型，這表明人類的進化史很近。Lindh[27]提出，這些共同的分子特征可能表明其地理起源在非洲。迄今為止，未在非洲血統的患者中發現HBV-G或HBV-G/E重組，本研究中描述的3例患者並非非洲黑人


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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Smuts H, Sonderup M, Gogela N, Spearman CW(2017)乙型肝炎病毒基因型G:來自非洲大陸的第一個完整基因組分析報告。J新興病毒3(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.130

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出版的曆史:

  • 收到日期:2017年5月2日

  • 接受日期:2017年5月17日

  • 發表日期:2017年5月24日