Krupa NavalkarTaek-Kyun金理查德·吉裏＊
係統生物學研究所，401特裏大道北，西雅圖，華盛頓州，98109，美國*通訊作者:Richard Gelinas，係統生物學研究所，美國華盛頓州西雅圖市特裏大道北401號，98109，電子郵件:rgelinas@systemsbiology.org
2013-2014年期間在西非發生的埃博拉病毒病(EVD)疫情提醒人們，這種疫情可能會無限期地持續下去。為了在可能的接觸後提高EVD的早期診斷，我們研究了疫情爆發前發表的研究數據，以確定是否可以在感染的一天內測定受感染宿主的變化，遠早於病毒蛋白或核酸的積累，而所有現有的測定都是基於病毒蛋白或核酸的積累。我們研究了感染紮伊爾埃博拉病毒(ZEBOV)後獼猴和人類外周血細胞基因表達的變化，以確定症狀出現前發生的宿主反應。我們鑒定了在感染後早期、中期和晚期表達差異的宿主mrna。從zebov特異性基因組中，我們預測了那些編碼分泌蛋白或膜相關蛋白的基因。我們確定了這些宿主反應mrna或蛋白質對，它們是早期ZEBOV感染的特征，以及其他對，它們可以將ZEBOV與其他常見病原體(瘧疾、鼻病毒、流感)區分開來，這些病原體可能在常規症狀出現之前成為早期ZEBOV感染的鑒別診斷候選。早期激活的四種關鍵免疫反應通路在晚期表達顯著降低，確定了關鍵控製點。我們認識到我們的方法的局限性在體外和體內來自人類細胞和非人靈長類動物感染研究的數據。但是，由於缺乏來自受感染個體的特定階段的血液蛋白圖譜，我們的方法顯示了如何對這些數據進行建模。鑒於最近發現ZEBOV可在感染後在幸存者體內存活數月，以及西非疫情中衛生保健工作者的巨大死亡率，改進診斷方法的需求仍然緊迫。
埃博拉病毒;宿主反應;Pre-symptomatic診斷;最高得分標誌對
ZEBOV:紮伊爾埃博拉病毒;EVD:埃博拉病毒病;TSP:最高得分組合;差異表達基因;PBMC:外周血單個核細胞;GEO:基因表達集合。
自1976年埃博拉病毒首次被描述為[1]以來，已經爆發了大約20次埃博拉疫情，但直到最近，大多數疫情都局限在中非的孤立村莊，每次疫情造成約300人死亡。但到2014年初，ZEBOV再次出現，並迅速蔓延到西非的利比裏亞、幾內亞和塞拉利昂，傷亡人數急劇增加。世界衛生組織現在估計，2013-2015年的疫情在利比裏亞、塞拉利昂和幾內亞造成了超過2.8萬人傷亡，超過1.1萬人死亡。幸運的是，國際應對措施幫助控製了疫情，疫苗試驗的早期結果令人鼓舞。但是，即使出現了抗病毒治療藥物和疫苗，並改善了公共衛生係統，但不可能消除埃博拉的自然宿主，這意味著病毒疫情將無限期地持續下去。另一個令人擔憂的問題是埃博拉病毒在人體內的持久性。最近的研究結果表明，在埃博拉患者恢複[5]期間，病毒可以存在於他們的眼液中。在另一項研究中，在最初發病[6]9個月後，埃博拉幸存者的精液中檢測到埃博拉RNA。一名男性幸存者通過性傳播埃博拉病毒給其女性伴侶的病例現已被記錄[7]。最近的埃博拉疫情凸顯了支持疫苗接種計劃、改善公共衛生係統和改善疾病監測的必要性。如果能夠對埃博拉感染進行症狀前診斷，就可以幫助管理未來的疫情，並有可能在發展中國家和發達國家挽救生命。 A rapid diagnosis based on early altered host responses may be possible days before a test that is based on the emergence of viral RNA or protein and thus could provide a medically useful early warning when the risk of a positive test is extreme, such as to the family member of an infected patient or to a health care worker.
現有證據表明，埃博拉感染會導致單核細胞或巨噬細胞等血細胞中宿主基因表達譜的顯著改變[8-11]。其中許多變化發生在臨床症狀出現之前，而且遠早於血液中病毒高滴度的積累。一些實驗室已經發表了關於感染埃博拉病毒的獼猴[8,10]或培養的人類細胞[9,11]的開創性研究。我們首先調查了公開的ZEBOV感染研究，並將這些RNA數據整合到完整的表達時間過程中。我們關注於感染後的前24小時，我們詢問ZEBOV感染引起的宿主變化是否可以與其他三種病原體(瘧疾、鼻病毒和流感)引起的宿主變化區分開來。接下來，我們確定了那些被預測編碼分泌蛋白或膜結合蛋白的早期基因，因為這些基因更容易在外周血中檢測。然後，我們確定了一對具有高分類能力的上調和下調基因，用於檢測感染或區分埃博拉感染與最初表現出相似症狀的其他病原體(瘧疾、鼻病毒、流感)感染。在兩個樣本(疾病與正常;可以找到病原體1和病原體2)，將樣品分為這兩種狀態[12-15]。最後，由於早期的報道概述了ZEBOV感染後哺乳動物生理的選擇性變化[11,16-20]，我們使用我們的綜合時間過程數據詳細說明了早期發生的免疫激活的廣泛模式，但隨後出現了嚴重的免疫抑製。 We suggest that the early candidate marker RNAs or proteins we described, if confirmed with further work, could become the basis for a pre-symptomatic blood diagnostic test. Because no data is publicly available from blood samples from all infection stages from a human infected with ZEBOV, we recognize the limitations of our approach but present it here as a step towards the goal of early diagnosis.
材料與方法
為了建立ZEBOV感染後血液中基因表達變化模式的完整時間過程，我們重新分析和整合了來自四項研究的差異表達基因(DEGs):來自感染的獼猴在活的有機體內或者被感染的原始人類巨噬細胞在體外如圖1所示。在可能的範圍內，我們應用了為各自微陣列平台推薦的統一數據縮減方法。獼猴研究提供了zebov感染後24小時至144小時的微陣列基因表達數據，來源於基因表達綜合(GEO)樣本GSE8317[8]和GSE24943[10]，而人類研究提供了zebov感染後1小時至24小時的數據，來源於GSE31747[11]和GSE24125[21]。這些來源研究的範圍各不相同，但我們隻重新檢查了來自感染的人巨噬細胞的數據在體外或者是被感染的外周血單個核細胞在活的有機體內而不是其他細胞類型或藥物處理細胞的數據。我們回顧的四項zebov感染研究以及流感、鼻病毒和瘧疾感染的研究在補充圖1和表1中列出。當前研究中所有重新分析的數據都保存在GEO數據庫中，編號為GSE83331。
圖1:用於此分析的人類和獼猴ZEBOV感染研究概要。微陣列數據來自四項已發表的研究，涵蓋了整個感染周期。
一個。紅色、綠色、紫色或藍色箭頭表示從兩個感染埃博拉病毒紮伊爾(ZEBOV)的人類巨噬細胞研究或兩個感染ZEBOV的獼猴研究中選擇的微陣列分析時間;B。A.研究中差異表達基因的數量(p≤0.05，折疊變化≥±1.5)用藍菱形表示，作為ZEBOV感染後時間的函數。早期(感染後0-24小時)、中期(感染後48-96小時)、晚期(感染後96-144小時)出現差異表達的基因組;C。早期、中期和晚期差異表達基因的重疊。在3669個早期基因中，大量基因與中期(1012個)或晚期(2613個)研究期重疊。
對於GSE8317[8]，在ZEBOV感染獼猴感染前和感染後1、2、3、4、5和6天采用微陣列雜交技術對其外周血單個核細胞進行了分析。每天有2到11個來自不同動物的微陣列樣本。共有15個感染前和33個感染後的獨特檔案被重新分析。我們得到了各組動物在感染前(出血前)和感染後每個時間點的deg。GSE8317包含一個包含37,632個探針的微陣列，代表大約18,000個人類基因，通過它們之間的顯著序列同源性來測量獼猴基因的表達。將包含Cy5(治療通道)/ Cy3(控製通道)的log2比值的.txt文件中的“VALUE”列導入安捷倫的genspring GX軟件進行中位基線轉換後分析。
在GSE24943中，我們重新檢測了來自感染ZEBOV的獼猴外周血單個核細胞的基因表達數據，Yen等人對這些細胞進行了較長時間的跟蹤。deg來自4種感染前和10種感染後的動物，這些動物不屬於本研究測試的研究藥物的一部分。通過比較每隻動物感染後和感染前的微陣列基因表達數據來計算deg。感染後3天有3組微陣列數據，感染後6天有4組，感染後7天、8天或9天有1組數據。GSE24943和GSE24125包含兩個通道數據，其中Cy3(綠色染料通道)是通用的人類參考，Cy5(紅色染料通道)是埃博拉感染或模擬處理的樣本。在設置中值基線之前，對這些數據集的兩個通道的背景校正中值信號強度值進行低階平滑歸一化，以排除數據中與染料偏差相關的偽變異。
ZEBOV感染的原代人巨噬細胞的數據有兩個來源:GSE24125[21]和GSE31747[11]。在前一項研究中，從2個供體中分離出原代巨噬細胞，並在感染後2、4、8、12和24小時獲得7個對照剖麵和7個感染剖麵的微陣列。從後一項研究中，微陣列數據來自6個對照剖麵和6個感染後1小時和6小時的感染剖麵。在非人類靈長類動物研究中，每個時間點都有deg。GSE31747包含Affymetrix微陣列(平台:HGU95Av2)，在使用genspring GX軟件設置中位基線之前，使用穩健的多陣列歸一化將其總結到探針級別。由於GSE31747中埃博拉感染樣本與模擬刺激樣本的均值差異較小，因此對[22]中先前描述的數據應用了調節t檢驗，使用漸近計算的p值，在p≤0.05的截止點處，折疊變化≥±1.5，沒有任何多重假設檢驗校正。使用未配對的學生t檢驗從剩餘數據集中推導出deg，臨界值為p≤0.05，折疊變化≥±1.5。在推導deg時，Benjamini-Hochberg多重測試校正在四項原始研究中均未應用，由於它排除了所有或幾乎所有的deg，我們也沒有在任何時間點應用於本研究。然後，我們將這些基因分組，分別在感染後早期(0-24小時)、中期(48- 72小時)和晚期(96-144小時)表達，如圖2所示。
圖2:ZEBOV早期、中期和晚期基因表達差異最大
瘧疾感染的血液特征來自數據集GSE5418，不包括氯喹數據[23]。對原始數據進行彙總，分位數歸一化，並在單個探針水平上設置中位數基線。然後，在沒有任何多重假設檢驗校正的情況下，使用置換計算的p值(臨界值p≤0.05，折疊變化≥±1.5)導出差異表達基因。流感病毒(H1N1，株A/WS/33, ATCC IV-1520)和鼻病毒(RV16)的特征來自數據集GSE71766[24]，差異表達基因(列於原始出版物的補充文件5)用於與埃博拉和瘧疾的差異表達基因進行比較。
我們在操作上將ZEBOV感染的早期階段定義為1-24小時，中期為48-72小時，晚期為96-144小時。前期結合GSE31747、GSE24125和GSE8317的數據，中後期結合GSE8317和GSE24943的數據。在去除重複條目後，將ZEBOV早期基因與瘧疾感染的血液[23]或人支氣管上皮細胞感染鼻病毒或流感病毒[24]後差異表達的基因進行比較。
除了血液來源的mrna外，豐富的分泌或膜相關蛋白可能是早期檢測的實際目標。因此，通過在三個數據庫(包括基因產物的細胞定位信息)中搜索3669個早期mrna，可以從早期差異表達mrna列表中識別出被預測編碼分泌蛋白或與細胞膜相關的蛋白質的mrna:基因本體細胞聯盟[25]，人類蛋白質圖譜[26];亞細胞蛋白定位' Compartments '[27]數據庫。在基因本體論、人類蛋白質圖譜和隔間搜索中，我們使用關鍵詞“細胞外或囊泡”、“分泌蛋白”和“細胞外”來識別編碼分泌蛋白的mrna。對於膜蛋白，三個數據庫也都使用了“質膜”。搜索結果是人工篩選假陽性和陰性的，總共產生了581個可能編碼分泌蛋白或膜相關蛋白的mrna(補充圖3)。
圖3:ZEBOV早期基因與差異表達的瘧疾、鼻病毒或流感基因的比較
一個．與瘧疾、鼻病毒和流感病毒相比，ZEBOV早期基因上調。
B。與瘧疾、鼻病毒和流感病毒相比，ZEBOV早期基因下調。
微陣列數據來自5個GEO數據集(Malaria, GSE5418;埃博拉病毒，GSE8317, GSE31747, GSE24125;流感病毒，鼻病毒和兩種病毒，GSE71766)合並，鑒定出6795個共同基因。在獲得頂級評分標記對之前，對每個基因的歸一化探針信號強度進行平均。最高評分對(TSP)分析使用Bioconductor提供的R包進行。3.2)使用' ktspair ' R包[29]推導出' tspair '[28]和k-Top評分對(k- tsp)。k-TSP分析基於ZEBOV感染後(0、1、2、4、6、8、12和24小時)的人類巨噬細胞和獼猴PBMC的早期時間點表達數據，感染流感、鼻病毒和兩種病毒(RVIV組)後2、4、8、12和24小時後的人類支氣管上皮細胞(BEAS-2B)以及接觸瘧疾個體的人類PBMC的早期時間點表達數據。使用' tspcalc '函數計算tsp評分，並使用' tspsig '函數進行置換檢驗。在這個測試中，p值是基於空TSP得分分布計算的，該分布是通過排列組標簽1000次計算得出的。補充圖4總結了使用' ktspair ' R包獲得的' k '個最高得分對的結果。 The accuracy is estimated by using the listed kTSPs per comparison and computing the performance of the group using a 15 fold cross-validation (functions: ‘cv2’, ‘ktspcalc2’ within the ‘ktspair’ R package).
圖4:識別ZEBOV特異性上下調控探針，編碼來自微陣列探針數據的膜相關或分泌蛋白。其中324個探針能唯一識別編碼膜蛋白或分泌蛋白的上調基因，275個探針能識別編碼膜蛋白或分泌蛋白的下調基因。“埃博拉-spec-up”:埃博拉病毒特異性基因上調;“埃博拉- specdo”:埃博拉特異性下調基因;“ESpeEx/secr”:埃博拉病毒特異性基因，編碼細胞外、膜相關或分泌蛋白。一些微陣列探針(225,55)被評分，因為上調和下調都來自交叉雜交，在分析之前沒有被過濾掉。
ZEBOV感染早期、中期和晚期的上調或下調的DEG根據KEGG聯盟[30,31]、BioCarta[32]、PANTHER[33,34]和REACTOME[35,36]通路編譯的生物過程進行繪製，使用嵌入在DAVID程序套件中的通路富集工具(用於注釋、可視化和綜合發現的數據庫;https://david.ncifcrf.gov/home。jsp)[37-39]。為了識別ZEBOV感染後失調的特定生物通路的deg，使用改進的Fisher精確測試，使用DAVID的功能注釋工具箱計算p值為0.1。然後使用Adobe Illustrator將T細胞和B細胞信號通路以及toll樣和nod樣受體信號通路的deg映射到KEGG通路上。
我們從四項已發表的研究中鑒定出在埃博拉病毒感染過程中被感染的血細胞中表達差異的宿主基因，如圖1所示。我們從兩項感染人類血液來源的原發性巨噬細胞的研究中獲得了deg在體外ZEBOV[11,21]和兩項研究，其中獼猴體內和外周血單個核細胞感染ZEBOV[8,10]。在後兩項研究中，受感染的獼猴被跟蹤，直到它們死亡並被安樂死。所有數據(包括對照資料)均來自基因表達集。我們分析了144小時內15個時間點的數據，如圖1A所示。如圖1B所示，從人類和非人類靈長類動物研究中獲得的從感染開始到感染後24小時的8個時間點的DEGs被組合成早期組，從48-72小時的3個時間點的DEGs被組合成中間組，從96-144小時的DEGs被組合成晚期表達的基因組。使用最終標準p<0.05和log的折疊表達變化，從原始數據中重新推導出deg2±1.5，如方法所述。由於我們建模的感染時間過程數據是基於已知的、相對較高的感染多樣性，並且發生在受控的情況下在體外或在活的有機體內條件，它可能代表了一個比自然感染更快的整體感染時間過程。我們獲得了超過3669個基因在早期有差異上調或下調表達，2786個基因在中期有差異表達，超過7728個基因在晚期有差異表達。圖1C顯示了從人類和獼猴數據中提取的早期基因與中間和晚期基因組(完全來自獼猴數據)之間的大量重疊，這驗證了使用獼猴來模擬人類對ZEBOV的反應以及我們對這些數據的使用。圖2顯示了ZEBOV感染這些階段表達差異最大的30個基因(向上或向下)。補充圖2顯示了感染後早期、中期和晚期的上下差異表達基因的完整列表。
瘧疾和霍亂在西非大部分地區流行，患者可能會出現與埃博拉病毒類似的早期症狀，包括惡心、頭痛、肌肉和關節痛。因此，一種區分ZEBOV和其他常見病原體的簡單護理點測試在農村診所將非常有價值。為了探索更廣泛的鑒別診斷的可行性，我們比較了埃博拉病毒的DEG與瘧疾、鼻病毒和流感病毒的DEG。(我們無法找到適合霍亂的數據集。)從感染的血液[23]中獲得了瘧疾的特征，而在感染人支氣管上皮細胞株BEAS- 2B[24]後獲得了鼻病毒16或流感(H1N1株A)的特征。事實上，ZEBOV早期探測的子集與瘧疾、鼻病毒或流感病毒的特征並不重疊，如圖3所示。圖3A為上調ZEBOV基因重疊圖，圖3B為下調ZEBOV基因重疊圖。在圖3A和圖3B中鑒定的具體上調和下調調控基因分別在補充圖5和6中詳細展示。宿主對ZEBOV感染的早期反應可能與瘧疾和兩種常見病毒有所區別，這表明可能存在一種特定和選擇性的診斷方法。瘧疾的臨床表現可能因許多因素而異，包括受試者的年齡和病史或感染史、他們的一般健康狀況、感染階段和目前超出我們比較範圍的其他因素。 While many other endemic pathogens such as cholera or other viruses should be compared to the Ebola early genes, the current comparison represents a first step to a more comprehensive differential diagnosis assay. But the finding that specific blood cell mRNAs distinguish these common infections and the identification of pathogenspecific genes that encode blood proteins may stimulate future studies.
接下來，我們確定了ZEBOV早期上調或下調基因的子集，這些基因被預測為編碼分泌或膜相關蛋白，因為這些可能很容易在基於簡單血液樣本的檢測中檢測到。這些蛋白質是根據圖1C所示的早期、中期和晚期埃博拉基因列表預測的，並與圖3A和3B中確定的埃博拉選擇性探針進行了比較。圖4顯示了編碼膜蛋白或分泌蛋白的324個上調和257個下調的埃博拉特異性早期基因。這些預測的蛋白質列在補充圖3中。通過這種過濾和比較過程，預測的候選埃博拉特異性蛋白包括許多熟悉的趨化因子(CCL16, CCl7)，細胞外基質蛋白(COL6A2, COL4A4)，細胞外金屬蛋白酶(MMP1, MMP2, ADAM17)和許多白介素(IL8, IL9, IL10, IL16, IL18)。這些分泌的宿主源蛋白的組合可以作為區分ZEBOV感染與未感染血液樣本的適當靶點進行測試。
由於在兩種不同條件之間具有互反表達的標記對可以在兩種狀態(即感染)之間進行分類vs未感染;感染病原體1vs2)我們獲得了得分最高的標記對，可以簡化zebov感染血液與未感染或地方病(如瘧疾)的分類。如方法所述，使用“tspair”R包識別的得分最高的基因對對樣本進行分類，這取決於它們在給定數據集中的相對排名。圖5 A總結了埃博拉感染血液與未感染血液或與其他病原體感染相比的最高得分標記對。圖5B到5G確定了與其他病原體(組2)相比，最能將埃博拉感染(組1)、未感染(組2)或埃博拉(組1)區分開來的標記對。每個麵板顯示了一個基因對的一個成員的表達，例如grip1，作為對另一個成員POU2F1表達的函數，根據其組，用紅色或藍色的點表示。黑線表示區分給定標記對的兩組的分類邊界。在圖5B中，我們獲得了得分最高的標記對，將未感染血液感染的ZEBOV和暫時的ZEBOV分類為來自瘧疾的ZEBOV(圖5C)，來自流感感染細胞的ZEBOV(圖5D和5E)，來自鼻病毒感染細胞的ZEBOV(圖5F)，以及來自同時感染流感和鼻病毒的細胞的ZEBOV(圖5G中的RVIV組)。如果我們在圖5中提出的標記對可以用臨床樣本進行驗證，診斷測試的成本和複雜性就會變得更簡單。k-top評分對的完整列表，包括那些被預測編碼分泌或膜相關蛋白的標記對，見補充圖4。這些標記對是為每個比較單獨衍生的，除了一個基因對(KDM6A-MT1X)外，它們沒有顯著重疊，因此可以在基於血液的檢測中組合以獲得更強的分類能力。這些標記對在正確區分感染樣本和未感染樣本方麵的強大表現，鼓勵我們重複這一計算，因為來自埃博拉感染和來自西非和中非流行的其他病原體(如霍亂)的血液基因或蛋白質表達譜的更好數據變得可用。 We presented them here, since they offer specific hypotheses for follow-up and also because they may help the designer of a point-of-care device who needs the greatest sensitivity and specificity possible from a small number of diagnostic markers. Although we report top scoring pairs of markers based on expression data, we recognize that the corresponding proteins would need to be validated as the basis of a field-deployable assay.
圖5:分類ZEBOV感染的最高得分標記對。已鑒定出具有相互表達譜的基因對，這些基因對具有從未感染樣本中分類ZEBOV感染或從其他病原體中分類埃博拉的能力，並按照方法中所述進行排序。；
一個。彙總表顯示了五個診斷比較中每一個具有高分類能力的基因對。將埃博拉感染血液(第1組)與未感染血液(第2組)進行分類的最高評分標記對是GRIP1和POU2F1B。grip1和POU2F1的表達數據圖(藍色:未感染/紅色:ZEBOV感染);C。從ZEBOV感染血液中鑒別瘧疾感染血液的最佳標記對是OPHN1和VAMP5(藍色:瘧疾感染/紅色:ZEBOV感染)故選d。區分ZEBOV感染和流感感染樣本的最佳標記對是KDM6A和MT1X(標繪)或SLC24A1和tram2(藍色:流感感染/紅色:ZEBOV感染);F。從ZEBOV感染細胞中區分鼻病毒感染的最佳標記對是CASC3-PSME1(藍色:鼻病毒感染/紅色:ZEBOV感染);G。標記物配對kdm6a - mt1x還從ZEBOV感染細胞中對同時感染鼻病毒和流感病毒(RVIV)的細胞進行分類(藍色:鼻病毒+流感病毒感染/紅色:ZEBOV感染)。
如圖6所示，我們將早期、中期和晚期組中發現的差異調控基因映射到KEGG通路所代表的生物過程中，其中顏色表示基於映射到該通路的基因數量的p值。幾種免疫係統途徑在感染早期具有廣泛的免疫激活模式，隨後基因表達普遍下降。補充圖7給出了圖6中32個通路的基因列表，適合對這些通路進行詳細的探索。為了以一個基因一個基因的方式說明這一點，我們繪製了兩種適應性免疫途徑的早期上調基因和晚期下調基因，T細胞受體信號通路和B細胞受體信號通路以及兩種先天免疫途徑:toll樣受體信號通路和核苷酸結合寡聚(NOD)樣受體信號通路(圖7)。在圖7所示的所有主要的適應性和先天信號通路中，早上晚下的基因節點都太常見了。補充文件7中的數據將支持今後對其他途徑的類似探索。補充圖8A到8D更詳細地展示了這些途徑。
圖6:通路因埃博拉感染而豐富。通過改進的Fisher精確測試，在DAVID中從埃博拉感染的早期、中期和晚期獲得的deg中富集了通路。富集的特征取決於DEG是否被上調(梯度:白色到紫色)或下調(梯度:白色到藍色)。在給定的基因列表(早，中，晚-上/下)中富集的給定通路的著色基於通過Fisher精確測試獲得的p值的- log10。
圖7:適應性和先天免疫反應途徑:早期活躍，但後期被抑製。nod樣受體信號通路和toll樣受體信號通路的先天免疫通路和B細胞或T細胞信號通路的適應性免疫通路用彩色符號繪製，描繪早期上調、晚期下調或同時顯示早期上調和晚期下調的節點。雖然早期(0-24小時)開始迅速和平衡的免疫反應，但在感染後晚期(96-144小時)，這種模式在數量驚人的關鍵調控因子的mRNA水平上被逆轉。
我們的研究包含了Wahl-Jensen et al.[11]的數據;他們描述了ZEBOV體外感染後早期人類巨噬細胞中的基因表達。這些研究人員確定了許多途徑或生物過程在感染後1小時(43個途徑)或6小時(60個途徑)發生改變，包括免疫反應途徑。我們在圖7中對免疫反應通路的詳細探索讓我們明確地確認了IL-10、TNFα、IL-8、CXCL1和IL- 1β的上調，正如之前在[11]中提到的那樣。我們還證實，在ZEBOV或VP35 IRF-3相互作用域突變的變體感染肝細胞後，先天免疫反應受到強烈抑製，這是Hartman等人先前描述的。Hartman等人注意到野生型病毒的IRF-3失活，而突變型病毒沒有。我們首先注意到IRF- 5的上調，然後強烈下調，以及整個toll受體信號通路導致IFN-α和IFN-β的產生受損(圖7和補充文件8C)。圖6顯示了細胞周期、p53信號通路和趨化因子信號通路的差異調控，證實了Panchal等人從他們對ZEBOV感染小鼠模型的研究中得出的報告。圖6也證實了先前Barrenas等人在ZEBOV感染獼猴的研究性疫苗試驗研究中所描述的T細胞信號通路和toll樣受體信號通路的激活。Yen等人[10]報道稱，在接受凝血抑製劑預防性治療的獼猴中，CCL8/ mcp -2的mRNA增加，凝血相關基因TFPI和PDPN mRNA減少，並繼續在ZEBOV感染中存活。他們認為，這些基因產物可能是zebov感染後生存的有用標記。 We have no evidence for differential up-regulation of CCL8 in our early data perhaps because the data from Yen et al was not part of our early gene group; it only contributed to our middle and late gene groups. Wauquier et al. [40] measured the levels of many cytokines and growth factors from individuals with fatal Ebola infections. Consistent with their results, we confirmed that the mRNAs for IL-1β, IL-8, MIP-1α, MIP-1β were up-regulated early, but in addition we noted that mRNAs for TNFα, CCL5(RANTES), CXCL1, MIP-2, CCL2, IL-18 and CD40 were also up-regulated early. More recently Ruibal et al. [41] described how the T cell inhibitory molecules CTLA-4 and PD-1 were much higher in patients who did not survive Ebola and lower in survivors. Consistent with this, our study that included data from macaques that did not survive ZEBOV infection showed a broadly based activation of the T cell response early, including elevated CTLA-4 mRNA as well as mRNAs for key components of the pathways that lead to normal T cell activation (PI3K-Akt; MAPK signaling; p38 signaling), as shown in Supplementary File 8A. But at late times, this pattern was reversed, consistent with T cell suppression.
我們的研究基於對四個獨立數據集的重新分析，這些數據集來自感染ZEBOV的人類和獼猴在體外或在活的有機體內，在2014年之前的文獻中都可以找到。盡管數據來自人類和獼猴的感染研究，但許多早期的DEGs在物種之間是共享的，並且許多早期的DEGs在感染周期的後期繼續表達。我們承認，在受感染的非人類靈長類動物或培養細胞中，基因表達變化的速度可能與受感染的人不同。因此，我們隻是選擇早期的數據，從感染時間過程的前24小時作為解決問題的務實方法。其他不確定因素也會導致一個人何時可能首次意識到自己被病毒感染(劑量、進入入口;特定的毒株)或特定的個體(一般健康狀況、個體自身先天和適應性免疫曆史和狀態、對不適的耐受性、對症狀的認識)。我們承認，這裏提出的基因對代表著邁向更先進的診斷方法的開始，它們可能與人類患者在整個感染周期中宿主反應的血液譜不同。例如，來自粘膜表麵的標記物在這裏可能代表性不足，因為我們研究的數據來自快速進展的對照在活的有機體內而且在體外來源。但是，如果ZEBOV感染人類早期階段的血液來源的mrna或蛋白質圖譜變得可用，我們的信息學工作流程應該被重複，宿主標記的列表將得到改進。最高評分標記對的局限性包括這些標記對基於微陣列基因表達數據，而不是(理想情況下)差異表達的血清蛋白水平。我們承認，ZEBOV標記物與我們提出的其他病原體標記物的比較受到我們比較的不同細胞類型的限製(流感病毒和鼻病毒的巨噬細胞和外周血單核細胞與感染的支氣管上皮細胞)，因此錯過了重要的細胞類型差異。同樣，從血液蛋白譜中獲得病原體分類標記物應該是開發更強大的早期診斷測試的下一步。一種全麵的診斷試驗當然是有價值的，它可能包括西非流行的其他感染的宿主標記物，如霍亂、傷寒或其他出血熱病毒，如拉沙或馬爾堡病毒。這種測試的開發和驗證需要相當多的時間、成本和複雜性，超出了當前研究的範圍。我們與ZEBOV數據比較的流感反應來自支氣管上皮細胞，而不是血細胞。我們知道，現在可以獲得流感血液圖譜，如果這項工作得到擴展，可能會提供更多信息。
隻要人類和ZEBOV共存，在可預見的未來，對準確、敏感和廉價診斷方法的需求將繼續存在。事實上，可靠的陰性結果(即未感染)對於疫區或世界上任何懷疑感染埃博拉的地方的衛生保健工作者、感染者的家庭成員和普通公眾來說，與陽性結果同樣有價值。自1976年[1]以來，西非和中非約發生了20起疫情，今後還將繼續發生更多疫情。如果分配到EBOV爆發地區的衛生保健工作者在與感染或潛在感染患者工作後收到陰性檢測結果，他或她將獲得安心並可以返回工作崗位。如果檢測結果呈陽性，可以對該工人進行隔離，開始支持性護理，重新檢測EBOV或其他相關病原體，並有望在未來開始抗病毒治療。事實上，在西非的疫情中，有800名醫護人員感染了埃博拉病毒，其中500人當場死亡，這強調了早期發現的必要性。家庭成員或任何與檢測結果呈陽性的感染者有過偶然接觸的人也可以采取上述行動。事實上，隔離本身就可能限製疾病的傳播。由於這些原因，一旦得到驗證，一種能夠在21天潛伏期內盡早識別活動性感染的新診斷方法在發達國家和發展中國家都將受到重視。
即使出現了針對埃博拉病毒的治療方法和疫苗，仍然需要一種特定的、敏感的、廉價的即時檢測方法，以便在可能接觸埃博拉病毒後早期從血液樣本中區分感染者和未感染者。基於宿主反應的檢測方法可以獨立於檢測埃博拉基因組或基因產物的其他檢測方法。在這裏，我們使用了一個實用的信息學工作流程，從zebov感染的血液衍生細胞中識別標記物，這些標記物代表了此類檢測的候選對象。如果人類感染時間過程研究的數據能夠獲得，候選標記物應該得到改進。我們認為，令人驚訝的是，基於宿主反應的血液標記物可能不僅有足夠的能力識別ZEBOV感染，還可以同時識別其他常見病原體。這種檢測方法可以在適當的情況下進行常規的病毒蛋白或核酸檢測。雖然最近的埃博拉疫情已經平息，但最近幾內亞報告了新的疫情(Guilbert, K. 2016年3月18日;路透社)的研究強調了對一種敏感、準確、廉價的即時診斷方法的需求，這種方法可以在感染周期的早期根據宿主蛋白質反應檢測感染。
這項工作得到了美國國家科學基金會(RAPD獎151330)以及係統生物學研究所的支持。我們感謝Kathie Walters和Jeff Boore對手稿的批判性閱讀。
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Aritcle類型:研究文章
引用:王曉明，王曉明，王曉明，等(2017)埃博拉病毒感染的症狀前診斷。J Emerg virrol Dis 3(1): doi http://dx.doi。org/10.16966/2473 - 1846.129
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