摘要

可可腫芽病毒(CSSV) [Badnavirus, Caulimoviridae引起可可芽腫病(Theobroma可可L.在西非。從~2002年開始，曾經有效檢測CSSV的試驗未能在加納和科特迪瓦約50-70%有症狀的可可植物中檢測到病毒，這表明可能出現了一種無特征的CSSV變種。對來自科特迪瓦的無症狀和有症狀的可可和非可可植物樣本進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，使用8個不同的序列特異性和/或簡並引物對，預期擴增子大小為375-1100個堿基對。pcr擴增的頻率是可變的，取決於樣品-引物組合。盡管有典型的cssv樣症狀，但沒有在所有有症狀的樣本中檢測到病毒，一些無症狀的樣本為cssv陽性。利用從每個引物對擴增子中確定的DNA序列的最大似然分析，係統發育分析將兩到三個組分為兩組，其中兩組與之前報道的CSSV分離株密切相關，第三組為之前未描述的組。基於badnavinvirus物種閾值≥80%的基因組分類信息RT-RNase H區域的成對核苷酸(nt)一致性，分析該位點對應的部分片段，在pcr擴增的場分離物中確定了4個CSSV組，nt一致性為66-99%。此外，對CSSV基因組中多達7個額外區域的序列分析揭示了廣泛的基因組內變異。這些發現為與西非可可芽腫病症狀相關的多種、不同的CSSV變異的廣泛基因組變異提供了有力的證據。

關鍵字

Badnavirus;Caulimoviridae；dsDNA病毒;突現植物病毒;Mealybug-transmitted病毒;Pararetrovirus

簡介

Theobroma可可(L.)或可可(錦葵科)，種植用於製造巧克力，糖果和非食品產品的豆。全球超過70%的大豆供應在西非生產，使其成為經濟和糧食安全的重要作物[1]。害蟲和病原菌(包括真菌[2]和植物病毒[3,4])造成的食性損害會降低豆類的產量和質量。的可可腫芽病毒(CSSV)[5]是已知感染可可樹的植物病毒中最具經濟價值的病毒。該病毒最早於1936年在加納的可可中發現。它在整個西非地區流行，包括科特迪瓦[7,8]、尼日利亞[9,10]、塞拉利昂[11]和多哥[12,13]，感染許多未栽培的Bombacaceae、錦葵科、蒺藜科和菊苣科[14-16]。此外，可可中CSSV的暴發與農場與原生森林樹木的鄰近程度有關，疾病流行率和隨後的傳播速度受到海拔、降水和溫度的影響[17]。

CSSV被分類為屬Badnavirus(科，菜心病毒科)(18、19)。CSSV的雙鏈環狀DNA基因組大小約為7.0-7.3千堿基對(kbp)，被包裹在一個128 × 28 nm的無包膜杆菌狀顆粒[20]中。壞病毒基因組在病毒正鏈上有一個間斷[21,22]，即DNA負鏈反轉錄啟動位點的位置[19,23]。CSSV基因組編碼4到6個開放閱讀框(orf)，命名為ORFs 1-4、X和Y[8,21,24]。盡管許多病毒基因的功能尚不明確，但已知ORF2編碼一個核酸結合蛋白[25]，而ORF3編碼一個被加工成運動蛋白(MP)、外殼蛋白(CP)和逆轉錄酶(RT)的多蛋白，以及一個天冬氨酸蛋白酶(AP)和核糖核酸酶H (RNase H)[24]，分別在多肽裂解和RNA水解中起作用。

可可樹CSSV感染引起的症狀從輕微到嚴重，並隨季節而變化，在每個雨季之後生長的新茂盛植物上最為明顯和嚴重。葉片症狀主要發生在新發育的葉片和幼葉上，表現為紅色和綠色脈帶，或黃或白綠色馬賽克。新的營養生長生長從樹的基部或樹幹，稱為芽，發展膨脹，由病毒誘導的韌皮部增殖[26]。在症狀發展後的3-5年內，受感染的樹木會發生枯梢、衰退，然後死亡。與未感染cssv的樹相比，感染cssv的樹產出的豆莢和豆子更少，豆子的大小和質量都降低了。

CSSV由14種粉蚧以半持續的方式傳播[28,29]，但不是花粉或種子傳播的[30]，盡管有證據表明它可以在[31]種子中短暫檢測到。CSSV的長距離和短距離傳播因人類介導的受病毒感染的可可切屑的交換而加劇。

疾病管理依賴於用無病毒的種植材料替換受感染的樹木，這些材料可以是從種子生長的，也可以是最近的幼苗[32-34]。此外，使用輕度株係如N1或SS365B的交叉保護在降低CSSV嚴重株係1A的影響方麵初步顯示出了希望[35,36]，然而，最近的一項研究發現，CSSV嚴重株係的傳播隨著時間的推移而增加，導致輕度分離誘導的交叉保護的有益效果惡化，並導致樹木[37]的壽命縮短。化學控製粉蚧媒介在降低病毒傳播率方麵幾乎沒有表現出希望[38,39]。然而，可可農場向以前未開墾的地區擴張，同時放棄可作為CSSV接種源的患病農場，導致病毒通過粉蚧病媒[1]傳播到新的種植園。長期的疾病管理已經通過1940年代建立的育種計劃進行了嚐試，並一直持續到現在，以發展CSSV抗性。這些努力利用了從南美洲亞馬遜盆地引入西非的可可種質，然而，即使在一段時間內有效，抗藥性也沒有被證明是持久的[40-43]。盡管進行了管理努力，但病毒感染仍繼續表現為典型的csssv症狀，最近，迅速下降和死亡表型首次出現在2000-2002年期間的加納西部，然後在2003年以後的科特迪瓦東部和西部出現了[44]和多哥[45]。尚未確定在發生疫情的不同地點觀察到的相似症狀表型是否與相同的CSSV變體有關。

此前，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)在西非被廣泛用於CSSV檢測[10,46,47]。最近，ELISA檢測未能在從症狀樹中分析的約25-30%的樣本中檢測出CSSV。到目前為止，尚無血清學或分子診斷試驗可用於全麵檢測CSSV。

7個完整的CSSV基因組序列已存入NCBI GenBank數據庫。它們的大小在7006-7297 bp之間，共同具有71-98%的核苷酸(nt)身份(作者，未發表數據)。基於對7個基因組序列的比對，設計了PCR引物來擴增CSSV ORF1[48]或ORF3[49]的一個片段。然而，在加納[30,50]、科特迪瓦或多哥[13,49]檢測的所有有症狀的葉子樣本中，都沒有發現引物組合能夠檢測出CSSV。檢疫單位采用了一種用於外來種質中CSSV檢測的替代做法，即將可疑植物的接穗嫁接到CSSV易感的“Amelonado”砧木上，然後對指示植物進行為期三年的定期檢查，在嫁接後尋找CSSV症狀的證據[51]，總的來說，這是一種耗時、昂貴和不切實際的方法。

CSSV的日益擴散，包括與經典的CSSV症狀表型相關的兩種分離株，以及最近發現的“嚴重下降”表型，使得開發有效的診斷檢測至關重要，從而能夠開展依賴於了解整個地區CSSV變體的身份和分布的流行病學研究。事實上，對ORF3中編碼病毒移動蛋白的可變區域的PCR擴增子進行測序，已經分別在科特迪瓦和加納解決了6個和9個CSSV群[49,50]。盡管這一明顯的、高度分化的編碼區域在物種水平上沒有被認為是分類學上的信息，但結果強調了在CSSV分離株中觀察到的比預期更大的分子變異性，並表明一些尚未描述的物種和/或菌株可能與整個西非可可種植中發生的明顯的CSSV樣症狀有關。

本研究的目的是設計可用於CSSV檢測的簡並或非簡並引物集，該引物集基於7個可用的CSSV基因組序列的序列比對。分子檢測的重點是從cssv類暴發地區的樹木中收集的可可樣本，這些暴發地區表現出科特迪瓦東部、中部和西部可可種植園中出現的一係列症狀表型。兩個先前發表的用於CSSV分子檢測的引物對[48,49]，一個用於“通用”badnavirv檢測[52]的引物對，以及五個圍繞選定的不同基因組編碼和非編碼區域(或“位點”)設計的引物對，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增來評估檢測CSSV的能力。擴增子的注釋表明，一些序列是非病毒的，通常是可可宿主起源，表明病毒-植物宿主序列同源，因此缺乏引物特異性。那些被注釋為類cssv的基因，並根據它們各自的基因組位點對距離和係統發育關係進行分析，揭示了廣泛的基因組間變異導致多個分子變異。

材料與方法

植物樣本和總DNA分離

從科特迪瓦中部、東部和西部三個主要可可種植區最近和/或長期爆發CSSV的91株有症狀和無症狀可可樹(圖1)以及2012年在國家農業研究中心(Côte d 'Ivoire)保存的實驗性接種的、有症狀的幼株可可樹中收集了樹葉和/或腫脹的枝條樣本。從生長在可可種植園附近的疑似地方性CSSV宿主中收集了另外33個樣本，代表15個物種。植物樣品在甘油中保存，4℃保存。用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[53]從100 mg葉或莖組織中分離總DNA。最終球團溶於100µL的低TE緩衝液(10 mM Tris-HCL (pH 7.5)，含0.1 mM EDTA (pH 8.0)，保存於-20℃。

圖1:本研究中所分析的植物樣本來自科特迪瓦的三個主要可可種植區。在地圖上，西部、中部和東部地區分別用藍色、綠色和紅色表示。

引物設計

基於7個可用的CSSV全基因組序列的多重序列比對，設計了5對引物:登錄號AJ534983、AJ608931、AJ609019、AJ609020、AJ781003、JN606110和L14546。使用在CLC序列查看器7.5 (http://www.clcbio.com/ products/ CLC - Sequence -viewer)中實現的MUSCLE[54]對序列進行排列。在ORF3內設計了4對引物，在非編碼基因間區設計了1對引物。PCR擴增子的坐標和大致大小見(表1和圖2)。之前發表的三個引物集用於比較，分別針對運動蛋白(ORF3的5 '端)[49]或ORF1[48]的片段，以及退化的“通用”Badna病毒Badna FP/RPprimers[52](表1和圖2)，在這裏分別稱為ORF3A、ORF1和Badna。為了評估DNA質量，選取了8個樣品進行PCR擴增，擴增出位於植物線粒體DNA內含子的2kbpplantnad4基因，外顯子1和2[55]之間。

圖2:的基因組序列圖可可腫芽病毒(CSSV)顯示近似引物坐標，基於Genbank CSSV隔離登錄號NC_001574。之前發表的引物Badna[52]、ORF1[48]和ORF3A[49]都是針對以純綠色表示的區域設計的。這裏設計的引物位置用純橙色表示。紅色箭頭表示核苷酸坐標1的位置，這是基於壞病毒基因組序列建立的慣例。

引物正向(F)，反向(R)	引物對5 ' - 3 '取向	底漆坐標	底漆Ta°C	預期規模(bp)
RT_F	AACGACAACACTGAAAAGGA	5325 - 5344	56	421
RT_R	GTGCCCAAAAATTCAATCTC	5727 - 5746	56
ORF3A_F	GTYRTACCRRAYAYYATGATGAC	1848 - 1870	55	532
ORF3A_R	GTTYCCRTTRSYRGAYTCYTCCCATAC	2355 - 2380	55
ORF1_F	AACCTTGAGTACCTTGACCT	498 - 517	56	375
ORF1_R	TCATTGACCAACCCACTGGTCAAG	849 - 872	56
P1_F	RGCAGCWGAARWGGCWAAGR	1244 - 1263	56	774
P1-R	TTDGGWGTRTTKGAYARYCK	1999 - 2018	56
P2_F	ACDGGHTGGGRMRRYGATRA	2461 - 2480	56	804
P2_R	TRTCYTTKATRTTGTKGCADGT	3244 - 3265	56
P3_F	ATNMHRGTCCARCAGCAGCC	4089 - 4108	56	1042
P3_R	TTDATGGGCTTRTCTTCWAT	5112 - 5131	56
P4_F	TGGCAACDGAACATGCCATCTC	6585 - 6606	56	1123
P4_R	TGGTTGTTGGTCACTTTACT	528 - 547	56
BadnaFP	ATGCCITTYGGIAARAAYGCICC	5513 - 5536	50	577
BadnaRP	CCAYTTRCAIACISCICCCCAICC	6066 - 6090	50

表1:引物對用於pcr擴增8可可腫芽病毒基因組區域。引物坐標基於CSSV參考序列，Genbank登錄號NC_001574.1

滾動圓擴增和聚合酶鏈反應

根據製造商說明，使用滾動圓擴增(RCA)和phi29 DNA聚合酶[56](Templiphi RCA試劑盒，GE Healthcare biosciences, NJ, USA)對純化現場樣本DNA中存在的圓形DNA進行富集[57,58]。

RCA產物作為PCR擴增模板。反應包含10.5µL無核酸酶水，12.5µL RedTAQ混合物(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)，每個引物0.2µM, 25µL中1µL RCA模板。循環參數為:94°C初始變性2min，然後94°C變性30s, 50-56°C退火30s, 72°C延伸1min /kbp, 72°C最終延伸10min。Badna引物的參數如前麵所述[52]。在pH為8.0的Tris-acetate EDTA緩衝液中，用瓊脂糖凝膠(0.8%)電泳驗證了預期的擴增子大小。用GelRed染色(10µL/mL) (Biotium, Aurora, CO, USA)觀察條帶。

擴增子的克隆和DNA測序

隻有預期大小的PCR擴增子被連接到pGEM T-Easy質粒載體上(Promega, Madison, WI, USA)，然後轉化為大腸杆菌DH5α細菌細胞，按廠家說明選用藍白色。菌群PCR在1x PCR緩衝液中進行，0.5 U鉑Taq聚合酶(Invitrogen)， 0.2 mM dNTP混合物(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)， M13正向引物和反向引物各0.2µM，無核酸酶水，最終體積為50µL。擴增子的大小通過瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。每個樣本有2 - 3個質粒，每個質粒都有預期尺寸的插入，在亞利桑那大學遺傳學核心測序設施(圖森，AZ)進行雙向桑格毛細管DNA測序。

DNA序列分析

DNA序列使用SeqMan Pro Software Lasergene version 11 (DNASTAR, Madison, WI)進行組裝，並使用BLAST2GO軟件[59]進行注釋。使用7.5版CLC序列查看器實現的MUSCLE[54]對CSSV序列進行校準。為了減少用於分析的序列數量，使用FaBox v1.41軟件[60]刪除那些具有100%身份的序列，即“單倍型”。將每個CSSV基因組位點的代表性單倍型序列存入NCBI GenBank數據庫，登錄號為KY473626 - KY473897。

使用序列劃分工具軟件(SDTv1.2)[61]計算每組擴增子、每對引物或基因組位點的nt恒等式。代表部分RT-RNase H位點的擴增子序列以≥80%的nt同一性為基礎進行分組

係統發生分析使用最大似然(ML)進行，在MEGA6[62]中實現，進行1000次自引導迭代，預測nt替代模型[62]具有最低的貝葉斯信息標準評分。

結果

CSSV檢測頻率

對每個引物組合的PCR擴增子序列的分析表明，在124個檢測樣本中，56個可可植物樣本和13個非可可植物樣本(共69個)中檢測到CSSV。然而，每個引物組產生預期大小的擴增子的能力是高度可變的，這取決於樣本。某些引物不能從其他引物對PCR證實為cssv陽性的樣品中產生cssv擴增子，這表明引物對之間的PCR擴增結果普遍不一致。用8對引物中的一個或多個對CSSV樣序列進行pcr擴增(表2)表明，124個樣本中69個CSSV檢測呈陽性，例如通過BLASTn分析驗證每個序列。使用8對引物從124個現場樣本中獲得的擴增物數量在24 ~ 52個之間，擴增率在19%和42%之間。在一組或多組引物確認為cssv陽性的69個樣本中，隻有35 - 75%的樣本可檢測到病毒。

	RT	ORF3A	ORF1	P1	P2	P3	P4	Badna
我	46/69 (67%)	41/69 (59%)	24/69 (35%)	29/69 42％	34/69 49%	41/69 59％	52/69 75％	35/69 51%
2	46/124 (37%)	41/124 (33%)	24/124 (19%)	29/124 (23%)	34/124 (27%)	41/124 (33%)	52/124 (42%)	35/124 (28%)
3	2/46	2/41	1/24	0/29	1/34	1/41	6/52	3/35

表2:聚合酶鏈式反應擴增一個片段的頻率可可腫芽病毒(CSSV)基因組使用8對引物。第I行和第II行顯示了每個引物對擴增的樣本數量和百分比，分別與確認為CSSV陽性的69個樣本和124個檢測總樣本的關係。麵板/第III行顯示的是非可可植物CSSV陽性樣本的數量，與使用每個引物對的CSSV陽性樣本的數量相關

在檢測的引物中，針對CSSV非編碼基因間區產生1123 bp產物的P4擴增頻率最高，為42%(52/124);而針對CSSV保守RT區(位於ORF3)的421個預期大小產物的PCR引物擴增頻率第二高，為37%(46/124)。

先前發表的ORF3A引物和P3引物(在此)以33%的相似頻率擴增了CSSV，即124個樣本中的41個。與P3相比，ORF3A引物是ORF3-運動蛋白基因的532片段，位於nt坐標1848 - 2380 (GenBank登錄號NC_001574.1)， P3被設計用於擴增與胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶區域對應的不同ORF3片段。當Badna引物被檢測時，隻有28%(35/124)的現場樣品為CSSV陽性。據報道，Badna引物是“通用的”或屬特異性的，設計時考慮了當時公共數據庫中可用的所有Badna病毒基因組序列。577 bp的Badna擴增子約占RTRNase H位點序列的一半(46.9%)。這個577 bp的片段可以用這些引物從發散的變異中擴增出來，因為它們和它們擴增的區域代表了RT-RNase H位點中最保守的區域，其自身的大小約為1230 bp。CSSV和其他不良病毒基因組的1,230 bp區域已被國際病毒分類委員會(ICTV)批準在屬中進行物種劃分Badnavirus[19]。盡管這裏擴增的片段隻占RT-RNase H結構域的47%，但它已被廣泛用於臨時的壞病毒種分類[50,63-66]。在本文中所研究的分離物沒有完整的RT-RNase H序列，而是使用該區域進行成對核苷酸身份分析，以臨時將分離物按物種分類，遵循了後麵的例子。

使用P2、P1和ORF1引物擴增CSSV，獲得的現場分離株分別為27%(34/124)、23%(29/124)和19%(24/124)，約為四分之一或更少。P1和P2引物靶向ORF3 5 '端，擴增物大小分別為774 bp和804 bp。P1引物擴增了nt座標1244 - 2018之間的區域，與之前發表的ORF3A引物[49]的靶區重疊。P2引物擴增了nt坐標2,461 - 3,265的片段，該片段位於NCBI保守結構域數據庫搜索中未預測的功能蛋白結構域[67]。ORF1引物定向擴增了ORF1的375 bp區域，該區域包含一個功能未知的壞病毒特異性區域DUF1319[67]，存在於所有7個可用基因組中。

為了確定PCR引物無法從其他CSSV症狀樣本中擴增出CSSV是否與DNA質量有關，選取了8個樣本進行PCR擴增nad4引物[55]，基於較差的CSSV擴增。8個樣品中有4個無論CSSV引物對如何都不能產生產物，4個樣品僅被一個或任意兩個CSSV引物對擴增。的結果nad4引物表明，所有8個樣本都產生了預期的2 kbp擴增子(數據未顯示)，證實了該DNA可以用於成功的植物基因PCR擴增，因此在足夠的病毒滴度下也應該產生CSSV擴增子。

BLASTn搜索

GenBank數據庫BLASTn對獲得的69個擴增子序列進行搜索，發現與一個或多個CSSV序列具有健壯的匹配，e值為0和≥87%的相似性分數。唯一的例外是用Badna、ORF3A和P3引物擴增的5個樣本的序列，其相似性評分為69-76%，e值為8e-61到1e- 102，覆蓋率隻有30-70%。

一個或多個引物對成功地擴增了cssv樣或其他劣病毒序列，甚至來自非可可植物物種。植物寄主種類和成功引物為:番木瓜(Badna P4, RT),木棉pentandra(除了P1)，Commelina erecta(Badna),薯蕷屬cayenensis(P4),Spigelia anthelmia(P4),Tapinanthus bangwensis(P4),Xanthosoma maffafa(ORF3A P4)。在這些地方特有的植物物種中，C. pentandra以前在粉蚧傳播研究中被報道為CSSV的宿主[15]。

除了ORF1外，所有8個PCR引物都至少產生了一些擴增子，當測序時，這些擴增子被注釋為可可基因組DNA。BLASTn結果表明，大部分的可可序列具有最高的相似度分數(s)t .可可序列。可可序列命中的例子包括DNA/RNA聚合酶超級家族，gag-prolike蛋白，受體激酶，逆轉錄轉座子，逆轉錄酶，轉運蛋白，或t .可可無特征的蛋白質。也許令人驚訝的是，在測試的引物中，Badna引物擴增了最多的可可序列，達到48%。此外，Badna引物擴增了一個577 bp的片段，注釋為薯蕷杆菌狀病毒(伏特分貝)或香蕉條紋烏幹達E病毒(BSUEV)。後一種擴增子與4種可可樣品相關聯，這些樣品也產生了含有8種引物中的6種的CSSV擴增子，這表明它們與CSSV共同感染了可可。此外，BLASTn搜索識別出dbv樣的壞病毒序列x maffafa(n = 2)和D. cayenensis (n = 1)t . bangwensis(n = 1)， DBV相似度搜索得分為73-82%，BSUEV相似度搜索得分為73%，覆蓋範圍為48-74%，e值為1e-53 ~ 6e-51。

成對核苷酸比較

對Badna引物確定的RT-RNase H部分片段進行分析，結果表明，在所有可擴增的分離株中，nt識別度為68-99%。然而，在缺少一個~1230 bp的完整RT-RNase H序列的情況下，該分析在分類學上沒有被認為是有用的，盡管最終將有可能確定結果是否與完整的位點預測在分類學上一致。

用8對引物擴增的CSSV序列的兩兩距離分析表明，66 - 99%的nt相同。P1、P4和ORF1引物分別從現場分離物中獲得63、98和53個cssv樣擴增子(表3)。通過成對距離分析發現，P1、P4和ORF1引物所劃分的位點彼此之間具有相同的差異，共有nt標識為74 - 99%，然而，由於P1、P4和ORF1引物的擴增頻率不同，擴增子不一定來自密切相關的分離物(表2)。

引物/區域	擴增子序列	成對核苷酸同一性
ORF3A	85	68 - 99%
RT	77	73 - 99%
P1	63	74 - 99%
P2	68	71 - 99%
P3	82	66 - 99%
P4	98	74 - 99%
ORF1	53	74 - 99%
Badna	87	68 - 99%

表3:的片段擴增子序列的成對核苷酸恒等式可可腫芽病毒(CSSV)基因組擴增使用8對引物

Badna和ORF3A引物分別產生87和85個病毒擴增子，具有相似的nt特征，擴增率為68-99%。Badna擴增子的成對核苷酸分析可分辨出4個CSSV群，物種截斷率≥80%。盡管Badna引物擴增了用於Badna病毒分類的RT-RNase H的部分區域，但分析劃分的四個(SDT)組代表了四種最有可能被描述為不同物種的CSSV變體。然而，有必要考慮每個人的整個“信息序列”來檢驗這個假設。其中，I組含有GenBank CSSV AJ609019、AJ608931、AJ609020、L14546和AJ534983位點，II組和III組分別含有AJ781003和JN606110位點，IV組含有此前未報道的CSSV樣變異，與I組、II組和III組分離株的差異分別為73-77%、70-75%和71- 75%。

基於配對恒等式，P2-和rt -擴增子具有71-99%和73-99%的nt恒等式，分別由68和77個序列表示。最大的差異發生在82個p3 -擴增子序列中，在66-99%的共享身份

係統發育分析

極大似然分析(>70% bootstrap;1000次迭代)的8組擴增子每組至少分解兩個分支，其中還包含一個或多個CSSV GenBank參考序列，每個分支都得到統計學支持(圖3)。從7個非可可樣本中確定的CSSV樣序列與來自可可樣本的序列分組，這些序列與來自多哥、加納或科特迪瓦的可可分離株的可用CSSV GenBank序列聚在一起。

圖3:的係統發育樹(ML)(1000次自舉迭代，>70%自舉)可可腫芽病毒(CSSV)序列由ORF1 (a)、RT (b)、Badna (c)、ORF3A (d)、P1 (e)、P2 (f)、P3 (g)、P4 (h) 8個引物擴增而成。在NCBI- GenBank數據庫中可用的CSSV序列以加粗號表示。從中部、東部和西部地區收集的現場分離物分別用綠色、紅色和藍色字母標記。統計支持的支係被指定為I、II或III。用星號(*)表示的序列是從特有的野生植物物種中確定的。的部分基因組片段柑橘黃花葉病毒(Genbank登錄號AF347695)與ORF3啟動區相對應，被納入外組(d)。組A - F (d)的命名采用自Kouakou等人的[49]，並用於與當前的分組係統進行比較。字母代碼CI (Cote d’ivoire)， GH (Ghana)，或TG (Togo)表示可可豆樣本來自哪個國家

由ORF1、RT、P1和P4引物擴增的序列重建的係統發生樹通過分解兩個組(稱為支序I和支序II)得到了相似的結果(圖3a、b、e、h)。相比之下，Badna、ORF3A、P2和P3擴增的係統發生樹分別分解了一個以前未知的cssv樣支序，稱為支序III(圖3c、d、f、g)。

每個係統發育樹中所代表的分離株之間的關係似乎並不僅僅基於現存的地理起源。在所有情況下，分支I包含來自科特迪瓦中部、東部和西部的分離株、來自加納的三個GenBank參考序列(Accessions AJ608931、AJ609019和AJ609020)和來自多哥的分離株(Accessions AJ534983、AJ781003和L14546)。ORF1樹觀察到一個例外，其中三個多哥參考基因組分組在進化支II(圖3a)。相比之下，對於大多數樹木來說，分支II主要由來自科特迪瓦東部的分離株、來自科特迪瓦GenBank Accession JN606110的分離株組成，偶爾也有來自多哥的GenBank參考株、Accession AJ781003或來自科特迪瓦西部的R290的分離株組成(圖3b, c)。總體而言，盡管所有樣本都是在科特迪瓦收集的，但在分支II中包含科特迪瓦GenBank參考株的擴增子序列少於33%。

使用Badna、ORF3A、P2和P3引物獲得的19個擴增子，分組在分支III中，與之前發表的CSSV序列具有<80%的nt同源性。這些病毒序列是從69個cssv陽性樣本中的5個樣本中獲得的，其中4個是可可豆，而5個是可可豆x maffafa(圖3 c, d, f, g)。Badna擴增子(Clade III;圖3c)、P2(圖3f)以及在GenBank中與部分或全基因組序列分組的P3引物對衍生序列(圖3g)。然而，4個orf3a擴增子與之前報道的科特迪瓦可可樣本[49]中的部分orf3擴增子聚集在分支III中。相反，分支I和II擴增子與ORF3A MP區關係最密切，稱為群a、B和D，分支III擴增子與E和F組關係密切，根據Kouakou等人的研究。[49];(圖3 d)。相比之下，除了R290MP1分離序列在係統發育樹中位於這兩組之間外，沒有一個分離株與A組或C組參考序列聚類。

此外，通過係統發育分析，來自可可和非可可宿主的幾個擴增子是三個支持良好的分支的基礎，表明它們與所有其他田間分離株有很大的差異，因此代表了以前未報道的cssv樣類型。最後，根據用於PCR擴增的引物，觀察到一些擴增子在分支I、II和III之間“移位”，並且涉及可可和非可可樣本。例如，基於RT、ORF3A、P2、P3和p4擴增子分組在分支I的R290，相對於RT- rnase H位點在分支II的R290，以及ORF1擴增子，是分支I和II的基礎。類似地，多哥AccessionAJ781003基因座在ORF1、RT、RT- rnase H、ORF3A和P1擴增子的擴增支I和II之間轉移，或相對於P2、P3和P4擴增子而言位於後兩個擴增支的基礎上。總的來說，這種擴增子移位強烈提示混合感染和/或可能是種間重組。

討論

在本研究中，從科特迪瓦可可和非可可產地采集的樣品中純化的DNA中評估的8對CSSV pcr擴增引物在擴增頻率方麵存在很大差異。使用新設計的引物對RT、P1、P2、P3和P4的擴增範圍為23 - 42%(表2)。與之前報道的三種引物相比，ORF3A、ORF1和Badna[13,49,52]對cssv樣序列的擴增成功率為19 - 33%，這使得新設計的引物在一定程度上更有效，但並不更加可靠。結果表明，CSSV的檢測依賴於特定引物對所針對的病毒區域。然而，沒有一個引物組從所有有症狀的樣本中擴增CSSV，盡管至少一個引物對擴增證實了陽性感染。盡管P4引物的擴增頻率最高，達到42%，但與P4相比，P4引物無法檢測到其他引物擴增的所有菌株。盡管8對引物中有6對是簡並引物，因此被期望以比非簡並引物更高的頻率檢測CSSV，但它們未能達到這一預期。這被認為是最有可能的，因為現有的CSSV現場分離株之間的真實基因組變異性的可用信息缺乏，這排除了引物設計中考慮全局變異性的可能性。此外，Badna引物的目的是用於全屬badnav病毒擴增[52]，然而，當它們被設計時，隻有一個CSSV基因組序列可考慮。考慮到目前CSSV分離株之間明顯的廣泛分歧，Badna引物設計的這一缺陷似乎解釋了CSSV檢出率低於預期的基礎，例如，124個樣本中隻有35個(28%)被檢測。同樣，每一對引物都給出了“假陰性”的結果，這是基於至少一對引物對69個樣本確認為CSSV陽性的觀察結果。 Given the apparently greater than expected variability among CSSV-like isolate, the design and use of multiple instead of a single putative universal primer pair will probably be essential to develop a reliable molecular diagnostic test for CSSV.

盡管有典型的CSSV樣症狀，124個現場樣本中有55個CSSV檢測陰性，無論引物對如何。引物設計基於分離基因組內高度保守的區域，因此被認為代表了物種範圍內分子檢測的信息區域。盡管采用了一種合乎邏輯的方法，但未能成功地從所有有症狀的植物中擴增病毒，這表明cssv類現場分離株的基因組變異性比預期的要大，並可能表明先前已知的基因型發生了分化，和/或新的基因組型出現了。陰性檢測的另一種解釋可能是樣品質量、低CSSV滴度，或在可可中觀察到的症狀或疑似野生宿主不是由CSSV引起的。在用PCR法對可可豆進行DNA質量檢測的8個樣品中nad 4結果顯示，所有8個樣本都產生了預期大小的擴增子，這表明缺乏擴增不太可能是由於DNA質量差。本文的結果證實了從多個獨立收集的現場分離物中通過PCR擴增CSSV的其他失敗[13,49]，並進一步支持了CSSV比預期更發散的假設，這一觀察結果已被報道為其他壞病毒，它們表現出固有的、種內變異性[68-70]。

使用這8對引物所實現的整體基因組序列覆蓋占一個平均大小的cssv樣基因組的5 - 75%。在這些序列中，變異率較高，為66 -99%。變異度最大的是P3擴增子對應的基因座，變異度為66 ~ 99%，其次是ORF3A和Badna擴增子序列，變異度分別為68 ~ 99%。P3和ORF3A區域分別編碼病毒AP和MP，而Badna區域編碼部分RT和RNase H蛋白，這些蛋白共同參與病毒複製和複製在足底運動。有趣的是，AP、MP和RT-RNase H區域的分化程度是一樣的，然而，與研究的分離株中的其他基因組區域相比，它們進化到什麼程度還不清楚。此外，還沒有評估AP和MP部分基因組位點是否與RT-RNase H標記具有類似的分類信息。

其他五個位點，RT, P1, P2, P4和ORF1，顯示出71 - 99%的核苷酸變異性，比AP, MP和RT- rnase H的發散性更小，因此預計可以很容易地檢測出基因組中更保守的區域。雖然ORF3A、P3和Badna位點在顯示CSSV基因組的發散程度方麵很有價值，但PCR擴增結果顯示，它們的擴增頻率不如發散程度較低的RT和P4位點高(如表2)，這在意料之中。這表明，與CSSV基因組的所有其他區域相比，AP、MP和RT-RNase H可能正在經曆更快速的進化變化。病毒基因組的區域不以相同的速度進化，這與許多其他植物病毒組一致。

對Badna引物劃分的RT-RNase H區域577 bp片段的兩兩距離分析顯示，基於nt識別閾值小於80%，存在4個CSSV變異。顯然，需要對整個RT-RNase H位點進行DNA測序，以確認物種狀態，並證實基於本文結果的建議，即CSSV是由多個不同實體組成的複合體。

提出的廣泛的可變性進一步解釋了大多數引物對無法從本研究分析的所有症狀植物中擴增CSSV。此外，病毒基因組中明顯廣泛出現的單核苷酸多態性預計將極大地限製甚至排除針對該群體的“通用”引物設計，盡管變種特異性引物設計可能是可控的。此外，基於現有序列數據的額外設計嚐試預計將無法擴增所有分離株，因為有關基因組變異性的信息非常有限。這種廣泛的分歧表明，變種特異性引物將提供最有可能成功的策略，然而，需要更多的CSSV基因組數據來驗證這一假設。

係統發育分析的結果是，一棵樹有兩個或三個主要的分支，其中包含使用8對引物擴增子獲得的序列。ORF1、RT、P1和P4引物擴增的序列被分為兩個主要的分支I和II(圖3a、b、e和h)。相比之下，ORF3A、P2、P3和Badna引物擴增的序列顯示出額外的第三個分支III，分別分組在分支I和II的基礎上(圖3 c、d、f、g)。ORF3A和P3區域似乎比其他六個區域更分散，因為它們更好地分解了樹的子結構，作為基因組變異性的指標。他們都在科特迪瓦和加納的樣本中分離出6個或更多的CSSV亞群[49,50](圖3d, 3g)。其中，ORF3A序列子支的解析效果最好，這很可能是因為在分析中包含了更多先前發表的關於該區域[49]的部分序列，而P3區域對應的部分片段除了全長基因組外沒有可用的。基於同樣的原因，與MP和P3區域相比，badnavirus-分類學信息RT-RNase區域[19]顯示出較少的基因組變性，因為在係統發育分析中隻考慮了少數序列。核苷酸對分析也觀察到這種高變異性，這可能歸因於高突變率或進化。雖然有些位點比P3和ORF3A有更多的序列用於係統發育分析，例如RT和P4區域，但它們顯示出較少的基因組變異，因為它們分解的亞群較少。綜上所述，結果表明，一些CSSV位點更能分辨遺傳變異，而一些則更能檢測更多的CSSV分離株。

基於ML方法的係統發育分析顯示，本文分析的序列沒有係統地理分布的證據。本研究中來自科特迪瓦的8個係統發育樹中至少有三分之二的序列與第1支支中的加納GenBank參考序列最密切相關(圖3)。第2支和第3支包含來自多哥和/或科特迪瓦的GenBank參考序列，或者沒有。這種分布表明，這裏研究的CSSV分離株可能不是科特迪瓦特有的，每一組分離株的代表可能存在於西非所有可可種植國家。此外，在科特迪瓦，根據采樣地點或植物宿主物種，沒有證據表明CSSV分離株之間有密切關係，在東部、西部或中部地區，來自可可和非可可宿主的分離株平均分布在枝係中。由於西非可可種植區的可可種植者之間交換了種質資源，以及為了尋找不受芽腫病影響的新地點而轉移種植材料，預計該區域將存在若幹分離株或變異的CSSV。

通過對距離分析，Badna、ORF3A和P3擴增子與其他分離株的同源性最小。在GenBank的CSSV序列中，未發現近親屬(≥80%的同源性)，表明其為高度分化的分離株。

CSSV序列不僅在可可宿主中檢測到，而且在7種野生宿主中，除P1和ORF1外，其他引物均擴增出CSSV序列;番木瓜、番木瓜、直立樹、辣椒、花椒、bangwensis,x maffafa．在這七人中，c . pentandra以前被描述為替代主機[15]。來自7種野生寄主植物和來自科特迪瓦的可可樣本的CSSV序列與多哥、科特迪瓦和加納分離株屬於同一個亞分支(圖3b、c、d、g和h)，表明它們之間有密切的進化關係。這支持了之前的研究結果，即野生宿主至少是CSSV的部分來源。眾所周知，在19世紀可可傳入西非之前，野生宿主中就存在CSSV[14,15]。結果表明，在未對CSSV易感性進行評估的可可種植園中使用覆蓋作物可能會藏匿CSSV，並導致無意培育替代宿主，病毒可由此傳播到它們本應保護的可可樹中。此外，在原生森林附近建立新田可能會周期性地導致宿主被CSSV或其他尚未特征的地方性壞病毒物種轉移到新種植的可可樹上。

結論

這裏設計的用於CSSV檢測的5對引物，共同擴增了從科特迪瓦收集的可可和非可可田樣本中19-42%的壞病毒擴增子。基於共8個引物(包括陽性對照引物)擴增的cssv類擴增子的集體序列覆蓋(AP, MP, RT- rnase H, RT, P1, P2, P4和ORF1)，意外地發現了廣泛的變異，在66 - 99%的nt標識。考慮到目前的ICTV物種截斷值≥80%，對於RT-RNase區域，以及該位點577 bp片段的擴增(~47%)，不可能確定這種基因組變異的程度(代表總基因組的5 -75%)是否是物種分化的有效指標，然而，結果提供了重要的新線索，支持這種可能性，並暗示CSSV是至少4個或更多變體的複合體。這一臨時情況與觀察到的惡性病毒之間類似的高度分化一致香蕉條紋病毒基因組[68]，以及關於家族中某些新興的begomovirus種群Geminiviridae[71]。考慮到這些結果，設計一個PCR引物對來檢測所有現存的cssv樣病毒或其他不良的病毒變體是不太可能的。這就強調了開發新的分子或其他診斷工具的緊迫性，以便能夠可靠地檢測和識別造成西非可可種植園空前損失的可可感染壞病毒。全麵的分子診斷測試對於確定用於新產區的可可無性係的無病毒狀態和現有可可種植區的樹木替換計劃，以及為正在進行的鑒定抗cssv種質的育種工作提供支持，都是非常寶貴的。此外，在流行病學研究中應用下一代基因組病理學方法將是非常寶貴的，有助於協調疑似新的和正在出現的壞病毒可可物種中出現的廣泛基因組變異，與當前流行病傳播背景下的病毒進化模式，以及全麵的可可遺傳/基因組數據集，以實現長期的疾病管理解決方案，使西非的可可生產可持續發展。

利益衝突聲明書

作者聲明沒有利益衝突。

資金

該項目由美國農業部- ars通過一項具體合作協議提供資金，項目# 6038-21000-023-07，“開發和優化用於定性和定量檢測可可腫芽病毒的分子診斷方法”，並由MARS公司提供;信托協議#58-6631-6-123:可可的遺傳改良，由美國農業部-外國農業服務機構、世界可可基金會、Borlaug獎學金項目授予第二和第三作者。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Chingandu N, Kouakou K, Aka R, Gutierrez OA, Brown JK (2017) P多個位點的意外基因組變異表明可可腫芽病毒包括多個發散的分子變異。J新興病毒病3(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.128

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出版的曆史:

收到日期:2016年12月08日

接受日期:2017年3月09日

發表日期:3月15日2017