摘要

NS2B/NS3蛋白酶複合體在宿主細胞內登革病毒(DENV)的複製中起著重要作用。NS3蛋白酶是一種類似胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，NS2B作為輔助因子。NS3蛋白酶的活性位點在n端區域包含一個由His51、Asp75和Ser135組成的催化三聯體，它參與了多蛋白切割成單個功能單元的過程。因此，在開發更有效的抑製DENV傳播的抑製劑時，靶向NS3蛋白酶更加重要。本研究參照實驗證明的黃酮和查爾酮的結合方式，研究了吖啶酮和酮類環酮的結合方式。對接結果表明，唑酮和酮更傾向於結合新位點(隧道樣口袋)，而黃酮類抑製劑和豆蔻素更傾向於與催化三聯體結合活性位點。此外，研究結果還推測了酮/吖啶酮與黃酮衍生物的協同作用對控製DENV感染的作用。分子動力學模擬和結合自由能計算證實了吖啶酮和黃酮分別在隧道和催化位點結合的穩定性。

關鍵字

登革病毒;吖啶酮;氧雜蒽酮;黃酮;NS2B / NS3蛋白酶;對接;黃病毒

簡介

登革病毒(DENV)屬於黃病毒屬和Flaviviridea由四種獨特血清型組成的家族即. .從DEN-1到DEN-4。它會導致登革出血熱，這是大多數熱帶國家的一種傳染病。發病迅速、關節和肌肉疼痛、頭痛和出現皮疹是感染後的直接症狀[1,2]。DENV的傳播是通過埃及伊蚊在熱帶和亞熱帶地區，一種通常傳播登革熱、基孔肯雅熱、黃熱病等病毒的蚊子。登革病毒2型(Den2)是四種血清型中常見的一種，其基因組是由10,732個核苷酸組成的單鏈陽性RNA。它編碼長度為3,391個氨基酸的多聚蛋白質前體[3,4]。它以C-prM-E- ns1 - ns2ans2b - ns3 - ns4a - ns4b - ns5的形式組織，包括3個結構蛋白(C, prM和E)和7個非結構蛋白(NS)[5,6]。關於登革NS2B/NS3蛋白酶的功能、結構性質、藥物設計策略以及由此產生的抑製劑的討論見文獻[7-9]。此外，與NS2B 47殘基片段複合的NS3蛋白酶結構域的晶體結構揭示了參與底物識別的關鍵殘基以及NS3[10]激活的機製。對於多蛋白的水解切割，NS3蛋白酶需要NS2B[11]上約40個殘基親水結構域。此外，形成催化三聯體的活性位點殘基His51、Asp75和Ser135(圖1)負責蛋白水解活性，這是絲氨酸蛋白酶家族的專屬作用機製[12,13]。Lys74、Leu149和Asn152位於活性位點附近，通過疏水觸點與抑製劑相互作用。抑製劑結合誘導NS2B/NS3pro活性位點構象變化，打破Asp75和Lys74之間的h鍵相互作用。 The NS2B/NS3 protease complex is taken as the target for the present study for development of anti-dengue compounds [14]. Due to endemic, rate of development of inhibitors of NS2B/NS3 protease has increased. Discussion on methods of development [15,16] of some of these inhibitors is more relevant to the present work. It includes the peptido-mimetics synthesized based on the substrate peptide [17-19] or cyclo-peptides [20]. Structure-based virtual screening method was efficiently used for finding novel inhibitors [21-23]. Especially, the anthrecene based compounds ARDP0006 and ARDP0009 are structurally similar to acridone and xanthone and show considerable inhibitory activity in cell based replication assay at micro molar concentrations [22]. Similarly, library of natural products [24-26] extracted mainly fromBoesenbergia圓形大廳(l)Mansf。是生薑家族的一種常見香料(薑科)是作為NS2B/NS3蛋白酶抑製劑的黃酮類化合物的來源。通過體外高通量篩選(HTS)方法篩選小分子庫[27]以鑒定NS2B/NS3特異性抑製劑，化合物BP2190被報道為一種新型選擇性抑製劑[27]。虛擬篩選和核心跳變技術共同候選了ACD化學庫[28]中的一些非肽抑製劑。然而，隻有少量的抑製劑，包括肽或小分子抑製劑具有中等活性的報道。用click化學方法製備的Benz[d]異噻唑-3(2H)- 1衍生物被證明是抗Den2和西尼羅病毒(WNV)[29]的抗病毒化合物。通過蛋白酶抑製劑試驗和結構活性關係(SAR)研究[22]證實蒽衍生物在微量摩爾濃度下具有抑製活性。RC-1肽通過IC抑製NS2B-NS3pro₅₀28°C時為46.1 μ M, 37°C時為21.4 μ M, 40°C時為14.1 μ M[30]。Protegrin-1 (PG-1)是一種18 a.a的肽，通過基於MK2細胞係的檢測已報道為Den2蛋白酶抑製劑。它還能控製病毒在宿主體內的複製，在12.5 μ M及以上[31]濃度時顯示出毒性。使用同源建模、虛擬篩選和對接技術也報道了基於非底物的NS3蛋白酶抑製劑。然而，對於Den2的絡合物形式，即NS2B/NS3pro絡合物及其抑製劑，還沒有可用的晶體結構。

圖1:Den2 NS2B/NS3蛋白酶及其催化三聯體的表麵圖

Boesenbergia圓形大廳L中含有一組化合物，包括黃酮和它們對應的查爾酮，被報道為良好的Den2蛋白酶[24]的非競爭性抑製劑。通過剛性和自動柔性對接方法，發現黃酮(pinostrobin, pinostrobin and alpinetin)及其查爾酮(pinostrobin chalcone, pinostrobin chalcone and cardamonin)與活性位點結合，預測的結合親和力與實驗的結合親和力[32]具有良好的相關性。支持某些黃酮及其查爾酮抗病毒活性的數據的可用性對分析結構相似的化合物如吖啶酮和酮類化合物非常有幫助。此外，吖啶酮已被證明是抗病毒化合物，因為它們抑製單純皰疹病毒(HSV)[33]的複製和RNA合成胡寧病毒[34]。最重要的是，n -取代吖啶酮對登革熱等出血熱病毒的活性也有報道。最近發表的一項研究報告了吖啶酮及其衍生物在抑製登革病毒複製方麵的潛在作用。對所有四種血清型均有抑製作用，對DENV-2的抑製作用增強。研究了一種叫做肌苷單磷酸脫氫酶的宿主酶的抑製模式。這種酶被認為通過限製GTP合成[36]對病毒複製有影響。目前研究了吖啶酮通過病毒蛋白酶抑製和通過雙模式結合提高其抗病毒活性的潛力。另一方麵，山酮是一類非常特殊的生物活性化合物。已知它的許多衍生物具有很強的抗病毒活性[37]和20種分離出來的不同的山酮獐牙菜屬mussotii可以抑製乙型肝炎病毒(HBV)感染細胞[38]中的病毒複製。此外，山竹(藤黃屬植物mangostana水果是多種生物活性酮的天然來源之一，具有良好的抗病毒和抗癌活性，且無不良副作用。一般來說，吖啶酮和酮類都是常見的，因為它們對不同類型的單純皰疹病毒(HSV)[39]具有抑製活性。因此，本研究旨在參考已報道的黃酮類抑製劑，探討吖啶酮和酮類衍生物抑製NS2B/ NS3pro複合物的可能性。

材料和方法

NS2B/NS3蛋白酶的製備

結合NS2B輔助因子片段的NS3蛋白酶的晶體結構取自蛋白質數據庫(PDB ID: 2FOM)[10]。在該結構中，一個環區域缺失，這是使用Schrödinger中提供的PRIME進行建模的。這種蛋白質是通過分配適當的鍵序和形式的原子電荷來製備的。確定了適當的電離和互變異構形式，優化了氫鍵網絡。采用“蛋白質製備向導”的常規方法對Asn的羥基和硫醇基團、酰胺基團和His的咪唑基團的構象進行了采樣。所有氨基酸(尤其是Asp、Ser、Glu、Arg和His)都發生了質子化。在開始對接計算之前，對NS2B/NS3蛋白酶的整個結構進行優化和最小化，並切斷0.3Å的均方根偏差(RMSD)，以去除空間位序衝突，計算(最接近的)局部最小值對應的構象。

配體的製備

黃酮(pinostrobin, pinostrobin and alpine)和查爾酮(chalcone, cardamonin)被作為標準(已知的Den2 NS2B/ NS3蛋白酶抑製劑)，其結構如圖2所示。利用Chemsketch軟件繪製並優化吖啶酮和蒽酮的衍生物(表1)。所有這些化合物都使用薛定諤套件提供的“Ligprep”模塊進行對接。默認參數設置為在pH值為7±2時產生最多32個異構體和立體異構體。最陡峭的下降跟隨共軛梯度方法被用於能量最小化，這是在結構收斂的衝擊模塊下可用的，幾何和能量。

圖2:黃酮衍生物的三維結構比對

分子對接

采用誘導配合對接(IFD)方法[40]對已報道的化合物進行了活性實驗對接。它為每個配體產生多個結合姿勢，並主要根據對接分數和計算的滑翔能量進行排名。在這種方法中，受體和配體都可以移動。因此，結合位點可以采用適合配體和的構象反之亦然．根據評分、能量和相互作用選擇每個標準配體的最佳姿勢。為了找到酮、唑酮和黃酮的位點偏好，使用Glide[41]包進行盲對接。在這個過程中，網格被設置到整個蛋白質上，以使配體找到能量上有利的結合袋。由於吖啶酮和蒽酮衍生物結合在催化位點附近(又名(隧道位點)，采用IFD法評估了當黃酮結合在催化位點時，吖啶酮和酮對Den2蛋白酶的協同抑製作用。使用Ligplot[42]和Chimera[43]軟件包分析蛋白質和配體之間的相互作用。上述計算均采用優化液體模擬電位(OPLS-2005)[44]力場進行。通過MD模擬驗證了吖啶酮和酮結合在隧道位點的穩定性，而黃酮結合在催化位點。

MD模擬

模擬NS2B/NS3蛋白酶與每個最佳評分抑製劑的複合物為10 ns[45]。使用AMBER10套件[46]自帶的Leap模塊為每個蛋白質配體複合體準備了模擬係統。所建立的程序適用於賦予氨基酸的質子化態。對於係統的電荷中和，使用了Na+或cl。利用前室程序和GAFF(一般琥珀力場)[47]推導了吖啶酮、蒽酮和黃酮衍生物的力場參數。采用AM1-BCC電荷法分配原子點電荷[48]。TIP3P[49]盒子(三角化水分子)與10 Å^3.盒子被用於溶劑化。采用最陡下降法(SD)和共軛梯度法(CG)對兩階段係統進行了優化。在第一相中，溶質原子受到力常數(kcal/mol-Å)的諧波勢的約束²)，溶劑原子被放鬆。然後，采用CG法在不抑製溶質原子的情況下對整個體係進行弛豫。為了使係統在仿真過程中服從NPT集成，平衡過程分兩階段進行。首先，利用Berendsen溫度耦合[50]在300k附近平衡溫度，其中設置2 ps時間常數為溫度耦合，並利用Maxwell分布生成隨機種子，該種子用於給定溫度下的初始速度分配。

在定體積條件下實現了周期邊界條件(PBC)。在第二階段，設置各向同性位置縮放時間常數(2 ps)用於壓力耦合，以平衡1atm左右的壓力。速度信息取自前一平衡階段結束時的數據。平衡完成後，以勢能、動能和總能量為指標對係統進行解釋，分析完成的平衡步驟。最後，在不限製溶質原子的情況下，在2 fs的積分時間內進行10 ns模擬。所有步驟均采用ff03[51,52]全原子力場。采用粒子網格Ewald (PME)方法[53]處理長距離靜電相互作用，SHAKE算法[54]抑製所有涉及氫原子的鍵(控製最快振動)，2 fs時間步長和10 Å非鍵相互作用截止，進行了平衡和動力學模擬。

束縛自由能的計算

計算了NS2B/NS3蛋白酶與吖啶酮或蒽酮結合在隧道位點形成配合物的結合自由能(ΔG°)。采用MM-GB/SA[55-57]方法和MMPBSA.py[58]模塊對10 ns軌跡的最後2 ns(頻率5 ps)進行計算。MM- gb /SA法采用ff03力場計算MM能量(等式2)。用GB法[59]計算極性溶劑化能，用molsurf法[60]計算溶劑可及表麵積(SASA)。MMPBSA.py程序使用nMode模塊來估計熵貢獻(-TΔS)。總體計算如下式所示。

\[\δG ^ {o} _{結合,求解}= \δG ^ {o} _{綁定,-真空}+ \δG ^ {o} _{溶劑、複雜}-(\δG ^ {o} _{溶劑,配體}+ \三角洲{o G ^} _{溶劑,受體 })\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,( 1) \]

\[\三角洲{G_{綁定}}= \δH - T \ \大約\δδS {E_ {MM}} + \三角洲{G_{索爾}}- T \δS \,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,( 2) \]

\[\三角洲{E_ {MM}} = \三角洲{E_ {{\ mathop {\ rm int}} ernal}} + \三角洲{E_{靜電}}+δ就是secu * tanu減去vdw {E_ {\ }}\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,( 3) \]

\[\三角洲{G_{索爾}}= \三角洲{G_ {PB / GB}} + \δ{G_ {SA }}\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,\,( 4) \]

在那裏,∆E_毫米為氣相分子力學能;−T∆年代構象熵;∆G_索爾為溶劑化自由能;∆E_內部包括鍵能、角能和二麵體能。

結果與討論

分子對接

IFD的結果是，每個配體產生20個結合位，並獲得每個位姿的得分和能量。所有的標準化合物(小豆蔻素、alpentin、pinostatin和pinostrobin)的評分均為-6±1 kcal/ mol(表1)。這些化合物在催化位點結合良好，通過氫鍵和疏水相互作用與催化三聯體的所有三個殘基和其他鄰近殘基相互作用。分數和結合能在相當的範圍內，也在文獻[32]中已經報道的值的範圍內。

化合物	綁定網站	分數	能量(千卡每摩爾)
Cardamonin	催化三	-6.19	-33.87
Alpenetin	催化三	-5.34	-32.91
Pinostrobin	催化三	-5.70	-29.42
鬆屬素	催化三	-6.57	-35.90
吖啶酮	在催化三位一體附近	-7.83	-53.12
氧雜蒽酮	在催化三位一體附近	-7.92	-50.19

表1:與NS2B/NS3蛋白酶對接的各化合物的得分和能量

此外，在沒有指定結合位點的情況下，對吖啶酮和酮的核結構進行Glide對接(盲對接)。表1和圖3詳細描述了這些化合物在催化三聯體(隧道位點)附近結合的分數、能量和相互作用。吡咯酮和酮都傾向於-7.8千卡/摩爾的隧道位置，這比標準化合物在催化三合鍵上的結合要好。在隧道結合的重要特征包括與Lys73和Lys74的相互作用。這兩個賴氨酸殘基的作用是非常重要的結合配體在催化三元。吖啶酮和蒽酮通過與Lys73的非鍵合相互作用結合在隧道上，可能會引起這兩個位點交界處的構象變化。隧道位點主要由許多疏水氨基酸(主要是Lys73、Lys74和Lue76)和少量極性氨基酸(主要是Thr120和Asn167)組成。如圖3(右麵板)的表麵圖所示，即使存在唑酮或酮，疏水囊也具有更多的空隙體積。為了提高結合效率，用不同的疏水性官能團取代吖啶酮和蒽酮的不同衍生物進行了模擬。甲基、異丙基和叔丁基在X1和X6位置被取代，這有望提高疏水性以及與隧道位置的形狀互補。 The details of substitutions made in both the core structures are described in table 2. The 16 derivatives for xanthone and acridone, separately, are subjected for IFD to find the favourable substitutions with good score and energy. IFD results confirm that the isopropyl group substituted at both X1 and X6 positions of both acridone and xanthone improved the binding efficiency (binding energies: -50.1 and -53.1 kcal/mole, respectively) with the interaction pattern similar to their respective core structures. Xanthone derivative has favourable score of -8 kcal/mol whereas it is -7.8 for the acridone derivative (Figure 4).

圖3:酮和吖啶酮在隧道部位的結合。表麵圖描繪了催化三元殘基(球和棒，左圖)和隧道位置，以及配體的隧道位置全景(右圖)。同樣，用漫畫來描述，以了解兩個位點的結合殘基

圖4:吖啶酮(a)和蒽酮(b)在Den2蛋白酶隧道位點的結合方式

Sl。不。	X1	X2	X3	X4	X5	X6
1.	H	H	H	H	H	H
2.	我	H	H	H	H	我
3.	知識產權	H	H	H	H	知識產權
4.	tBu	H	H	H	H	tBu
5.	H	H	H	我	H	H
6.	我	H	H	我	H	我
7.	知識產權	H	H	我	H	知識產權
8.	tBu	H	H	我	H	tBu
9.	H	H	H	我	H	H
10.	我	H	H	我	H	我
11.	知識產權	H	H	我	H	知識產權
12.	tBu	H	H	我	H	tBu
13.	H	H	H	H	H	H
14.	我	H	H	H	H	我
15.	知識產權	H	H	H	H	知識產權
16.	tBu	H	H	H	H	tBu

表2:用取代吖啶酮和蒽酮核心結構不同位置上的選擇性官能團得到的衍生物
官能團:h -氫原子;我-甲基;ip -異丙基和叔丁基。

進一步，對接，以評估每個黃酮衍生物和豆蔻堿在催化三聯體上的結合效率，在隧道位置存在的唑酮和酮。酮衍生物與隧道位點結合的氫鍵相互作用次數比吖啶酮衍生物多。蒽酮衍生物與出現在隧道和催化位點交界處的疏水氨基酸Lys73相互作用。此外，這些衍生物與存在於隧道部位的Val155和Ala166相互作用。除了氫鍵相互作用，與其他氨基酸的疏水接觸增加了複合物的穩定性。另一方麵，吖啶酮衍生物與Leu149和Asn152通過氫鍵和疏水相互作用相互作用

合作

以上結果證實了黃酮和小豆蔻堿更傾向於結合在催化-三聯體區域，而酮和吖啶酮衍生物則更傾向於結合在隧道位點。因此，在隧道位置分別有酮和吖啶酮存在的情況下，對催化三合體上的所有標準化合物進行了對接。這些結果將有助於識別這兩組化合物在各自位點結合的不同組合，從而證明配體的協同作用。第一步，將酮停靠在隧道部位，在活性部位進行標準化合物篩選。結果表明，黃酮結合良好，最佳滑動能量約為-69.9千卡/摩爾。類似地，將吖啶酮衍生物固定在隧道區域，並在吖啶酮衍生物具有良好結合能(-53.1 kcal/mol)的三聯點進行篩選(圖5a)。在隧道位點存在唑咯酮的情況下，黃酮結合活性位點(催化三聯體)的結合能為-40.7 kcal/mol(圖5b)。這與它在有酮(取代吖啶酮)存在時的結合相比是非常不利的(圖5c)。基於MD模擬軌跡計算的結合自由能(包括熵項)很好地證實了上述對接結果(圖6)。與酮(-6 kcal/mol)相比，吖啶酮的結合非常強烈(-24 kcal/mol)。第二吖啶酮(在催化三元鍵上)結合不佳(< -3千卡/摩爾)，而黃酮結合良好(-4千卡/摩爾)。 Similarly, flavone shows more favourable binding (-7.5 kcal/mol) in the presence of xanthone at the tunnel site. During synergistic inhibition with flavone, acridone binds tunnel site with more affinity (-12.5 kcal/mol) compared to the xanthone (<-3 kcal/mol). Together, acridone and flavone show favourable binding with their preferred sites suggesting that these two compounds will have synergistic inhibitory activity against the proteolytic activity of NS2B/NS3pro.

圖5:黃酮/吖啶酮在催化位點結合，吖啶酮與酮在隧道位點協同結合

圖6:在催化位點黃酮存在的情況下，計算吖啶酮和酮在隧道位點結合的結合自由能(ΔG°=ΔH-TΔS)。在acr#(acr-acr)中，吖啶酮結合這兩個位點的可能性，其中，acr1表示吖啶酮結合在催化位點，acr2表示吖啶酮結合在隧道位點

結論

靈活對接研究證實，基於黃酮和查爾酮的DENV NS2B/NS3pro抑製劑更傾向於將活性位點與催化三聯體結合。已知以唑酮和酮為基礎的化合物具有抗病毒活性，它們傾向於結合在催化三聯體附近的新位點，稱為隧道位點。這為基於NS2B/NS3蛋白酶結構設計DENV抑製劑提供了新的思路。同時，這也為提出這兩種位點特異性抑製劑的抑製活性可能存在協同作用提供了基礎。靈活對接、MD模擬和結合自由能計算證實吖啶酮和黃酮類化合物將協同抑製DENV NS2B/NS3蛋白酶複合體，這一新發現為進一步擴展生化和結構研究提供了基礎。目前還沒有關於雙抑製位點結合的研究報道。作為目前工作的繼續，NS2B/NS3蛋白酶與來自自然資源的抗病毒化合物的結合研究正在進行中。

確認

作者感謝印度政府生物技術部和大學資助委員會提供的商業軟件包和高性能計算設施。DV感謝DBT資助與萊貝克大學的國際合作項目。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Kutumbarao NHV, Ramakrishnan C, Balasubramanian K, Velmurugan D(2016)吖啶酮、酮和黃酮衍生物對登革2型病毒NS2B/NS3pro抑製活性的計算評估。J新興病毒2(4):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.124

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出版的曆史:

收到日期:2016年5月23日

接受日期:2016年11月21日

發表日期:2016年11月25日