摘要

背景:C組輪狀病毒(GCRV)已在世界各地腸胃炎(GE)的散發病例和暴發中被檢測到。然而，由於與A組輪狀病毒(GARV)相比，GCRV感染的流行病學仍然知之甚少，因為檢測方法尚不成熟。

摘要目的:我們評估了分子和酶聯免疫分析對散發GCRV感染的診斷，並調查了臨床症狀，包括腸外表現。

研究設計:選取30例住院的急性GE患兒進行GARV和GCRV的診斷，並比較兩組患兒的臨床症狀。

結果:在檢測的30份直腸拭子標本中，24份輪狀病毒陽性;酶免疫、RT-PCR和電鏡檢測GCRV陽性6例，GARV陽性16例。雖然GCRV和GARV患者GE的Vesikari嚴重程度評分無顯著差異，但GCRV患者未見癲癇發作和肝炎等腸外並發症。

結論:GCRV散發感染與GARV流行在同一地區同時發生。為了更準確地診斷GCRV感染，需要結合不同的檢測方法。

關鍵字

輪狀病毒;胃腸炎;轉氨酶水平;聚丙烯酰胺凝膠電泳

縮寫

ELISA:酶聯免疫吸附法;GARV:甲類輪狀病毒;GCRV: C組輪狀病毒;聚合酶鏈反應。

簡介

輪狀病毒(RV)是全世界幼兒腸胃炎(GE)的主要原因。根據它們的dsRNA電泳類型和抗原性[1]，rv被細分為7組(A到H)。在人類中，A組輪狀病毒(GARV)於1973年首次被發現。GARVs與高發病率和死亡率有關，每年估計有215000人死亡，導致嬰兒因發燒而嚴重脫水，並經常腹瀉和嘔吐。此外，眾所周知，GARV GE有時伴有高熱、轉氨酶水平升高[4,5]、癲癇[6,7]和腦病[8,9]，這些可能是由全身病毒感染引起的。在日本，引起急性GE的最常見病毒是諾瓦克病毒、GARV和樹瘤病毒[10]。C組輪狀病毒(GCRV)於1980年首次在豬中發現[11]。人類GCRV感染首次於1983年在巴西的裏約熱內盧被發現。隨後，在世界各地的GE散發病例和暴發病例中都發現了GCRV。GCRV的檢出率在許多國家的報道為0.23% - 6.9%[13-17]。在日本，GCRV首次報告於1986年[18]，散發病例和暴發的陽性率在2.7-13.3%[19]之間。商用ELISA試劑盒檢測GARV抗原快速、簡便;然而，目前還沒有檢測GCRV的ELISA試劑盒。許多分析和分子技術，如電子顯微鏡，ELISA，逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和反向被動血凝(RPHA)，已經能夠在一些研究中檢測GCRV。GCRV的檢測沒有金標準，由於缺乏敏感和特異性的診斷方法，GCRV的流行病學和疾病負擔還沒有完全建立起來。 In addition, little is known about GCRV clinical symptoms in humans; GCRV is generally believed to be associated with milder GE or asymptomatic infection in children and adults [20]. Therefore, it is very important to accumulate samples and information, even from sporadic cases. In the present study, we assessed molecular and enzymelinked immune assays for the diagnosis of sporadic GCRV infection in a small group of non-immuno compromised children in Japan. We further compared clinical symptoms of GE between GARV and GCRV infection in these children.

材料和方法

患者特征和樣本收集

本研究納入了30名10歲以下兒童(17男13女)，2009年3月至6月期間在Konan Kosei醫院兒科住院的急性GE患兒。入院時，每名患者均采集直腸拭子樣本。此外，在入院(第1天)和出院(第3天至第8天)時(數天後)均采集了一對用於RV抗原檢測的血清樣本。樣品在-70°C下儲存，然後用幹冰運輸到美國亞特蘭大的疾病控製和預防中心(CDC)。研究對象的臨床表現是通過回顧性病曆確定的。我們使用20分製的Vesikari評分係統[21]來評估疾病的嚴重程度。獲得所有家長的書麵知情同意後，兒童按照藤田衛生大學機構審查委員會批準的研究方案進行登記(08-177)。根據保密協議，疾病控製與預防中心測試了帶有唯一標識符的編碼樣本，以保證匿名，該協議明確禁止發布參與者的個人身份信息。

此外，對所有患者的直腸拭子樣本進行培養以檢測腸道細菌。

elisa

用商用ELISA試劑盒(Rotaclone和Adenoclone;都來自Meridian生物科學公司，辛辛那提，俄亥俄州)。使用針對豬GCRV Cowden株[13]特異性試劑的內部免疫分析法檢測所有糞便標本的GCRV抗原。簡單地說，96孔板(Nalgene Nunc International)塗有豬抗gcrv血清(U340;稀釋1:2000)或正常豬血清(Z1329;稀釋1:2000)在塗層緩衝液(35毫米NaHCO)中_3.， 15 mM Na₂有限公司_3., pH值9.6)。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)-0.05%衝洗後，用印跡培養Tween (PBST)板。培養皿與稀釋的糞便樣本(稀釋倍數為1:10)或GCRV病毒樣顆粒(VLPs，陽性對照)孵育。兔對人GCRV VLPs的高免疫血清(CD94;培養皿與稀釋1:5000的辣根過氧化物酶-山羊抗兔IgG (KPL, Gaithersburg, MD, USA)在37℃下孵育1小時。用1n HCl停止反應，用ELISA讀取器(MRX reveal, Dynex Technologies, Chantilly, VA)在450nm處讀取光密度(OD)。如果高免疫血清(U340)與正常血清(Z1329)的吸光度之比為>1.7[13]，則認為該樣本為陽性。

GCRV的pcr和序列分析

所有直腸拭子標本均采用RT-PCR和巢式PCR方法，使用之前發表的人類GCRV VP6和VP7基因特異性引物對GCRV進行檢測(17,22)。分別用引物BMJ44、BMJ145、BMJ13、BMJ107擴增VP6、VP7基因。分別用引物BMJ43和BMJ144、BMJ27和BMJ143對VP6和VP7進行巢式PCR。巢式PCR對VP6和VP7基因分別采用不反轉錄的RTPCR，退火溫度分別為53℃和48℃。GCRV VP6和VP7基因PCR產物用迷你柱(QIAquick, Qiagen, Valencia, CA)純化，並用ABI- prism大染料終止循環測序試劑盒和ABI prism 310遺傳分析儀(Applied Biosystems Inc.)進行測序。促進城市,CA)。

GARV的G、P分型及序列分析

采用RT-PCR方法，結合已發表的特異性引物9con1L和VP7- RDg[23]，檢測直腸拭子標本中GARV的G基因型。對VP7 G1-G4和G9分別使用9con1L引物和G型特異性引物(9T-1、9T-2、9T-3P、9T-4和9T-B)的雞尾酒，從第一個PCR產物(1025 bp)進行第二次擴增。G1、G2、G3、G4和G9菌株擴增子大小分別為158 bp、224 bp、466 bp、403 bp和110 bp。VP4 P分型的方法與VP7基因測定相同，使用先前發表的特異性引物Con2和Con3[23]。從第一個PCR產物(877 bp)開始，使用Con3引物和P型特異性引物(2T-1、3T-1和1T-1)對P4、P6和P8(分別為[24])進行第二次擴增。P4、P6、P8菌株擴增子大小分別為484 bp、268 bp、346 bp。

電子顯微鏡(EM)

用兩種不同的技術對10% PBS中的直腸拭子進行陰性染色電鏡檢查。首先，將2升1:10稀釋的大便懸浮液移到1%阿利新藍處理過的甲醛碳塗層300目鎳格柵(EMS Cat。不。FCF300-Ni)。樣品在冰箱中4ºC的網格上孵育一夜。樣品用3.5µl 1%杆菌肽[25]漂洗，3.5µl 5%鉬酸銨(pH 6.9) + 1%海藻糖(w/v)[26]進行印跡染色。塗抹後立即吸幹汙漬，然後在透射電子顯微鏡(120 kV, BioTwin, FEI, Hillsboro, OR)下觀察之前，讓網格風幹。如果使用第一種方法沒有觀察到病毒，則使用第二種方法將樣本集中到網格上。再次，將1%阿利新藍處理過的網格放置在位於Ultra-Clear™Beckman Airfuge®聚對苯二甲酸乙二醇酯微型離心管(Beckman Coulter, Inc.， Fullerton, CA Cat)的適配器中。No.345843; 5 mm × 20 mm). The grid and adapter were submerged in 80-90 µl of 1:10 diluted stool suspension. The samples were then ultracentrifuged at 20-24 pounds per square inch using a Beckman Airfuge^®(Beckman Coulter, Inc.， Fullerton, CA)。10分鍾後，網格像上麵描述的那樣被塗抹和染色。

經兩種以上獨立診斷分析檢測呈陽性的樣本被認為是GCRV陽性。

統計分析

使用SPSS 21版本(IBM, Armonk, NY)對臨床變量進行統計分析。采用Mann-Whitney U檢驗程序對年齡、住院時間、Vesikari嚴重程度評分(0-20分;嚴重>11分)，以及GCRV組和GARV組之間個別臨床症狀(如發熱和嘔吐)的持續時間。用Fisher確切概率檢驗比較GCRV和GARV GE患者的性別、有無肝炎和驚厥。在所有比較中，p值< 0.05(雙側)被認為具有統計學意義。

在本研究中，肝炎被定義為轉氨酶水平升高(丙氨酸氨基轉移酶:50 IU/L)。相反，抽搐被定義為一種沒有中樞神經係統感染跡象的大腦發作，在GE期間有劇烈的肌肉收縮和警覺性喪失，伴或不伴發熱。

結果

所有30例患者在發生GE前基本健康。平均住院時間為7.1±1.6天。患者平均Vesikari評分為12.9±2.4分;重度GE 25例。在ELISA檢測的30份直腸拭子樣本中，16份GARV陽性。16份elisa陽性樣本中14份經RT-PCR分型為G和P;G1P感染8例，G9P感染2例，g3p感染2例，G1/3P[8]混合感染1例。一個樣本G和P不可分型。

我們用ELISA法檢測了30份直腸拭子樣本中的9份GCRV抗原。elisa陽性標本用GCRV VP6和VP7基因特異性引物進行RT-PCR檢測，5例標本陽性(表1)。我們進一步用電鏡檢測elisa陽性標本，其中3例PCR陽性標本含有RV或RV樣顆粒，經電鏡證實陽性;2個PCR陽性樣品經EM檢測無顆粒，而PCR陰性樣品經EM檢測呈陽性(圖1)。總的來說，與GARV相比，GCRV顆粒稀疏，結構完整性差。因此，在檢查的30例患者中，16例GARV陽性，6例GCRV陽性，8例GARV和GCRV均陰性。在8個輪狀病毒陰性樣本中，2個沙門氏菌陽性，1個彎曲杆菌陽性，1個腺病毒陽性，4個未檢測到病原體。未發現GARV和GCRV混合感染。

圖1:腹瀉兒童直腸拭子樣品中GCRV顆粒的電鏡觀察。圖A、B和C:患者1、3和6的樣本中完整的GCRV顆粒。酒吧= 100海裏

表1:腹瀉兒童糞便標本中GCRV的檢測
* PCR產物經DNA序列分析確認
**樣品中含有與RV岩心形態相似的結構

我們接下來比較GARV和GCRV感染患者的臨床症狀，包括額外的腸道症狀(表2)。兩組患者的平均年齡無顯著差異(GARV組1.2±0.5歲，GCRV組2.0±2.2歲;P = 0.747)。GARV感染男生明顯多於女生，但GARV與gcrv感染患者性別差異無統計學意義(P=0.334)。在臨床症狀方麵，兩組患者住院時間、Vesikari嚴重程度評分、GE症狀(嘔吐、腹瀉、發熱)差異無統計學意義。盡管GARV患者的腹瀉持續時間明顯長於GCRV患者(P=0.021)。值得注意的是，GARV患者似乎比GCRV患者更容易發生肝炎(P=0.046)。隻有GARV感染的患者有驚厥記錄，GCRV感染的患者沒有驚厥記錄。所有有痙攣記錄的患者都從急性GE中恢複，出院時沒有任何後遺症。

表2:GARV和GCRV感染兒童的人口學資料和臨床症狀的比較

討論

在本研究中，30例患者中有6例經兩項以上獨立診斷分析證實gcrv陽性。雖然EM可能不是區分GARV和GCRV的特異性診斷方法，但在視覺上確認RV和RV樣顆粒仍有幫助，這些顆粒含有與RV芯相似的形態結構。為支持我們的結果，先前的一份報告表明，EM[27]不太可能檢測到原始標本中每毫升少於107個病毒顆粒。在ELISA或PCR檢測GCRV陽性的6例直腸拭子中，有3例經EM鑒定為RV或RV樣顆粒。在病例1中，雖然PCR未檢測到VP6和VP7 RNA，但EM觀察到RV顆粒，ELISA檢測到GCRV抗原。患者4和5經ELISA和PCR檢測為GCRV陽性，EM檢測為陰性。這些結果與既往報道的GCRV脆弱，常以空或核樣顆粒形式存在[28,29]，可能是由於其在腸道中的結構不穩定或在儲存和運輸過程中受損。這些數據表明，當難以收集GE患者的糞便樣本時，直腸拭子樣本可用於鑒別RV。

此外，ELISA檢測直腸拭子中GCRV的敏感性與RT-PCR幾乎相同，但特異性低於RT-PCR。這說明ELISA是篩選GCRV的有效工具。然而，空衣殼的形成或顆粒結構的不穩定性降低了RT-PCR或PAGE對RNA的檢出率，正如先前報道的，可能有比基因組數量更多的病毒蛋白可用於檢測[28-34]。這就解釋了為什麼兩種以上的方法有助於提高GCRV的檢出率。

的利益衝突

本報告中的觀察和結論僅為作者個人觀點，並不代表美國疾病控製和預防中心的官方立場。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Sugata K, Foytich K, Moon S-S, Metcalfe M, Yoshikawa T，等(2016)日本A組和C組輪狀病毒感染的臨床症狀比較。J新興疾病病毒2(4):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.122

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出版的曆史:

收到日期:2016年5月17日

接受日期:2016年6月14日

發表日期:2016年6月18日