病毒學與新發疾病- Forschen

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研究文章
與登革蛋白酶NS2B/NS3結合的脂肪酸和多肽的結構分析和分子模型研究

NHV KutumbaraoD Velmurugan＊

中科院晶體學和生物物理學，馬德拉斯大學，金奈，印度

*通訊作者:D Velmurugan，馬德拉斯大學晶體學和生物物理學院，馬德拉斯大學，金奈，金迪校區，印度，電話:9841075847;電子郵件:shirai2011@gmail.com


摘要

登革熱是一種威脅生命的疾病。非結構蛋白3 (NS3)是多蛋白加工過程中必不可少的病毒蛋白酶，它需要NS2B輔助因子的約40個殘基親水結構域才能獲得最佳的催化活性。NS2B/NS3活性蛋白酶的複合體被歸類為胰蛋白酶類蛋白酶。針對該蛋白酶設計肽類藥物是目前廣泛采用的對抗該病毒的策略之一。NS2B所采用的構象對蛋白酶的活性和底物的結合起著重要作用。我們嚐試通過各種方法設計抗NS2B/NS3的肽。這些配體是從不同的來源中選擇的，從食用魚類中分離的多肽到從木瓜葉中分離的天然化合物。根據蛋白酶的不同構象研究了配體的結合方式。

關鍵字

DENV;誘導契合對接;滑翔;OPLS力場

縮寫

DENV:登革熱病毒;衛生組織:世界衛生組織;液體模擬的優化電位。

簡介

登革病毒(DENV)屬於黃病毒．存在四種抗基因相關血清型，即DEN-1、DEN-2、DEN-3、DEN-4。病毒是通過Steomiya蚊(伊)。所有四種血清型都是引起[1]出血熱的原因。世界衛生組織將登革熱歸類為最重要的蚊媒熱帶疾病。登革熱感染的症狀不同，從流感樣疾病(登革熱)到登革休克綜合征，在某些情況下是最嚴重的登革出血熱(伴有出血異常的嚴重登革)。登革出血病是危及生命的疾病。

登革病毒基因組是一種單鏈正感RNA[2,3]，由10,723個核苷酸組成，編碼單一多蛋白前體，該多蛋白前體包含兩類蛋白質:結構蛋白和非結構蛋白。RNA基因組[4]周圍有三種結構蛋白(C、prM和E)和一個脂質雙分子層，其中蛋白質C(核心核殼蛋白)直接與RNA結合，蛋白質E(主包膜蛋白)和蛋白質M(膜蛋白)都形成了蛋白質外殼[5]。NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5為非結構蛋白。多蛋白前體經曆剪切(共和翻譯後)以產生成熟蛋白。NS3負責這種活動，使病毒活躍，並幫助進一步複製。NS3特異性作用於切割活性區域，非結構蛋白區域為NS2A/NS2B、NS2B/NS3、NS3/ NS4A和NS4B/NS5[6-10]。

蛋白酶活性在病毒生存和複製中的重要性，以及蛋白酶抑製劑在許多情況下被普遍視為一種潛在藥物的概念[11-13]，導致研究團體設計活性抑製劑來應對登革熱感染。全長180個氨基酸的蛋白酶結構域NS3片段存在於618個殘基的多結構域NS3的n端[14- 20]。NS2B(輔助因子)是激活NS3蛋白酶活性[16]所必需的。NS2B的結合可能啟動活性催化三聯體的結構排列，以獲得最佳的蛋白酶活性[21,22]。該蛋白酶對底物結合具有特異性，已被許多工作者證實。Niyomrattanakit的研究結果表明，P1和P2位置的偏好是雙基殘基，P3和P4是堿性殘基或脂肪殘基，P1 '是較小的或極性殘基[23]。NS3的最小長度決定了蛋白酶的活性。NS2B的47殘基長度被確定為蛋白酶活性所必需的。連接NS2B和NS3的甘氨酸連接物具有可溶性和酶活性[19,24]。蛋白酶序列在血清型內具有高度的序列相似性，活性位點的殘基在所有血清型中都是保守的。 The sequence alignment of the different protease structures solved from two different serotypes has been represented in the figure 1 [25]. The high similarity between the sequences is evident. This can be observed even in the case when compared with west Nile virus protease also. The DEN2 and DEN3 serotypes proteases can be observed as highly conserved, especially around the active site residues, whose color is in red. The NS2B region too has the similarity between the stereotypes which allows us to model the missing segment of one protease serotype from the other.

圖1:蛋白酶NS3和NS2B的序列比較

NS2B/NS3蛋白酶是一種典型的絲氨酸蛋白酶，第一個NS2B/NS3晶體結構是由DEN2菌株在1.5 Å分辨率(PDBID: 2FOM)[26]解出的。這是一種β桶構象，類似於糜凝胰蛋白酶，其活性位點由組氨酸(HIS)、天冬氨酸(ASP)和絲氨酸(SER)三個主要殘基組成，被稱為催化三聯體。該結構在NS2B的環區有一個間隙。許多後續解決的結構都有缺失的環，從DEN2 (PDBID: 4M9T)[27]中解決的一個結構具有報道的變構位點，有環的蹤跡，NS2B的取向與2FOM結構相似。但是最近沉積在PDB中的溶液結構(PDBID:2M9P)在活性位點上有一個抑製劑結合，NS2B區域顯示出一個主要的構象變化，類似於從DEN3[28]分解出的蛋白酶(PDBID:3U1I)構象。2FOM結構是最早被分解的構象，最近報道為非活性構象。將該構象中的NS2B片段的定位與A125C的突變結構4M9T結構進行了比較，據報道，該結構有助於識別蛋白酶中的變構區(ALA 125)。環的運動被認為具有影響作用。loop120(117-122)和loop150(153 - 164)[27]的構象至關重要，影響NS2B片段的取向。圖2顯示了環相對於NS2B取向的不同位置以及配體的位置。這些環的運動確實與配體的結合方式有關。這可以從圖2所示的不同配體的結合中看出。 The RMSD (Root Mean Square deviation) and orientations of superimposed structure 2FOM with 3U1I is 0.6 Å (127 atom pairs included) where as there is a deviation of 1.03 Å with 2M9P (only 80 atom pairs included). The RMSD between 3U1I and 2M9P is 1.18 Å (88 atom pairs included). There is a conformational similarity between 3U1I (DEN3) and the protease from West Nile virus, 2FP7 [26]. The positioning of the loop 120 is further deviated in the recent solution structure and the NS2B also. This can be inferred as the effect brought by different binding modes of the ligands. The various superimpositions of the structures are presented in figure 2. As the conformation adopted by the protease in 2FOM structure is inactive [29], many workers have used the subsequent structure such as 3U1I from DEN3 for modeling studies. Molecular docking and simulation studies were undertaken to understand the different binding modes of the ligands and the effect of placement of the loops for the ligand binding. The previous modeling studies were carried out using 2FOM as the target and we have analyzed the recent structures deposited and carried out the modeling analysis which lead to the binding mode of the few peptides similar to the binding mode of ligand seen in the 2M9P solution structure. The structure used for modeling from NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) studies is the one with the least energy.

圖2:2FOM, 4M9T, 2M9P, 2FP7, 3U1I的疊合結構

材料和方法

蛋白質從蛋白質數據庫(PDB)下載。使用PyMOL對肽進行建模。從公共化學數據庫(Pubchem)下載了木瓜葉天然產物的三維結構。合成化合物的三維結構是通過晶體學研究得到的。配體的結構必須優化，以糾正空間位姿衝突，並計算最小勢能。因此，在對接之前，使用Schrödinger 2009的Impact模塊中的oppls 2005力場(液體模擬優化勢)最小化所有配體。在最小化過程中，配體首先受到衝擊最小化模塊中可用的1000個迭代循環的最陡下降。這是一個基本步驟，在這裏可以適當處理具有空間衝突效應的初始配體幾何。接著是5000個循環的共軛梯度，這使得結構在能量和梯度方麵有很好的收斂性。它的輸出被選擇用於對接[30]。 The protein was minimized using protein preparation wizard where addition of H atoms and bond order were adjusted and further energy minimization was carried out using OPLS2005 force-field. Molecular docking helps in identifying energetically and geometrically favorable binding pose of a ligand bound to the protein. Out of different types of docking, Induced fit docking possess more advantage. This method of docking helps to treat both the ligand and the protein as flexible. Induced fit (Glide XP) module which possesses flexible docking option was used for docking of ligands with protein. The grid was specified for the site of docking by specifying the active site residues, in this case, the catalytic triad residues. Grid of 20 Å along each edge is specified for the calculations to be performed. The resulting output file was analyzed and the best pose was considered for molecular simulation studies. The molecular dynamic simulations were carried out using AMBER 12 (Assisted Model Building with Energy Refinement) [31]. The molecular dynamic simulation helps to analyze the interactions and behavior of the ligand in dynamic state over a time scale. This also helps us to know the stability of the protein-ligand complex. AMBER FF99SB force field was used for the parameterization of the protein molecule. TIP3P water box was used for the solvation of the complex and charge neutralization was carried out using Na+和Cl-離子。先使與水分子的總配合物最小化，然後進行平衡，直到係統達到穩定的溫度和壓力。

結果與討論
木瓜葉中的化合物和合成化合物

眾所周知，不同植物的提取物具有藥用價值。有許多來自植物的化合物和次生代謝物被證明具有抗菌活性的成功案例。在印度最近爆發的登革熱中，有報告說，許多醫務人員使用木瓜葉提取物治療登革熱，也看到了成功治療的案例。木瓜葉提取物已被報道具有抗登革熱活性[32]。基於此，我們用氣相色譜質譜法(GCMS)對木瓜葉提取物進行了分析，發現其主要成分為油酸、硬脂酸和棕櫚酸三種次生代謝物。我們隨後對這三種化合物對NS2B/NS3蛋白酶進行了分子建模研究，以2M9P為靶標進行對接時，相對於以2FOM為靶標進行對接時，相互作用和滑動評分相對較高，與活性位點殘基的相互作用較好。給出了對接分數、滑翔能量和相互作用圖。三種化合物均與催化殘基存在相互作用，其中有一個氫鍵相互作用，也有一些非鍵相互作用。油酸和棕櫚酸在催化位點的結合區域是相似的，但硬脂酸的結合區域是不同的。分數、能量和相互作用的信息見表1，結合位點見圖3a和3b。 The ligands oleic acid and palmatic acid were bound in a similar binding mode as in the co-crystal structure, where as the stearic acid has a different binding. The binding orientation of the two ligands which were similar to the co-crystal is represented in figure 3c. The ligand is shown in stick and the protein residues are shown in line format, with the active site residues highlighted in cyan colour. The compounds showed an improved score and energy in the binding with the protein in the modeled NMR structure, where the full structure is modeled with NS2B fragments.

圖3:油酸、硬脂酸和棕櫚酸的相互作用

圖3 b:油酸(綠色)、硬脂酸(粉色)和棕櫚酸(紫色)的結合方式

圖3 c:油酸與棕櫚酸的結合取向

我們的合作者合成的化合物和報道的[33]也采用3U1I作為模板進行建模。這些化合物也表現出了更好的結合，它們也受到了動態模擬。分析表明，化合物結合，並表現出良好的相互作用過程中軌跡。

肽作為抑製劑

使用多肽作為比合成化合物更有利的藥物已經引起了很大的興趣，因為它們毒性更小，副作用最小。基於活性位點結構或基於底物的多肽設計已經做了很多努力。近年來，許多肽先導被報道為對登革蛋白酶[34]的有效抑製劑。這些多肽也被末端修飾以合並官能團的影響。從我們之前的建模研究中，我們報道了從食用魚類中分離出的肽SHMG、GHMS，並設計了能與良好能量結合的肽，得分為[35]。現已將表現出良好效果的多肽與2M9P作為靶標進行對接，以觀察相互作用是否發生了任何變化。多肽與靶標的結合被發現更好地提高了分數和能量值。對接分數和能量值被製成表格(表2)，圖4顯示了相互作用。大多數肽的結合位點與溶液結構中的共晶配體的結合位點相似。隨著對能量的影響和對接得分的增加，其他多肽的結合不僅發生在NS3的活性位點，而且還可以與NS2B的殘基發生相互作用。 These possess hydrogen mediated interactions with SER and HIS and maintain non-bonded interactions with the other active site residues. The presence of proline and glycine in the peptide as reported in the previous modeling papers show an affinity with additional interactions. The orientation of the reverse peptides makes these to interact with both the chains. In view of the peculiar nature of its sequence and its availability in nature (these peptides are isolated from edible fishes), the reverse peptides were subjected to simulation studies. The target bound peptides were subjected to molecular dynamic simulation for 30 ns and showed a consistent binding throughout the trajectory time (data not shown). The position of the peptides and their superimposed information of the individual peptides with the 2M9P are given in the figures 5,6. It can be observed that the binding pocket of the peptides, GHMS and SMHG are similar to that of the co-crystal. The binding of the ligand with the Histidine and Serine amino acids can be found in both the peptides as seen in the co-crystal. The GHMS has a similar orientation in the pocket as in the case of cocrystal. Figures 6a and 6b show the binding orientations of the peptides and co-crystal ligand in the pocket respectively. The active site residues are represented in the cyan colour, the ligands are represented in stick model with the protein residues been projected as line with three letter indicator with residue name and number (table 3).

圖4:不同肽段與2M9P(紫色)疊加的結合模式

圖5:反肽(SMHG和GHMS)的相互作用

圖6:SMHG和GHMS的結合取向

圖6 b:共晶的結合取向

表1:木瓜葉中化合物的誘導擬合對接結果

表2:多肽誘導配合對接結果

表3:多肽與蛋白酶的相互作用細節

結論

我們試圖設計對抗登革熱病毒蛋白酶的化合物並不是一項簡單的任務。盡管登革蛋白酶的主要結構與絲氨酸蛋白酶相似，但蛋白表麵活性位點的存在、疏水囊和NS2B輔因子的影響對配體結合有很大影響。我們通過基於底物和基於活性位點的方法設計了一係列蛋白酶特異性肽。通過建模研究分析了它們與蛋白酶的結合模式，並通過對複合物進行分子動力學模擬驗證。這種方法不僅有助於找出靜態的低能量結構，而且有助於找出穩定的配合物。這可以幫助你完成在網上確定作為抑製劑的最佳配體的方法。從這個特殊的研究中，我們可以觀察到配體的結合效率受到蛋白質狀態和關鍵殘基的影響，這在晶體學研究中有時不會表現出來。對缺失的殘基進行建模，利用保守的和相似的對應體，將有助於選擇更好的配體。與核磁共振報告的結構進行的對接和動力學研究也證實了結合親和力和結合方式的改善。分子動力學進一步幫助我們發現配體的動力學性質以及它與活性位點殘基結合時的能量學。受上述結果的鼓舞，NS2B/NS3與多肽、油酸和棕櫚酸的共結晶嚐試正在進行中。

確認

作者感謝UGC和DBT(印度-德國)的財政援助。

參考文獻
  1. Murray N E A, Quam M B, Wilder-Smith A(2013)登革熱流行病學:過去、現在和未來展望。臨床流行病學5:299-309。［Ref。］
  2. 黃曉明，黃曉明，黃曉明(2006)黃病毒。見:Knipe DM, Howley PM (Eds) Fields病毒學，第34章，第5版。利平科特·威廉姆斯和威爾金斯，美國，1153-1252。［Ref。］
  3. 國野，張國傑，土chiya KR, Karabatsos N, Cropp CB(1998)黃病毒屬的係統發育。病毒學報72:73-83。［Ref。］
  4. Lindenbach BD, Thiel H-J，水稻CM(2007)黃病毒科:病毒及其複製。In: Knipe DM, Howley PM (eds)， Fields病毒學，第5版。利平科特·威廉姆斯和威爾金斯，美國費城，1102-1152。
  5. Kuhn rj，張偉，Rossmann M G, Pletnev S V, Corver J，等(2002)登革病毒的結構:對黃病毒組織、成熟和融合的影響。細胞108:717 - 725。［Ref。］
  6. Chambers TJ, Weir RC, Grakoui A, McCourt DW, Bazan JF，(1990)黃熱病病毒非結構蛋白NS3的n端結構域是一種絲氨酸蛋白酶，負責病毒多蛋白的位點特異性切割。美國科學院學報87:8898-8902。［Ref。］
  7. Lin C, Amberg SM, Chambers TJ, Rice CM(1993)黃熱病病毒NS2B-3蛋白酶在NS4A區域一個新位點的裂解是下遊4A/4B信號酶位點處理的先決條件。病毒學報67:2327-2335。［Ref。］
  8. Lobigs M(1993)黃病毒膜前蛋白的切割和刺突異二聚體的分泌需要病毒蛋白酶NS3的功能。美國科學院學報90:6218-6222。［Ref。］
  9. Preugschat F, Yao CW, Strauss JH(1990)登革病毒2型非結構蛋白NS2A、NS2B和NS3的體外加工。病毒學報64:4364-4374。［Ref。］
  10. 張克富，賴特P J(1997)登革病毒2特異性NS3蛋白的內部蛋白水解。病毒學報78:337-341。［Ref。］
  11. Tomlinson SM, Malmstrom RD, Watowich SJ(2009)基於結構發現登革蛋白酶抑製劑的新方法。感染失調藥物靶標9:27 -343。［Ref。］
  12. 徐景濤，王洪昌，陳國華，史榮榮(2006)靶向病毒蛋白酶的抗病毒藥物的發現。Curr Pharm Des 12: 1301-1314。［Ref。］
  13. Wlodawer A, Vondrasek J (1998) Hiv-1蛋白酶抑製劑:結構輔助藥物設計的一個主要成功。生物學報27:249-284。［Ref。］
  14. Lescar J, Luo D, Xu T, Sampath A, Lim S P，等(2008)針對黃病毒抗病毒抑製劑的設計:以登革病毒的多功能NS3蛋白為靶點的案例。抗病毒Res 80: 94-101。［Ref。］
  15. Arias CF, Preugschat F, Strauss JH(1993)登革2病毒NS2B和NS3形成穩定的複合體，可在解旋酶結構域內裂解NS3。病毒學193:888 - 899。［Ref。］
  16. Falgout B, Miller RH, Lai CJ(1993)登革病毒4型非結構蛋白NS2B的缺失分析:識別NS2B- ns3蛋白酶活性所需的結構域。病毒學報67:2034-2042。［Ref。］
  17. Li H, Clum S, You S, Ebner KS, Padmanabhan R(1999)登革病毒2型NS3蛋白的絲氨酸蛋白酶和RNA刺激的核苷三磷酸酶和RNA解旋酶功能域在一個20個氨基酸的區域內聚合。病毒學報73:3108-3116。［Ref。］
  18. Yusof R, Clum S, Wetzel M, Krishna Murthy HM, Padmanabhan R(2000)純化的登革病毒2型NS2B/NS3絲氨酸蛋白酶在體外與雙基氨基酸切割底物時表現出NS2B輔助因子的依賴性。生物化學雜誌275:9963-9969。［Ref。］
  19. Leung D, Schroder K, White H, Fang NX, Stoermer MJ，等(2001)在截斷NS2B輔助因子、小肽底物和抑製劑存在下重組登革2病毒NS3蛋白酶的活性。生物化學雜誌276:45762-45771。［Ref。］
  20. 李J, Lim SP、啤酒D, Patel V,溫家寶DY, et al。(2005)功能分析重組NS3蛋白酶從所有四種血清型的登革熱病毒使用四肽和八肽底物庫。生物化學雜誌280:28766-28774。［Ref。］
  21. Niyomrattanakit P, Winoyanuwattikun P, Chanprapaph S, Angsuthanasombat C, Panyim S，等(2004)登革病毒2型NS2B輔助因子中對NS3蛋白酶激活至關重要的殘基的鑒定。病毒學報78:13708-13716。［Ref。］
  22. Barbato G, Cicero DO, Nardi MC, Steinkuhler C, Cortese R, et al.(1999)丙型肝炎病毒(HCV) NS3蛋白n端蛋白酶結構域的溶液結構為其活化和催化機製提供了新的見解。分子生物學雜誌289:371-384。［Ref。］
  23. Niyomrattanakit P, Yahorava S, Mutule I, Mutulis F, Petrovska R，等(2006)利用內猝滅熒光肽探測登革病毒2型NS3絲氨酸蛋白酶的底物特異性。生物化學雜誌32(3):354 - 354。［Ref。］
  24. Nall TA, Chappell KJ, Stoermer MJ, Fang NX, Tyndall JD，等(2004)催化活性重組西尼羅病毒NS3蛋白酶的酶學表征和同源模型。生物化學雜誌279:48535-48542。［Ref。］
  25. Corpet F(1988)多級聚類的多序列比對。核酸Res 16: 10881-10890。［Ref。］
  26. Erbel P, Schiering N, D 'Arcy A, Renatus M, Kroemer M，等(2006)從登革病毒和西尼羅河病毒中激活黃病毒NS3蛋白酶的結構基礎。自然結構分子生物學13:372-373。［Ref。］
  27. Yildiz M, Ghosh S, Bell JA, Sherman W, Hardy JA(2013)登革熱病毒NS2B-NS3蛋白酶的變構抑製。ACS化學生物學8:2744-2752。［Ref。］
  28. Noble CG, Seh CC, Chao AT, Shi PY(2012)登革病毒蛋白酶的配體結合結構揭示了活性構象。病毒學報86:438-446。［Ref。］
  29. de la Cruz L, Nguyen TH, Ozawa K, Shin J, Graham B，等(2011)結合低分子量抑製劑促進登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的大構象變化:假接觸位移折疊分析。化學學報133:19205- 19215。［Ref。］
  30. 蛋白質製備向導(2009)蛋白質製備指南，第2章，Schrödinger, LLC. [Ref。］
  31. Case DA, Cheatham TE, Darden T, Gohlke H, Luo R, et al.(2005)琥珀生物分子模擬程序。計算化學26:1668-1688。［Ref。］
  32. Subenthiran S, Choon TC, Cheong KC, Thayan R, Teck M K，等(2013)Carica木瓜葉汁顯著加速登革熱和登革出血熱患者血小板計數的增長速度。循證補充醫學[Ref。］
  33. Timiri AK, Selvarasu S, Kesherwani M, Vijayan V, Sinha BN，等。(2015)新型登革病毒2型蛋白酶抑製劑磺胺衍生物的合成及分子模型研究。生物化學62:74-82。［Ref。］
  34. Luo D, Vasudevan SG, Lescar J(2015)黃病毒NS2B-NS3蛋白酶解旋酶作為抗病毒藥物開發的靶點。抗病毒文獻118:148-158。［Ref。］
  35. Velmurugan D, Mythily U, Kutumbarao(2014)作為登革熱病毒Ns2b/Ns3蛋白酶抗病毒藥物的肽抑製劑的設計和對接研究。Protein Pept Lett 21: 815-827。［Ref。］

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Kutumbarao NHV, Velmurugan D(2016)與NS2B/ NS3登革蛋白酶結合的脂肪酸和多肽的結構分析和分子建模研究。J新興病毒2(4):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.121

版權:©2016 Velmurugan D，等人。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2016年3月10

  • 接受日期:02年6月2016年

  • 發表日期:06年6月2016年