病毒學與新發疾病- Forschen

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研究文章
2009 - 2013年在阿曼流行的A組輪狀病毒基因型的分子特征

說阿爾Baqlani* 1Salah AI Awaidy2Zainab AI Lawati1Mohammed Al Toubi1法蒂瑪Sajina1Nadia Teleb3.蘇萊曼AI Busaidy1

1中央公共衛生實驗室，國家衛生和社會福利部，阿曼馬斯喀特
 2阿曼馬斯喀特衛生部衛生事務副部長辦公室
 2疫苗可預防感染，EMRO，埃及開羅

*通訊作者:賽義德·阿爾·巴克拉尼，阿曼馬斯喀特衛生部中央公共衛生實驗室，電話:+96899248132;電子郵件:saidalisaif@gmail.com


摘要

阿曼即將為兒童接種輪狀病毒疫苗。根據收集到的關於疾病負擔和循環輪狀病毒基因型的數據，這將是國家擴大免疫方案的一部分。2005年阿曼流行的主要基因型為G1P[8]，但已觀察到菌株流行率隨時間的變化。(討論中簡單提到的觀察)

為了獲得更詳細的信息，從2009年1月至2013年12月進行了一項為期5年的研究，以闡明基因型的時間多樣性，並提供有關5歲以下住院兒童輪狀病毒感染負擔的更多最新信息。

從12家區域醫院收集了6034份來自阿曼住院和非阿曼5歲以下患有中度至嚴重腹瀉兒童的糞便樣本，這些醫院在地理上代表了整個阿曼。在本研究中，有腹瀉臨床症狀的兒童中有48.5%(2931/6031)患有輪狀病毒相關腹瀉。根據當地的地域分布，對450份輪狀病毒抗原陽性樣本進行分子表征。

主要基因型組合為G1P[8]、G2P[4]和G9P[8]。G1P[8]是2009年21/77(27%)、2011年32/66(48.5%)和2012年36/65(55.38%)的優勢輪狀病毒，而2010年和2013年的優勢基因型分別是G2P[4] 13/77(16.9%)和23/50(46%)。一些菌株表現出不尋常的G和P基因型組合，表明可能是自然重組。在我們之前的研究中發現的不尋常的P[10]基因型(Said et al;在本研究中未檢測到G9序列，但自2007年以來G9序列有所增加。值得一提的是，在阿曼首次發現了G12。

根據觀察，在實施輪狀病毒疫苗接種規劃的國家，輪狀病毒引起的腹瀉的疾病和經濟負擔有所減輕，因此，阿曼輪狀病毒相關腹瀉的高流行率意味著采用了輪狀病毒疫苗接種。

關鍵字

輪狀病毒負擔;輪狀病毒基因型

簡介

腹瀉是全世界發病率和死亡率的一個重要原因。尤其受影響的是嬰兒和5歲以下的幼兒。在各種調查中，試圖估計導致一組兒童[1]腹瀉發作的細菌、寄生蟲和病毒製劑的負擔。會議確定，在全球範圍內，輪狀病毒仍然是發展中國家發病和死亡的主要原因。根據外推中包括的研究，計算出全球兒童輪狀病毒感染負擔每年約50萬人死於輪狀病毒[1,2]。

2004年，世界衛生組織-東地中海區域辦事處(世衛組織- emro)建議成員國建立國家輪狀病毒監測規劃，目的是記錄輪狀病毒胃炎的基因分型負擔，並利用這些數據對引進輪狀病毒疫苗進行循證決策。

2004年，世衛組織- emro在同年建立了東地中海輪狀病毒監測網絡。次年(2005年)，阿曼成為率先建立國家監測係統以篩查輪狀病毒感染的EMR國家之一，以確定疾病負擔和傳播基因型。

人類輪狀病毒作為胃腸道感染和腹瀉的原因於1973年首次被描述。病原體的重要性引發了對病毒的結構、複製以及發病機製和免疫反應的廣泛研究[3,4]。輪狀病毒感染範圍從亞臨床感染到伴有腹瀉、嘔吐和致命脫水的嚴重腸胃炎。針對輪狀病毒的主要保護性免疫反應是針對兩種外衣殼蛋白VP7，一種糖蛋白(G蛋白)和VP4，一種蛋白酶敏感蛋白(P蛋白)。這兩種蛋白質都被用於菌株的分型，它們已被證明在地理位置和區域之間隨時間而變化。分子流行病學研究目前區分出27種g型和35種p型。在世界範圍內具有重要流行病學意義的基因型是G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8]和G12P[8][5]。

在許多國家發展和引進輪狀病毒免疫接種後，5歲以下兒童住院和死亡人數的下降表明，輪狀病毒感染兒童的數量可以顯著減少[6,7]。

輪狀病毒感染通過糞-口途徑傳播，在阿曼全年可見。盡管工業化國家和發展中國家兒童的感染發生率相似，但結果差別很大，但非洲和亞洲貧窮發展中國家的病死率更高。在工業化國家，5歲前死於輪狀病毒病的風險為五萬分之一，但在發展中國家，這一風險可高達千分之一。阿曼輪狀病毒感染死亡率不詳;然而，5歲以下兒童接觸輪狀病毒的情況可能與其他研究中看到的情況相同，這些研究確定，幾乎每個兒童在達到5歲[9]之前都感染了輪狀病毒。

輪狀病毒抗原VP7和VP4被認為是疫苗開發的重要靶點，因為它們具有免疫原性，並引發保護性中和抗體[10]。已研製出兩種輪狀病毒減毒活疫苗[11]並獲得許可。在許多國家引入了疫苗接種，包括美國和拉丁美洲[12]、歐洲[13]和中東(path.org/rotavirusvaccines 2014)。在發達國家和發展中國家，預防輪狀病毒感染的疫苗接種已證明對健康有巨大益處，可減少腹瀉發作[14]。這兩種疫苗是根據不同的保護機製原理研製的。Rotarix疫苗(GSK生物公司)的開發是基於這樣一種預期，即使用單價疫苗進行重複免疫將產生廣泛的、異質性的交叉保護[15,16]。另一方麵，RotaTeq疫苗(默克公司)的開發旨在引發免疫反應，其中包含盡可能廣泛的中和抗體，包括五價重組疫苗中的主要中和抗體[17-19]。

世衛組織於2008年建立了全球輪狀病毒監測網絡(GRSN)，目的是為有關輪狀病毒疫苗引進和持續使用的決策提供當地數據，評估和監測疾病趨勢和基因型隨時間的分布，並開發疫苗有效性研究平台(世衛組織，2009年)。盡管全球對輪狀病毒感染和疾病有了認識，但關於輪狀病毒對阿曼兒童健康的影響的出版物很少。Scrimgeour等人報告了阿曼蘇丹國傳染病和熱帶病的流行病學薈彙分析。這些作者發現，1992年至1998年間，阿曼胃腸炎和腹瀉的發病率下降了近50%，但在該研究中沒有報告與腹瀉有關的病毒病原。後來Al Baqlani等人[21]報告說，在因腹瀉住院的5歲以下兒童中，約57%感染了輪狀病毒。在研究期間(2005年)阿曼流行的主要基因型是GIP[8]，其次是G2P[4]和G3P[8]。在世界範圍內觀察到在特定時間內在不同地區循環的基因型的顯著變化，並描述了新的基因型的出現。在阿曼進行的分子流行病學研究對於調查一段時間以來的流行病學趨勢非常重要，並可作為評價阿曼兒童輪狀病毒疫苗接種的影響和效率的基礎。

方法
研究設計

采用世衛組織輪狀病毒監測通用議定書中概述的程序建立了1-59月齡兒童腹瀉哨點監測。根據人口普查和區域代表性，全國所有12家區域醫院被選為輪狀病毒監測點，在地理上代表整個阿曼。

研究種群和標本收集

2009年1月至2013年12月期間，在12家地區醫院因急性水瀉(定義為24小時內出現≥3次液體或半液體便)住院的所有5歲以下兒童都納入了監測方案。報名時填寫一份標準的數據輸入表格。

入院後48小時內，在螺旋頂容器中收集63,34例(6034例)糞便標本(5ml或1gm)，以排除醫院感染患兒。所有糞便標本最初儲存在2°至80°C，直到將觀察冷鏈的標本運輸到阿曼馬斯喀特衛生部化驗司中央公共衛生實驗室。樣品采用抗原ELISA檢測，糞便等份保存於-20°C待進一步分析。在細菌培養基中的直腸拭子不包括在研究中。

樣品製備

在含有抗菌劑和清潔劑的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中製備10%(10%)糞便標本懸浮液，並使用OXOID (Ely)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒進行篩選，ProSpecT輪狀病毒微板試驗是否存在輪狀病毒抗原。

輪狀病毒特征

450(450)份輪狀病毒抗原elisa陽性樣本被選擇用於基因分型。選擇的依據是衛生機構的位置(地理區域)、疾病的嚴重程度、人口信息和季節。根據《阿曼兒童健康綜合管理》第3版第1.6卷第22頁的指導方針，由兒科醫生對嚴重程度進行分類。

RNA提取

按照提取規程，采用trizol -氯仿法從糞便標本中提取A組輪狀病毒dsRNA。簡單地說，將10%的糞便懸浮液中的一部分通過漩渦徹底混合，並放置在室溫(RT)下至少30分鍾。然後回收250 ul的清上清，與750 ul的TRIzol試劑混合在1.5 ml的Eppendorf管中。徹底旋渦，室溫孵育5分鍾，然後加入200 ul氯仿，再次旋渦混合，室溫孵育3分鍾。在12,000 rpm離心5分鍾後，將450 ul的上清轉移到新的Eppendorf管中，並加入700 ul的冰異丙醇。在室溫下溫和混合和孵育20分鍾後，樣品再次在4℃下以12,000轉/分離心15分鍾，使dsRNA成粒。丟棄上清液，室溫風幹顆粒。顆粒懸浮在40 ul無菌去電離或無RNase無菌水中，保存在-20°C，直到RT-PCR檢測所需。

A組輪狀病毒基因分型

輪狀病毒株的基因型采用RT-PCR，采用多重引物進行G和P分型，如前所述[23,24]。簡單地說，RNA通過兩步標準RT-PCR擴增，使用特異性引物和方法，如其他文獻所述[23,24]。少數在第一次RT-PCR中瓊脂糖凝膠電泳中可見條帶的標本在後續反應中無法分型。

對無法分型的標本用測序引物進行測序。cDNA產物清洗，(使用Promega試劑盒，Wizard SV凝膠清理試劑盒)循環測序，用Sanger 's方法[25]測序。序列分析采用dnstar - laser基因(SeqMan)軟件，核苷酸BLAST搜索確定輪狀病毒基因型。

結果
輪狀病毒感染的季節性

圖1顯示了研究期間輪狀病毒腹瀉病例的分布情況。這一情況與其他國家輪狀病毒感染的季節性分布類似，感染高峰在較冷的月份，病例數在炎熱的月份較少。

6034份糞便標本ELISA檢測輪狀病毒抗原陽性2931份(48.5%)。2931個陽性樣本中有450個(15.3%)代表阿曼所有地理區域，且完整性良好，被選擇用於進一步分析以確定其基因型。在240個樣本中，VP7和VP4基因型的測定結果如表1所示。用於測定VP7和VP4基因型的不可分型樣本不包括在本表中。

VP7基因分型:利用引物組[23]，在266/450(59%)分析樣本中獲得VP7基因1062 bp的第一輪RT-PCR擴增產物。PCR和瓊脂糖凝膠電泳可測定224/266份(84.2%)VP7 (G)基因型。其餘42/266個(15.7%)不可分型樣本采用Sanger的測序方法。利用sBeg9和End9引物[23]對42個樣本中的16個樣本進行基因型測序。這是4個G1, 3個G2, 2個G9, 1個G3, 1個G4, 2個G1/G4和3個G12。42個樣本中剩下的26個無法用我們現有的方法進行分類。VP7基因型以G1最多，其次為G2、G9和G3, G4和G12基因型較少。

2009年、2011年和2012年以G1型為主，2010年和2013年以G2型為主。我們觀察到輪狀病毒基因型G9在2011年有所增加，而基因型G3、G4和G12在研究期間的傳播水平相對較低。20/240(8.3%)基因型標本中G1、G2和G3混合感染。

VP4基因分型

在使用引物組[24]的275/450(61.1%)樣本中獲得VP4基因的第一輪RT-PCR擴增產物(876 bp)。在275份第一輪RT-PCR陽性樣本中，219份(79.6%)樣本采用標準的常規RT-PCR方法成功檢測VP4 (P)基因型。275份(20.4%)不可分型樣本中其餘56份使用第一輪RT-PCR (Con2和Con3)引物[24]進行測序，確定23個基因型，即3個P[4]， 1個P[6]和19個P[8]。其餘33個樣本無法使用我們當地現有的方法進行分類。

P基因型最常被檢測到的是P[8]，其次是P[4]，隻有一個分離物具有P[6]基因型。在整個研究期間，P[8]基因型占主導地位，而P[4]基因型在2010年占主導地位，P[6]基因型僅在2009年與罕見的G12結合被檢測到。

按年齡組的基因型分布

表1顯示了在阿曼流行的輪狀病毒基因型的年齡分布。我們觀察到除2歲以下兒童外，所有年齡組均存在常見的輪狀病毒基因型，因為該年齡組輪狀病毒抗原ELISA陽性的兒童在第一次RT-PCR中均為陽性。我們還確定了G1 P[8]和G2 P[4]在所有年齡組中循環，除了2月齡以下的主要在6-24月齡組。各年齡組的基因型分布與ELISA結果一致(表3)。

G和P基因型的組合:對240株輪狀病毒進行G和P的分子表征。G型和P型組合的優勢是G1P[8] 100株(41.7%)、G2P[4] 52株(21.7%)、G3 P[8] 16株(6.7&)和G9 P[8] 32株(13.3%)，這4種基因型組合占所有菌株基因型的80%以上。混合感染20份(8.3%)，多為G1G9、G2G3、G2G4、G2G9、G1G12和G3G4組合，未見P基因型混合感染。如表2所示，其餘稀有組合的比例不到10%。

圖1:所選菌株的基因型分析

表1:按年齡組的基因型分布

討論

本研究的目的是通過對住院的5歲以下兒童的輪狀病毒腸胃炎進行基於醫院的監測，估計2009年1月至2013年12月期間輪狀病毒疾病負擔並確定目前流行的基因型。這項研究符合世衛組織(全球輪狀病毒監測網絡)的建議，即為有關輪狀病毒疫苗引進的決策提供特定國家的數據，並監測疾病趨勢和輪狀病毒基因型隨時間的分布。

在1990年11月至1992年10月在阿曼進行的一項小型初步研究中，患有腸胃炎的未滿24月齡兒童中有31%感染了輪狀病毒，而沒有腹瀉的對照組中隻有6%感染了輪狀病毒。但是，沒有關於當時在阿曼流行的基因型的資料。2005年進行的一項後續調查顯示，約57%患有胃腸道疾病的5歲以下兒童輪狀病毒抗原[21]檢測呈陽性，其中基因分型顯示，基因型組合G1P[8]、G3P[8]和G2P[4]是主要的流行基因型。在2006-2007年的一項後續研究中，大多數分離株屬於G2基因型，其次是G1和G9[27]。本研究觀察到的主要P基因型分別為P[8]、P[4]和P[10]。

2006年至2008年，主要基因型為G2和P[4]，占所有陽性基因型樣本的45%以上(109/226)(數據未顯示)。

在我們目前的研究中，48.5%(2931/6031)腹瀉兒童輪狀病毒抗原檢測呈陽性。基因分型顯示了類似的結果，G1P[8](2009, 2011和2012)和G2P[4](2010和2013)是主要的基因型。本研究中最常見的G基因型為G1，占所有樣本的42.5%，其次為G2(23.8%)、G9(13.8%)、G3(7.1%)、G4(2.5%)和G12(2.1%)，其餘均為G組合。大多數G基因型與P[8]或P[4]基因型組合在P基因型模式中。這在世界其他地方也能看到。G基因分型記錄了兩個重要的觀察結果。首先，與2005年調查相比，G9基因型顯著增加，約占G基因型的14%。其他國家也出現了G9的這種增長。其次，我們首次在2009年和2013年收集的一些樣本中發現了G12。中東其他國家已確定G12，但也在低水平流通[30]。 Infection that involve mixtures of genotypes were seen in 20/240 (8.3%) samples. It was observed that more than 91% of rotavirus strains belonged in the 5 globally common G genotypes (G1, G2, G3, G4, and G9) and more than 99% of P genotypes were within P[4] and P[8]. Further epidemiological studies on archived samples have to be performed to get more information on the prevalence and epidemiology of genotype G12 using specific primers for the detection of G12 sequences.

在這5年的研究期間，我們發現在阿曼流行的VP4基因型主要是P[8]和P[4]，很少有P[6]。VP4基因鑒定後的P基因型模式與我們在2005年或全球觀察到的P基因型模式沒有太大差異4。對於本研究中所見的P基因型，P[8]被確定為主要基因型(73.7%，)，其次是P[4](25.8%)，隻有一個P[6](0.4%)，如表1所示。采用多重和測序方法分型的樣品很少。在非洲和亞洲的其他研究中也報道了這一點，這可能是由於糞便中的抑製因子、引物組合不匹配或新出現的菌株。

觀察到的最主要的G-P基因型組合是G1P[8]、G9P[8]和G2P[4]，占基因分型樣本的76%以上(表1)。

也許更重要的是混合基因型輪狀病毒分離株的數量在G1G9P[8]組合中最高(20個樣本中有4個)。這一事實在流行病學上很重要，因為混合輪狀病毒感染是體內或體外重組的先決條件。異常的G和P組合如G1P[4]， G2P[8]， G3P[4]或G9P[4]在非常低的數量9/240(3.75%)觀察到，大多數與P[8]組合。如表1所示，169/240輪狀病毒相關腹瀉病例發生在6至24個月的兒童中。G1P[8]約占該年齡組感染的一半(73/169)。在同一年齡組(21/169)中也觀察到G9P[8]的高患病率。

總的說來，這項調查表明，盡管保健設施、衛生設施和感染控製措施有所改善，但阿曼與輪狀病毒有關的腹瀉發作的疾病負擔並沒有顯著減少。阿曼還沒有引入輪狀病毒疫苗，因此在阿曼兒童中引入輪狀病毒疫苗肯定會對減少疾病和經濟負擔產生影響[32]。

結論

這項研究闡明了阿曼輪狀病毒相關腹瀉發作的嚴重程度。在阿曼5歲以下年齡組中，每年因各種病原引起的腹瀉總次數約為7.5萬次。已經確定，輪狀病毒在所有腹瀉病例中占45%以上，主要發生在12至24個月的兒童中(表1)。由於改善衛生條件或改善保健服務對輪狀病毒病的流行沒有直接影響，而且阿曼需要住院治療的陽性病例率仍然很高，其他國家記錄的主要公共衛生幹預措施應該是接種疫苗。根據觀察，在實施輪狀病毒疫苗接種規劃的國家，輪狀病毒引起的腹瀉的負擔和嚴重程度都有所下降，阿曼輪狀病毒相關腹瀉的高流行率意味著該國必須對兒童進行輪狀病毒疫苗接種。

表2:G和P基因型的組合

表3:A組輪狀病毒抗原ELISA檢測陽性，按年齡分組

這項研究的結果明確證明了在阿曼引進輪狀病毒疫苗的必要性。在阿曼，最有效的輪狀病毒疫苗將避免相當大比例的兒童腹瀉病例、嚴重程度/死亡率以及相關的衛生保健資源使用。

目前批準的兩種輪狀病毒疫苗(RotaTeq和RotaRix)應具有與其他國家相同的高度有效性和安全性，因為阿曼流通基因型和候選疫苗基因型相似。

然而，由於輪狀病毒基因組的多樣性和人類感染中動物宿主的存在可能會削弱疫苗的療效，對疫苗的持續評估迫在眉睫。據觀察，在低收入國家，疫苗沒有提供足夠的效力，在印度、馬拉維、尼加拉瓜、越南和孟加拉國的臨床試驗顯示，疫苗效力低至60%，原因之一是菌株多樣性[33]。

確認

我們非常感謝Georg Pauli教授和George Armah教授對我們的草案提出的建設性意見。感謝參與"全國輪狀病毒監測方案"的衛生部衛生機構。

的利益衝突

一個也沒有。這項研究由阿曼衛生部在中央公共衛生實驗室預算下資助。

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文章類型:研究文章

引用:Said Al Baqlani, Salah A Awaidy, Zainab AI Lawati, Mohammed Al Toubi, Fatima Sajina, et Al .(2016) 2009 - 2013年在阿曼流行的A組輪狀病毒基因型的分子特征。J新興疾病病毒2(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.113

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出版的曆史:

  • 收到日期:2015年11月16日

  • 接受日期:2016年1月21日

  • 發表日期:2016年1月27日