摘要

檢測丙型肝炎病毒(HCV) RNA是病毒持續複製的最早標記物和直接指標，在篩查持續HCV感染方麵比抗HCV抗體更可靠，特別是在高風險患者中，如血液透析(HD)患者中。目前，越來越多的人正在開發新的分子檢測方法，這些方法可負擔得起，有可能用於就地檢測，並推薦用於HCV RNA的早期和經濟有效檢測。

一種針對HCV基因組5 '非翻譯區(UTR)的自主研發的HCV逆轉錄酶環介導等溫擴增(RT-LAMP)試驗同時在血漿和幹血點(DBS)上進行，這些血漿和幹血點來自300名高風險患者(250名血液透析(HD)和50名慢性肝病(CLD))和50名年齡匹配的健康個體(對照組)。在研究組中，145/300(48.3%)、110/250 (44%)HD和35/50 (70%)cld在DBS上呈HCV RNA陽性。與金標準HCV Real - Time PCR和嵌套式RT-PCR相比，HCV RT-LAMP具有100%的敏感性和特異性，% CV小於10。所有檢測方法的檢出限均為50份RNA /ml。

關鍵字

幹血斑;逆轉錄酶;實時聚合酶鏈反應;血液透析

簡介

丙型肝炎病毒(HCV)感染是一種未被認識的隱性流行病，也是一個具有全球重要性的重大公共衛生問題[1]。根據全球疾病負擔，估計有1.15億抗hcv陽性個體和8000萬病毒性丙型肝炎患者[2]。

由於早期診斷HCV感染有助於成功地減輕HCV感染的負擔，在社區中，推薦一種一次性大規模篩查的算法，以早期和明確識別HCV感染者[3,4]。結合新的和推薦的治療方法，通過檢測HCV RNA篩查活動性感染將有很大的潛力減少HCV相關疾病的負擔，特別是在高危人群中[5-7]。

HCV RNA的定性、非定量靶點擴增技術，如逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和實時聚合酶鏈式反應(Real - Time PCR)，由於其RNA[8]的檢測下限(LOD)，被推薦用於篩查和流行目的。

在初始RT步驟之後，開發了一種巢式PCR以增加檢測靈敏度[9]。然而，盡管RT- PCR檢測HCV的擴增量和速度可獲得，但由於需要高精度儀器和複雜的基礎設施，在偏遠和資源匱乏的地區，RT- PCR檢測並沒有作為常規診斷工具得到廣泛應用[10,11]。

因此，需要開發技術上更簡單的分子檢測方法，像現有的聚合酶鏈反應(PCR)方法一樣高效和快速，適用於偏遠和資源有限的環境，特別是在發展中國家檢測HCV RNA。這種化驗將改善可及性、可負擔性，並有助於減輕社區中HCV的負擔[12]。

環介導等溫擴增(LAMP)法是一種高效、快速、技術簡單的分子檢測方法。這種新的DNA擴增技術依賴於使用Bst DNA聚合酶在等溫條件下(62-65°C)在簡單水浴中進行鏈置換DNA合成。通過包含初始反轉錄步驟[14]，可以使該方法適用於RNA基因組。

本研究開發了一種針對HCV基因組5 ' UTR的RT-LAMP檢測方法，並在300名高危患者的血漿和DBS上同時進行了測試。將該檢測方法的性能特點與市售的嵌套型HCV RT - PCR和HCV Real - Time PCR進行了比較。

材料和方法

道德聲明

印度海得拉巴尼紮姆醫學科學院機構倫理委員會(EC/NIMS/957/2008)批準了這項研究。從參與研究的每個人那裏獲得書麵知情同意。

臨床樣本

在5年的時間裏(2009-2013年)，300名高危患者(250名HD患者和50名診斷為CLD患者)和50名年齡匹配的健康對照組納入了該研究。

全血:兩組患者均采集全血(3 ml於EDTA抽真空管，Becton & Dickenson, USA)。血漿從各自的試管中分離出來，儲存在-20°C的無菌小瓶中，直到進一步檢測。

還收集了已知乙型肝炎病毒感染、甲型肝炎病毒感染和基孔肯雅病毒感染患者的血漿和DBS樣本。

幹血斑:兩組受試者均采用手指刺取DBS。從每個患者或對照組中，在高質量濾紙(Whatman No.3)裝置上的6個12毫米預打印圓上收集6個DBS(每個50µl)，該裝置由內部開發(圖1)。

DBS在室溫下幹燥至少2小時，然後放入單獨的帶幹燥劑的拉鏈鎖塑料袋中，在室溫(28°C)下儲存一周，然後進行測試。並且，在檢測被延遲的情況下，DBS被保存在2-8°C，直到進一步檢測HCV RNA，收集[15]後最長保存時間為1年。相對濕度在60%左右。在進一步處理之前，儲存的血漿樣本和DBS被解凍到室溫。

積極的控製

HCV血清轉換組PHV 920基因型1a和HCV血清轉換組PHV914基因型2b (Seracare Life Sciences, BBI Diagnostics, USA)標準作為所有試驗的陽性對照。

分子檢測

對研究組和對照組的血漿和DBS進行分子分析，定性反轉錄嵌套PCR[16]和定量Real - time PCR (Abbott Molecular Inc, USA)和實時熒光定量PCR (Real - time lamp)，靶向HCV 5 ' UTR基因。

RNA提取

血漿RNA提取(Qiagen, Germany):使用QIAamp病毒RNA迷你試劑盒(Qiagen, Germany)，根據製造商的說明從140 μ l的血漿中提取RNA。使用QIAamp病毒RNA迷你試劑盒(Qiagen, Germany)按照製造商說明從140 μl血清樣本中提取病毒RNA。

圖1:自主研發了用於采集幹血斑的濾紙裝置。

簡單地說，樣品首先在高變性條件下裂解(裂解緩衝液)，以滅活RNA，並確保分離完整的病毒RNA。然後調整緩衝條件，使RNA與QIAamp膜最佳結合，並將樣品加載到QIAamp Mini自旋柱上。RNA結合在膜上，其他汙染物用兩種不同的洗滌緩衝液分兩步被有效地洗掉。最後，將50 μl高質量RNA在一種特殊的無rnase緩衝液中洗脫，準備直接使用或在-20°C下安全存儲。

DBS (Qiagen, Germany) RNA提取洗脫:從DBS中打出兩個6毫米的斑點，在2ml裂解緩衝液(德國Qiagen)中室溫培養1小時。該裂解液使用QIAamp病毒RNA迷你試劑盒(Qiagen, Germany)提取病毒RNA，如前所述用於血漿。

互補脫氧核糖核酸的合成:以10 μl反應體積的2µl提取的RNA與逆轉錄酶(RT)混合(包括5X-RT緩衝液、dNTPs、RNasin®核糖核酸酶抑製劑和禽成髓細胞病毒RT (AMV-RT) (New England Biolabs, USA)合成互補DNA (cDNA)。

HCV質性逆轉錄酶嵌套PCR

正如Ponamgi等人所描述的，針對HCV[16]的5 ' UTR區域進行逆轉錄酶嵌套PCR。

嵌套PCR

第一輪嵌套PCR:將5 μl從血漿和相應的DBS樣品中提取的RNA中製備的cDNA加入到包含引物的PCR主混合(New England Biolabs)中，擴增HCV的5 '非編碼區

F1-5 -ACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCAT-3 &

R1-5”——CGAGACCTCCCGGGGCACTCGCAAGCACCC-3”。末量為25 μl。一個無模板對照(NTC，反應混合物)，一個已知的HCV RNA(陽性)對照和水空白也進行了類似的處理，以進行質量控製，並排除PCR中由於交叉汙染而產生的假陽性結果。熱循環在可編程熱循環器(Perkin -Elmer, USA)上進行，溫度95°C，持續2分鍾，在94°C，持續30秒，50°C，持續45秒，72°C，持續1分鍾，最後在72°C，持續5分鍾。

第二輪嵌套PCR:第一輪PCR產物的5µl用內引物F2 -5 ' -ACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3 '和r1 -5 ' -CCCGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGG-3 '在上述條件下再擴增35個循環。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠和溴化乙胺進行分析，並在凝膠文檔係統中可視化(Syngene, UK)。用100 bp的階梯(Fermentas)作為分子量標記。

HCV RNA RT-LAMP引物設計

從HCV基因組99-314 (216 bp)靶序列的5 ' UTR區設計HCV序列特異性引物。HCV 5 ' UTR基因的核苷酸序列從GenBank中提取(GenBank登錄號為;AY051292)，並與來自全球HCV株(包括印度流行株)的現有5’utr基因序列進行比對，使用DNASIS軟件(日立，日本)確定保守區域。

在引物Explorer V4軟件(http:/primerexplorer.jp/lamp)[14]的幫助下，設計了HCV特異性LAMP外前向引物(F3)、外後向引物(B3)、前向內引物(FIP)和後向內引物(BIP)，並設計了另外兩組引物(F和B回路)來加速擴增反應。引物根據特定標準[14]進行篩選。

所有引物在使用LAMP檢測前都進行了特異性評估，BLAST搜索Gen Bank中的序列(表1)。

RT-LAMP反應的優化

從血漿中提取RNA和相應的DBS和標準HCV RNA(陽性)對照進行HCV RT- LAMP檢測。陰性對照(反應混合物，NTC)也進行了類似的質量控製處理，以排除RT- LAMP中的錯誤結果。

RT-LAMP反應在25 μl反應液中進行(Loop-amp RNA Amplification Kit;Eiken化學有限公司。， Tochigi，日本)使用以下試劑(最終濃度):20 mM TrisHCl (pH = 8.8)，10 mM KCl,10 mM NH₄）₂所以₄， 0.1% Tween20, 0.8 M甜菜堿，8 mM MgSO4, 1.4 mM dNTP，酶混合物包含8u Bst DNA聚合酶和50u AMV逆轉錄酶(艾肯化學公司)。一個反應所需引物量為:FIP和BIP 40 pmol, LF和LB 20 pmol, F3和B3 5 pmol。最後，在反應管中加入適量的模板RNA。反應在63ºC的水浴中進行45分鍾，在80ºC滅活2分鍾。

RT- LAMP結果的檢測方法

瓊脂糖凝膠分析:在63°C孵育45分鍾後，將10µl的RT-LAMP檢測產品電泳於2%瓊脂糖凝膠(Sigma Aldrich，美國)與醋酸三酯緩衝液中的溴化乙胺，並用凝膠記錄係統記錄結果(Syngene，英國)。

視覺檢測:RT-LAMP擴增後，25 μl LAMP產品中加入0.2 μl 1/10000 DMSO SYBR®Green I (SIGMA)。任何反應管顯示從最初的橙色到蘋果綠熒光(肉眼或紫外線照射下可見)的可觀察顏色變化都被認為是HCV RNA陽性，而保留橙色則被認為是陰性結果。

LAMP F3 /B3引物實時PCR

用ABI 7500係統(Life technologies, USA)的HCV Real - Time PCR試劑盒檢測血漿和相應DBS的RNA提取物，引物為F3 / B3，評估引物的特異性。PCR循環程序如下:50°C 10分鍾逆轉錄，95°C 5分鍾初始變性，然後95°C 30秒，55°C分鍾，72°C 30秒40個循環。熔體曲線分析程序如下:95°C 1 min, 55°C 30秒，95°C 30秒，SYBR Green Real time Master Mix -12.5µl, RT/Taq Mix -0.25µl，引物正序(F3) -0.125µl，引物反序(B3) -0.125µl，核酸酶遊離水- 10µl，模板RNA- 2µl，從血漿和相應的DBS中提取。

表1:HCV RT- LAMP引物序列靶向HCV基因組5 ' UTR 216 bp靶點，基因組位置99-314

實時HCV PCR評價RT-LAMP結果和RNA定量

為了進一步評估HCV RT-LAMP的性能，FDA批準了Real Time HCV PCR (Real Time^TM采用HCV擴增試劑試劑盒(Abbott Molecular Inc, USA)進行自動反轉錄、PCR擴增和檢測/定量。

添加50µl的主混合(HCV寡核苷酸試劑，包括引物和探針，熱穩定rt從血漿和相應的DBS中提取HCV RNA 50µl。

循環條件設定如下:59℃逆轉錄30 min, 4個循環低嚴格PCR - 95℃40秒46℃30秒，6個循環高嚴格PCR -92℃30秒60℃30秒，37個循環PCR擴增-92℃30秒56℃30秒，35℃保持40秒。

測定HCV RT-LAMP的檢測限(LOD)和靈敏度

使用HCV血清轉換板PHV 920基因型1a (Seracare Lifesciences, BBI Diagnostics, USA)測定HCV RT-LAMP的LOD。

采用病毒載量為5 × 10的標準樣品評估DBS中HCV RNA的檢測能力和穩定性⁵在HCV RNA陰性檸檬酸全血中稀釋得到10,100、1,000、10,000和10,100,000拷貝/ml。製備DBS的方法是將每種稀釋劑的50 μ l在濾紙裝置上斑點，填滿斑點，並確保血液通過濾紙充分飽和。然後將卡片在室溫下幹燥至少2小時。DBS保存在4°C，直到使用上述程序，通過Real - Time PCR和RTLAMP檢測HCV RNA。

HCV RT-PCR和RT-LAMP的特異性是通過從其他病毒感染患者的血漿中提取的NAs來確定的，這些患者分別有5例乙型肝炎(DNA)、甲型肝炎和基孔肯雅病毒(RNA)。

國米運行試驗:通過在3天內用HCV RT-LAMP檢測20個DBS洗脫液來評估重複性的分析間變異。

內部運行試驗:通過同一天用HCV RT LAMP同時測試單一DBS斑點洗脫液10次，評估重複性的測定內變異。

核苷酸序列

對血漿中HCV RNA陰性的3例HCV RNA陽性DBS的RT- LAMP產物進行進一步測序，以確認並排除DBS的假陽性。HCV 5'UTR基因的核苷酸測序采用大染料終止循環測序現成反應試劑盒和ABI 3100測序儀(Applied Biosystems, USA)，按照標準方案[17]進行。序列最初進行BLAST以尋找最接近的序列標識。

結果

研究組與對照組男女比例為4:1，年齡範圍為40 ~ 60歲。

HCV質性逆轉錄酶嵌套PCR

用HCV逆轉錄酶嵌套PCR檢測256bp擴增產物表明DBS樣本HCV RNA呈陽性(圖2)。

圖2:巢式RT-PCR檢測HCV。1井- 100 bp標記(Fermentas, USA)， 2井- NTC, 3井- 1樣品血漿，4井- 2樣品血漿，5井- 1樣品DBS, 6井- 2樣品DBS。

圖3:實時RT-PCR法實時擴增HCV RNA。從左至右為每個周期HCV RNA擴增量上升的實時曲線(x軸)。

利用LAMP F3 /B3引物對RT-LAMP結果進行實時HCV PCR評價

從HCV陽性樣本中采集的DBS樣本顯示LAMP F3/B3引物實時擴增(圖3)。

HCV RT LAMP引物的特異性

HCV特異性引物對檢測HCV RNA具有高度特異性，無交叉反應。HCV RT-LAMP引物沒有與任何乙型肝炎(DNA)、甲型肝炎和基孔肯雅病毒RNA模板和來自健康個體的50個樣本進行擴增或交叉反應，這表明了它們的特異性。如圖4所示，使用外部引物F3和B3的RT-PCR產物的大小與HCV RNA的預測大小(256 bp)很好地一致。引物與相應核苷酸序列具有100%的同源性。HCV RTLAMP檢測的特異性為100%，因為在血漿和相應的DBS樣本中沒有其他病毒感染的HCV RNA陽性。

在2%瓊脂糖凝膠上的RT-LAMP擴增產物顯示為階梯狀條帶，這是由於不同莖長莖環dna的混合形成。SYBR綠法目測結果與瓊脂糖凝膠電泳結果一致。

通過巢式RT-PCR、定量Real - time pcr和RT-LAMP檢測HCV RNA的血漿vs DBS

HCV 5 ' UTR靶序列擴增3種方法的性能參數與標本類型(血漿和DBS)均相關。可接受的線性(r²> 0.99)和運行內和運行間精度(CVs <10%)記錄。

HCV RT-LAMP試驗和Real TimePCR的檢測限為50 copies /ml HCV RNA(圖5)。

對照組50例，HCV RT- LAMP和real - time PCR兩種標本均為HCV RNA陰性。兩種方法均擴增陽性對照的HCV RNA。

在DBS中，145/300(48.3%)、110/250 (44%)HD和35/50 (70%)cld的RT-PCR和RT-LAMP檢測均為HCV RNA陽性，3例DBS陽性HD患者的相應血漿均為陰性(107/250,42.8%)。從差異樣本(3個DBS)中提取RNA樣本，用F3和B3引物進行RT-PCR擴增。對擴增產物進行測序以確認結果。DBS的RT-LAMP靈敏度為100%，血漿的RT-LAMP靈敏度為97.2%。

3例病例RT- LAMP測序結果與靶序列同源性100%。DBS的RT-LAMP檢測對血漿的診斷性能如表2所示。

表2:來自DBS的RT-LAMP檢測對海得拉巴一家三級護理醫院HCV患者血漿的診斷性能

使用DBS的唯一限製是洗脫步驟延長了一個小時。

圖4:HCV特異性RT-PCR檢測產物在2%瓊脂糖凝膠上用F3和B3引物進行瓊脂糖凝膠電泳。1車道- 100 bp梯子(Fermantas, USA)， 2車道- NC, 3車道-陽性樣本顯示HCV特異性產物在256 bp。

圖5:HCV RT-LAMP檢測限。巷1-5 × 10⁵副本，2-5 × 10巷⁴副本，泳道3-5 × 10^3.副本，4-5 × 10巷²副本，泳道5-5 × 10¹C型肝炎病毒5'UTR基因Lane 6-5 × 100拷貝，Lane 7 - 100 bp ladder (Fermentas, USA)

討論

在發達國家和欠發達國家，接受長期透析的患者中丙型肝炎病毒(HCV)感染仍然很常見。發達國家長期透析患者中HCV感染的患病率和發病率有豐富的信息，並為此目的進行了一些基於人群的調查[18]。相反，關於發展中國家透析患者HCV流行病學的證據較差，且大多基於單中心研究[19]。

分子技術在HCV感染的診斷和監測治療中發揮著關鍵作用。由於丙型肝炎病毒難以培養，分子技術在首次識別丙型肝炎病毒RNA中發揮了重要作用，使其成為純分子診斷[20]識別的第一批病原體之一。

隨著近年來分子方法的改進，HCV感染的檢測、監測和治療代表了病毒學領域的一種新範式，這正日益受到世界衛生組織和美國疾病控製與預防中心的重視[7,21]。

檢測HCV RNA是感染的最早標誌和持續病毒複製的直接指標，在篩查持續HCV感染時比血清學更可靠，特別是在透析和其他免疫功能低下狀態的患者中，這些患者可能沒有足夠的抗體反應。它還允許在血清陰性窗口期即感染後立即檢測傳染性[6,22]。因此，對血液透析患者進行HCV RNA篩查是可取的，但在這種情況下應考慮成本效益分析。

本研究開發的HCV RT- LAMP靶向HCV基因組的5'UTR區域，也被其他HCV RTLAMP研究使用[11,14,23-25]。然而，早期的研究使用了來自已知HCV陽性的血清標本，與我們的研究不同，我們的血漿和DBS檢測來自研究對象的高風險患者。

HCV RT-LAMP檢測被發現是一種高度敏感的定性診斷檢測方法，它簡單、容易執行，且基礎設施最少。HCV RT- lamp的檢測限(LOD)為50 copies/mL，與巢式RT- PCR和HCV Real - Time PCR方法相似。其他研究的lod在8到84拷貝RNA / ml之間[11,14,23-25]。早期研究報道了HCV RT-LAMP在診斷HCV RNA，特別是在急性HCV感染的早期臨床診斷中的作用，基於RT-LAMP試驗發現不同HCV基因型之間的敏感性無明顯差異(11)。然而，最近的研究表明，應用RT-LAMP法檢測血液成分中HCV的基因分型具有91.5%的敏感性和100%的特異性。

HCV RT-LAMP檢測方法已經過適當評估，並顯示在不同類型的患者中滿足定義的性能目標和操作標準，滿足診斷準確性報告標準(standard)倡議[27]的所有診斷準確性標準。內部和內部測試運行參數以及測試評估表明，測試的物理格式不會受到當地診斷實踐和技能的影響。

由於LAMP試驗不需要任何複雜的設備和設施，除了一個水浴，它有很大的潛力作為一個簡單的工具，不僅用於快速檢測和診斷HCV感染和監測治療反應，而且可以用於監測和大規模流行病學研究，以評估偏遠和外聯地區的HCV感染負擔[23]。

RT-LAMP的另一個主要優勢是快速，隻需要1.5小時(包括提取步驟)就可以進行檢測，而實時PCR檢測需要2.5-3小時。使用sybr green的視覺熒光檢測方法的靈活性也是一個主要優點，不需要凝膠電泳。此外，每次HCV RT-LAMP檢測的計算成本比現有的HCV Real - Time PCR低5倍，因此任何實驗室都可以負擔得起。

HCV RNA在RT和2-8°C下穩定達12周，這應該允許方便的運輸和存儲。DBS是靜脈通路有限的血液透析患者和資源匱乏的患者護理中HCV篩查的有效方法。

這項研究強調了在印度氣候條件下使用DBS，儲存時間更長，以及使用血清學分析進行大規模調查。據我們所知，通過這項研究，在印度首次評估了HCV RT- LAMP在DBS標本上的性能特征。結果顯示，3例HD病例血漿樣品HCV RNA陰性，可能是由於血漿中RNA丟失。3例DBS型HCV RNA陽性病例RT-LAMP測序結果與靶序列同源性100%。使用DBS作為血液樣本的來源，HCV RT- LAMP的穩健性能參數支持了該檢測作為一種重要的篩查工具的實用性，可以應用於遠程設置的檢測和監測目的。DBS法是一種方便、可靠的血樣采集方法，除了洗脫步驟延長了一個小時的檢測時間外。與血漿標本[28]不同，它是堅固的，即使在長時間的儲存中也不容易變質和汙染。

確認

作者要感謝DRDO、德裏和DRDE主任Gwalior對這項研究的資助。

利益衝突

作者聲明，這篇文章的發表不存在利益衝突。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Lakshmi V, Neeraja M, Lavanya V, Priyanka EN, Sharma S，等(2016)幹燥血點實時循環介導等溫擴增法在高危患者HCV RNA檢測中的應用。J新興病毒2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.111

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出版的曆史:

收到日期:2015年12月31日

接受日期:2016年1月12

發表日期:2016年1月20日