Morozova機彙* 1、2伊薩耶娃EI1Silnikov VN3.Barinov NA2Klinov DV2、4
1俄羅斯衛生部N.F.加馬列亞流行病學和微生物學聯邦研究中心D.I. Ivanovsky病毒學研究所，俄羅斯莫斯科加馬列亞街16號，123098*通訊作者:Morozova OV，俄羅斯流行病學和微生物學研究中心，莫斯科加瑪列亞街16號，123098，俄羅斯，電話:+7(916)4212628;電子郵件:omorozova2010@gmail.com
設計並合成了Ag (I)與胱氨酸(AC-1)的水溶性配合物作為低毒核酸酶。細胞和病毒分離的RNA在37℃下完全裂解1小時;A型流感病毒粒子中的RNA -在2毫米AC-1存在的情況下2小時。通過特異性抗體、血凝和血凝抑製滴度半定量ELISA檢測，AC-1的RNase活性與病毒蛋白無損傷有關。為了檢測活細胞和病毒與潛在藥物的結合，采用了一種基於一維光子晶體表麵長程表麵波的無標記實時檢測方法。AC-1的抗病毒特性均顯示出來在體外而且在活的有機體內．經多次口服後AC-1保護指數為77.8±13.9%。AC-1對不同組織培養的細胞毒性在0.01-0.04 mM範圍內變化。對小鼠的毒性作用與給藥方式有關。由於缺乏生物傳感器檢測到的AC-1與血清和細胞蛋白的結合，因此其毒性有限。甲型流感病毒與AC-1的永久結合揭示了它的抗病毒潛力。考慮到新的分子靶點- RNA，多次口服後相對較低的毒性和明顯的抗流感病毒特性，可以得出結論，新型低分子量RNase AC-1不具有免疫原性和致敏性活性，可用於滅活疫苗製備和流感聯合治療。
低分子人工RNase;甲型流感病毒；允許組織培養;逆轉錄-實時PCR;無標簽實時光學檢測;保護指數
含rna病毒的高突變率和病毒準種的快速重排導致它們對現有藥物產生耐藥性。新的抗病毒藥物的創新和實施仍然不足。盡管廣泛使用滅活疫苗和亞單位流感疫苗以及高度特異性和敏感性的診斷方法，流感年度暴發仍然是公共衛生問題[1,2]。抵抗流感病毒對已知藥物的研究可能會激發人們尋找新的分子靶點，以推薦聯合治療。抗病毒藥物的主要標準應包括對某些病毒的選擇性失活，對宿主細胞生物聚合物的可能影響最小，長期作用以避免多次頻繁給藥，並應考慮患者的先天耐藥性和免疫狀態。核苷類似物是病毒酶和細胞酶的競爭性抑製劑，因此是有毒的。病毒蛋白酶，逆轉錄酶，整合酶和神經氨酸酶的非核苷抑製劑流感病毒與核苷衍生物相比，更特異性，因此危害更小。高分子量蛋白質，如特異性免疫球蛋白和rna酶，目前尚不清楚能夠穿透宿主細胞和包膜病毒，因此目前排除了作為潛在特異性抗病毒藥物的考慮。
人體體液中普遍存在的RNase範圍從人尿的12.3- 13.7 kDa到血清RNase的45 kDa和其聚集物的150 kDa，這阻礙了這些酶的作用。牛奶中RNase對逆轉錄病毒感染的保護作用已被設想。RNAcontaining正粘病毒似乎對血液[2]中rna酶水平升高很敏感。因此，研究低分子量的人工rna酶，使其能夠穿透病毒粒子和被感染細胞，是近20年來抗病毒藥物發展的一個有希望的方向。
目前已知的非特異性人工rna酶包括無金屬化合物和過渡金屬Cu的配合物2 +[3]、鋅2 +[4], Ln3 +[5],歐盟3 +[6]與有機配體、生物胺[7]、一些多肽[8,9]和其他低分子量有機化合物[10-12]能夠裂解某些二核苷酸的磷酸二酯鍵(CpA和UpA基序)。位點特異性人工核糖核酸酶以反義寡核苷酸[13]和核酶為基礎，能夠切割特定序列[14-16]。盡管通過使用特異性[17]或非特異性[18]人工rna酶成功滅活了病毒在體外它們對真核細胞的滲透和穩定性仍然是阻礙其實施的基本問題。
我們的目的是研究一種新型Ag (I)與胱氨酸配合物的抗病毒特性和毒性。
Madin-Darby犬腎(MDCK)上皮細胞、小鼠皮下結締組織L929、綠猴腎Vero細胞和豬胚腎PS細胞取自俄羅斯國家組織培養集(俄羅斯衛生部N.F. Gamaleya流行病學和微生物學聯邦研究中心D.I. Ivanovsky病毒學研究所，莫斯科，俄羅斯)，並在添加10%胎牛血清(HyClone, HyClone)的Eagle最低必需培養基(EMEM)中培養。“Thermo Scientific”，美國)中含有100u /ml青黴素和100u /ml鏈黴素。
A型流感病毒H1N1亞型(株A/swine Iowa 15/30)和H3N2亞型(株A/Aichi/1/68)來自俄羅斯國家病毒集(俄羅斯衛生部N.F. Gamaleya流行病學和微生物學聯邦研究中心D.I. Ivanovsky病毒學研究所，俄羅斯莫斯科)。
水溶性銀(I)與胱氨酸鋰絡合物+(Ag)+2半胱氨酸2-(哦-)2(NH3.)2] (АС-1)已合成如前麵所述[19]。簡而言之，在室溫下，將胱氨酸、氫氧化鋰、硝酸銀和氨按1:2:2:8的摩爾比混合，製備出銀-胱氨酸化合物。將反應混合物在室溫下攪拌6小時，然後在40-50℃的真空下蒸發至初始體積的1/4。加入乙醇後，將混合物冷卻並在+4- +6°C下孵育12小時。所得的水溶性黃色細沉澱物經過濾、乙醇洗滌、幹燥。
圖1:總RNA (A)和甲型流感病毒RNA (B和C部分)在37ºC與2 mM AC-1孵育後的裂解。
A-在SDS-2%瓊脂糖- tae凝膠中與AC-1孵育前(“-”車道)和後(“+”車道)的總分離RNA電泳圖，隨後用溴化乙錠染色。
B-流感病毒感染的MDCK細胞與AC-1孵育前(“-”巷)和後(“+”巷)流感病毒RNA的逆轉錄和隨後的Syber Green I實時PCR結果。
C-病毒粒子和感染細胞中病毒RNA裂解圖，與分離的RNA(左，AC-1 RNase活性陽性對照)和未與AC-1孵育的RNA(右，陰性對照)相比。
從對照MDCK細胞和感染MDCK細胞中分離總RNA流感病毒A (H3N2或H1N1)經異硫氰酸胍裂解，苯酚-氯仿脫蛋白，隨後乙醇沉澱[20]。用sds -瓊脂糖凝膠電泳分析AC-1孵育前後分離的RNA，隨後用溴化乙錠染色。
AC-1溶解於無rnase的無菌三餾水中。分離出的總RNA(5µl中5-10µg)與5µl AC-1溶液在37℃下孵育1小時。然後用隨機N6引物(“AmpliSens”，莫斯科，俄羅斯)進行反轉錄，隨後用SyberGreen I和特異性引物進行實時PCR甲型流感病毒(A/Aichi/2/1968(H3N2))血凝素基因(GenBank (http://www。登錄號J02090)
InAA-F 5 ' - TCTGTCTGGCTCTCGGCC -3 '和
InAA-R 5 ' - GATTGTTGCATATTTTCCCCG-3 '在俄羅斯莫斯科“Syntol”合成。
的流感病毒血凝試驗和血凝抑製試驗，以及固定化多克隆抗體半定量ELISA、辣根過氧化物酶抗小鼠IgG二抗體，隨後用正苯二胺[21]染色，均發現抗原。免疫腹水作為陽性對照，PBS作為陰性對照。
以0.75%的濃度使用洗滌過的人紅細胞(O型血)。60 min[22]後紅細胞凝集的最低病毒濃度(A/愛知1/68)。
圖2:流感病毒抗原的構象穩定性。A型流感病毒與特異性小鼠多克隆抗體在16 mM AC-1孵卵之前(綠色曲線)和之後(紅色曲線)結合的無標簽實時光學檢測結果。箭頭顯示隨後添加甲型流感病毒(左箭頭)和病毒特異性多克隆抗體(右箭頭)的階段。病毒抗原與相應抗體結合的2條光學檢測曲線的重合證明病毒蛋白在AC-1孵卵後具有穩定的天然構象。
A-隨後加入pAA、戊二醛、A型流感病毒[用16 mM AC-1孵卵前(綠色曲線)和孵卵後(紅色曲線)]和病毒特異性抗體後ad層厚度的變化。
B-同一時間範圍折射率對應變化(msec)。
圖3:MDCK細胞和流感病毒A/愛知1/68在0.1 mg/ml pAA65和0.1% GA修飾表麵上的原生構象和活力
A-固定化MDCK細胞用trepane blue染色。
B-用熒光染料“活的和死的”染色固定化MDCK細胞(“分子探針”，“生命技術”，美國)。
C-分離的流感病毒A/Aichi 1/68的透射電鏡。
A/愛知1/68型流感病毒感染MDCK細胞的原子力顯微鏡觀察
光子晶體(PC) [23-25] (http://pcbiosensors.com)在異丙醇和水中超聲，在等離子體清洗劑中處理。在將PC機安裝到生物傳感器EVA 2.0 (http://pcbiosensors.com)的流式細胞上時，進行了所有進一步的操作。基線(厚度和折射率)在所有測量開始時記錄在運行緩衝區中。用0.1 mg/ml聚烯丙胺(pAA) 65漂洗幹淨的PC。用水洗滌去除未結合的pAA65後，加入0.1%的新鮮戊二醛與原發nhh進一步結合2-蛋白質群。PC表麵的修改實時控製，每個階段持續時間不超過1分鍾。基線穩定後，PC暴露於蛋白或AC-1以及細胞或流感病毒懸浮液如結果和圖表所示。
氨基化PS上真核細胞的形態由按[22]染色的trepane blue控製。
樣品采用“Integra Prima”(NT-MDT，俄羅斯)原子力顯微鏡進行分析。所有AFM觀測都是用高分辨率矽懸臂梁(Nanotuning，俄羅斯)進行的，諧振頻率為190至325 kHz。懸臂梁在空氣中的自由振幅在1 ~ 10 nm範圍內。
的形態流感使用透射電子顯微鏡傑姆-2100 (JEOL，日本)在8000倍至20000倍的放大倍率下檢查病毒粒子。
隨後將20 mM AC-1溶液稀釋10倍，加入MDCK、L929、Vero和PS細胞的單層融合物中，複製或四複製於無菌48孔或96孔組織培養板中。當至少在隨後兩天的滴定中沒有明顯的細胞降解進一步進展時，進行細胞病變效應(CPE)形成的最後讀數。為了估計毒性，使用了兩種方法:
1) MTT和2)基於生物傳感器的實時光學檢測。
MTT測試:將PS、Vero和L929組織培養物分別在48孔或96孔培養皿中培養，培養皿中加入或不加入不同濃度的測試物質AC-1，並加入10%胎牛血清，直至在對照孔中融合單分子，不添加任何添加劑。用無菌PBS洗滌三次後加入MTT溶液至終濃度0.5 mg/ml, 37℃孵育3小時，然後從孔中取出MTT溶液，加入100µl二甲亞碸(DMSO)溶解MTT晶體。使用平板免疫閱讀器“Uniscan”(“Picon”，俄羅斯)在570 nm和背景630 nm處測量光密度。
基於生物傳感器的實時光學檢測如上所述(第2.7節)進行。
AC-1在實驗前立即用5種濃度的無菌三餾水稀釋:160 mM、20 mM、2 mM、0.2 mM和0.02 mM。新鮮溶液以3種不同方式注入成年ICR小鼠16-18 g:
圖4:160 mM AC-1一維光子晶體表麵固定的甲型流感病毒、小鼠血清和MDCK細胞結合的實時光學檢測
A-流感病毒;
B-小鼠血清(1:100);
C- MDCK細胞。
圖5:lg TCID的差異50流感病毒控製滴度與MDCK細胞感染前(2)或感染後(1)添加的不同濃度AC-1之間的差異。
AC-1對小鼠的毒性是根據致死率以及與對照動物相比，AC-1給藥20天內的體重減輕、炎症、體力活動、適當行為、無震顫、麻痹、痙攣和驚厥等外部體征來估計的。AC-1的最大無毒劑量為1 / 2劑量，對小鼠機體和行為無明顯影響。
用流感病毒A/ Aichi/1/68感染MDCK細胞單層，在無血清培養基中，按[26]添加5µg/ml胰蛋白酶。為了確定甲型流感病毒的感染滴度，將隨後從小鼠肺中提取的10倍稀釋的病毒懸液添加到洗滌細胞的單層中(每次稀釋4孔)。感染細胞在37℃孵育24小時後0丙型流感病毒是通過人紅細胞(0型血)[22]的血凝試驗檢測到的，病毒抗原在ELISA中為[21]，甲型流感病毒RNA通過實時PCR逆轉錄檢測到。最大組織培養感染劑量(TCID)的一半50)是從四重複重複中確定的。
用於進一步體外實驗的感染多重率(MOI)為0.1。
在輕度乙醚麻醉下，用50 μ l適應於小鼠肺部的A/愛知1/68流感病毒(10致死劑量LD)鼻內感染ICR小鼠(雄性，10-12 g)50)[27]。的infected mice were observed for 20 days postinfection. Protection coefficient (k) and protection indexes (PI) were calculated according to following formula.
$ $ \ eqalign {& k = {{{\ rm {\% }}\,{\ rm{死}}\,{\ rm在}{}\,rm{一}}{\ \,rm{控製}}{\ \,{\ rm{集團}}}在{{\ \ rm {\% }}\,{\ rm{死}}\,{\ rm在}{}\,rm{一}}{\ \,rm{實驗}}{\ \,{\ rm{集團}}}}\ cr & \ cr} $ $
$ $ Pl \ = {{{rm \ {k - 1}}} \ / {{\ rm {k}}}} \乘以100 \ % $ $
平均壽命計算如下
$ $ {\ rm{/ 1}} \τ= {{{X_1} / {t_1} + {X_2} / {t_2} / {X_3} / {t_3} + {X_4} / {t_4} +……+ Xa/ta} \ / n}$$
其中t1t2,......... t一個-老鼠感染後的死亡日流感病毒；
Х -當日病毒感染小鼠的致死數量;
n -每組實驗動物總數。
用10%胎牛血清在EMEM中培養MDCK細胞，直至融合成單層。將新鮮配製的不同濃度的AC-1溶液在MDCK感染MDCK前後2小時內加入孔中甲型流感病毒H3N2(株A/Aichi/1/68)。病毒感染引起的CPE顯微鏡觀察持續48小時。
為了研究成年實驗室小鼠的抗病毒特性，新鮮製備的不同濃度的AC-1溶液經口給藥。根據預防和治療方案進行單次和多次給藥。治療小鼠和感染流感病毒的小鼠在感染後觀察21天。
圖6:AC-1口服5次後小鼠的生存(部分)一個)和之後(部分BA型流感病毒A/Aichi/1/68鼻內感染。
1- 160 mM AC-1;
2- 16mm AC-1;
3- 1.6 mM AC-1;
4- 0.16 mM AC-1;
5-病毒控製;
6-塔米流感
連續變量比較采用Student 's t檢驗[28]。假設P <0.05有顯著意義。
李+ (Ag)+2半胱氨酸2-(哦-)2(NH3.)2](簡稱AC-1)被設計為一種低毒銀配合物和一種潛在的核酸酶，並按前麵描述的[19]合成。通過紅外光譜、紫外光譜、核磁共振等手段對AC-1的結構進行了確證109銀核磁共振譜圖見補充材料和元素分析數據[19]。
任何分離的RNA在37ºC下用2 mM AC-1孵育1小時後都能完全裂解(圖1)流感病毒細胞外病毒粒子內的RNA在2小時內是必需的(圖1)。然而，AC-1介導的RNA在受感染細胞內的切割並不徹底(圖1)。AC-1孵卵後，細胞DNA和病毒抗原(圖2)都沒有損傷。病毒粒子內的病毒RNA完全降解與感染細胞內的部分裂解之間的差異可能是由於AC-1穿透病毒粒子，但僅部分穿透細胞和化學計量比造成的。綜上所述，這些數據表明，有可能在不損害流感病毒抗原的情況下滅活流感病毒，以製備滅活疫苗或在感染早期進行預防性治療。
通過半定量ELISA、血凝試驗和AC-1處理前後與病毒特異性抗體結合的光學檢測來控製病毒抗原的構象穩定性(圖2)。通過trepane blue染色和熒光染料染色，以及原子力、透射電子和熒光顯微鏡(圖3)確認胺化表麵上宿主細胞和病毒粒子的穩定形態和活力。
AC-1與流感病毒(圖4A)，與小鼠血清的弱結合(圖4B)以及與固定化MDCK細胞無任何可檢測到的相互作用(圖4C)表明其潛在的抗病毒特性和有限的毒性。
AC-1對不同組織培養的細胞毒性有所不同(表1)。其對小鼠的毒性似乎取決於給藥途徑。與其他方式相比，口服給藥的危害較小，沒有引起任何觀察到的幹擾。鼻內給藥20和2 mM AC-1均可致死性結局。單次皮下注射160 mM或20 mM AC-1會引起震顫、拒絕進食、動力不足和致命結果，而從16 mM開始的低劑量AC-1則不會導致任何損害。這種差異可能是由於AC-1在肺和胃中的積累。AC-1不與細胞蛋白和血清蛋白結合(圖4)，說明其毒性有限在體外而且在活的有機體內(表1)。
表1:AC-1不同給藥途徑對不同來源組織培養及小鼠的毒性作用
一個CC50:真核細胞50%細胞毒性AC-1濃度(mM)bAC-1 (mM)濃度對小鼠無明顯損傷。
眾所周知，RNA是許多致病病毒的遺傳物質，因此人工RNA酶可以作為抗病毒藥物，如非包膜RNA病毒[2,18]。然而，rna酶滲透到含有rna的包膜病毒受到脂質和病毒包封蛋白的阻礙。我們所有的努力都在抑製黃病毒盡管有其他人工rna酶[29]的可用數據，但AC-1的不成功(數據未顯示)。
流感病毒已知對rna酶[2]最敏感。AC-1的抗病毒特性在體外(圖5)和在活的有機體內(圖6和表2)基本吻合並證明流感病毒不完全失活。在病毒感染前，每天口服160 mM AC-1 5次，觀察到PI最高，平均壽命最高(表2和圖6)。
表2:經多次口服後，АС-1對流感病毒A/Aichi/1/68的體內抗病毒特性
表3:A型流感病毒在小鼠肺部的感染滴度。
A型流感病毒的感染效價(以lg TCID為單位)50)在多次口服AC-1後，小鼠肺部的病毒活性低於對照組(表3)，證明病毒僅在感染細胞內部分失活，與圖1相符。
考慮到新的分子靶點，口服後毒性低，抗流感病毒新型低分子AC-1無免疫原性和致敏性活性，可用於滅活疫苗製劑和流感聯合治療。
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文章類型:研究文章
引用:莫洛佐娃OV, Isaeva EI, Silnikov VN, Barinov NA, Klinov DV， (2016) ag -胱氨酸複合物的抗病毒性能和毒性。J新興病毒2 (1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.110
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