摘要

據報道，2010年在野生鳥類中暴發了高致病性H5N1禽流感(HPAI H5N1)。采用病毒學和分子生物學方法分離了3株(A/黑頭鷗/Tyva/8/2010、A/琵鷺/Tyva/1/2010和A/大冠毛鳥/Tyva/22/2010)。在雞和小鼠中顯示出高致病性的病毒。我們在小鼠腦組織中發現了一些可能與觀察到的神經病理行為跡象有關的破壞。該菌株與2009年在Uvs Nuur湖和2008年在俄羅斯遠東地區分離的菌株(兩個分支均為2.3.2)具有密切的抗原關係。對血凝素基因的係統發育分析顯示，與2009年同一地點、2009年青海湖和2010年蒙古暴發期間分離的毒株有密切關係;因為它們都屬於分支2.3.2。在這一地區早期發現AIV可在疫情預測、早期預警和在新的AIV毒株開始從亞洲傳播到俄羅斯和歐洲時隔離它們方麵發揮重要作用。進一步調查2.3.2和2.2支高致病性H5N1病毒的全球分布將被證明對更好地理解禽流感病毒的進化生態學是無價的。

關鍵字

禽流感;2.3.2進化枝;H5N1暴發;俄羅斯;野生鳥類

縮寫

AIV:禽流感病毒;疾病預防控製中心;HA:紅血球凝聚;高致病性禽流感;世界動物衛生組織:世界動物衛生組織(國際獸疫局);PBS:磷酸鹽;聚合酶鏈反應(逆轉錄聚合酶鏈反應):世衛組織:世界衛生組織

簡介

自2006年以來，在俄羅斯-蒙古邊境(中亞)的烏夫斯努爾湖(俄羅斯聯邦圖瓦共和國，50°18′n 92°42′e)已報告了各種高致病性H5N1禽流感(HPAI H5N1)暴發[1-3]。

烏夫斯努爾湖是蒙古烏夫斯努爾盆地內的一個高鹽湖泊，其小部分屬於俄羅斯。它是蒙古麵積最大的湖(3350平方公裏)，海拔759米。這個湖的水是高鹽的(18.8 ppt)，主要是由於硫酸鹽和鈉離子[4]。烏維斯湖是各種遷徙水鳥的重要繁殖和中途停留地。一些野生鳥類沿著中亞飛行道遷徙，並在發生H5N1疫情的中國、蒙古和俄羅斯的湖泊繁殖。

2006年6月，據報告在俄羅斯西伯利亞西部的烏維斯努爾湖的野生鳥類中暴發了高致病性H5N1病毒。病毒已影響下列雀鳥:鳳頭大鳥(Podiceps cristatus)、Little Grebe (Tachybaptus ruficollis)、黑頭鷗(Larus ridibundus)、紅潛鴨(Aythya ferina)和琵鷺(Platalea leucorodia)．暴發期間分離到的A/duck/Tuva/01/06株對雞和小鼠具有高致病性，屬於清海利克類群(分支2.2)[3]。

2009年6月，在蒙古(Doitiin Tsagaan湖和Doroo湖)和Uvs Nuur湖的野生鳥類中報告了另一起高致病性H5N1疫情[2,6]。此次疫情涉及的鳥類種類與2006年相同。血凝素基因的係統發育分析表明，檢測到的病毒屬於進化支2.3.2。A/黑頭鳥/Tyva/115/09和A/大冠毛鳥/Tyva/120/09病毒與2006年之前在該地區分離的H5N1病毒明顯不同，但與同時在蒙古分離的A/大天鵝/蒙古/8/2009和A/大天鵝/蒙古/2/2009具有99%的同源性[7]。所有分離的病毒在小鼠和雞中都是致命的。

因此，本研究旨在研究Uvs Nuur湖持續爆發的H5N1病毒。

方法

病毒分離

根據標準程序[8]，將泄殖腔拭子和器官樣本接種到10日齡胚胎特異性無病原體雞蛋的尿囊腔中，檢測流感病毒。每個樣本在雞蛋中進行至少三次傳代，並通過HA試驗[8]和實時RT-PCR(«擴增流感病毒А H5N1-FRT»商業試劑盒，俄羅斯)識別流感分離株。所有病毒分離嚐試均在生物安全三級設施中進行

基因分析和測序

RNA從含有甲型流感病毒的尿囊液中提取，使用商業試劑盒(SV總RNA分離係統;Promega,麥迪遜,WI)。逆轉錄後，用PyroStartTM Fast PCR Master mix (Fermentas, Foster City, CA)進行PCR擴增。使用俄羅斯«AmpliSens流感病毒А H5N1-FRT»商業試劑盒對高致病性禽流感病毒進行鑒定。模板DNA測序使用BigDye終結者3.1版本(應用生物係統公司，福斯特城，CA)，使用Hoffman等人描述的方法。[9]。使用Vector NTI 10.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA)軟件包對樣本進行分析。MEGA 4(進化功能基因組學中心，生物設計研究所，坦佩，AZ)用於產生係統發育樹[10]。為了進行比較，我們使用GenBank數據庫中的ha基因序列來尋找最密切相關的病毒，並將它們選擇納入係統發育樹中。

血清學檢查

血凝抑製(HI)試驗如前所述[8]進行。病毒與參考抗血清和抗病毒血清進行了血凝抑製試驗，這些抗病毒血清以前在俄羅斯分離。

雞靜脈致病性試驗

根據世界衛生組織[8]製定的準則確定了對雞的分離菌的靜脈致病性。

小鼠實驗性感染

9周齡BALB/c小鼠用乙醚輕度麻醉，鼻內接種50 μ l連續10倍稀釋的PBS病毒懸浮液，觀察20天。對照組小鼠接種PBS。根據感染後1、3、5、7和10天預先指定的時間表(d.p.i)，從每個感染組(n=3)收集小鼠器官(肺、腦、肝、脾、腎)。未感染對照組於第10天人道獻祭。獻祭采用頸椎脫位。所有步驟均按照生物倫理委員會批準的研究方案進行。

組織學分析

如Potapova et al.[11]所述，處死患病小鼠，取組織樣本進行形態學研究。

結果

我們假設，像青海湖和烏維斯湖這樣的水體可能在禽流感的傳播中扮演著重要的角色，因此我們建議加強該地區現有的監測項目，並繼續深入研究新的疫情。我們在報告地區進行了持續監測，包括繁殖期和遷徙期。我們尋找鳥類的屍體，並對活鳥和死鳥進行采樣。

我們的假設在2010年6月得到證實，當時Uvs Nuur湖[2]再次報告了高致病性H5N1病毒的暴發。從三種不同種類的七隻野生鳥的肝髒、脾髒和腸道中提取的RNA(3隻鳳頭鵯(Podiceps cristatus)、兩隻黑頭鷗(Larus ridibundus)及2隻琵鷺(Platalea leucorodia)在實時RT-PCR中對甲型流感病毒和H5N1亞型檢測呈陽性。

在特異性抗體陰性的雞胚中培養每一種病毒分離物。對這些病毒進行了血凝抑製試驗，並與以前在俄羅斯分離的參考抗血清和抗病毒血清進行了檢測。結果表明，該菌株與2009年和2008年在烏夫斯湖和俄羅斯遠東地區分離的菌株(均為分支2.3.2)具有密切的抗原相關性。A/黑頭鷗/Tyva/8/2010、A/琵鷺/Tyva/1/2010和A/鳳頭蛙/Tyva/22/2010菌株對雞(IVPI = 3)和小鼠(鼻內感染，MLD50=2.8 log10 EID50/ml)具有高致病性[8,12]。

在感染A/great crested grebe/Tyva/22/2010的小鼠中，我們能夠觀察到神經病理行為體征，如顫抖和打圈運動，這一現象之前沒有在2009年分離的高致病性H5N1病毒中描述過。處死患病小鼠，取組織樣本進行[11]描述的形態學研究。在內髒中發現大量出血。心肌有多處壞死。肌纖維紊亂，有多灶性白細胞浸潤。我們還在大腦中發現了幾個充血部位(圖1)。小鼠大腦的第一個病變在第一次d.p.i.時被檢測到，包括血管腫脹、點狀出血。在第3天觀察到神經元和膠質細胞多灶壞死，小膠質細胞激活。第5天和第7天發現神經壞死明顯增加。到第10次d.p.i時，還觀察到皮質內大麵積白細胞浸潤和局部出血。此外，神經元核具有與被病毒[11]破壞的細胞核相同的黑色結構。 As soon as we found some certain differences between the brain tissues of the infected and control groups we suggested that these disruptions can be related to the observed behavior signs.

A/great crested grebe/Tyva/22/2010全基因組序列測定並提交到GenBank，登錄號為HQ131674 - HQ131681。

對血凝素(HA)基因的係統發育分析顯示，它們與2009年同一地點、2009年青海湖和2010年蒙古暴發期間分離的菌株關係密切，因為它們都屬於2.3.2支(圖2)。我們可以推測，這些菌株最初出現在2009年之前或前後的青海湖，並於2010年5月晚些時候引起了蒙古中部[6]的暴發。2010年6月，在烏維斯努爾湖發現了死鳥，並分離出98-99%與蒙古毒株相同的病毒。

討論

關於中國、蒙古和俄羅斯之間的遷徙聯係，目前的資料有限。結果表明，斑頭雁(雁屬indicus)和拉迪·謝達克(Tadorna ferruginea)和附帶的GPS衛星發射機遷移到蒙古H5N1爆發區附近的繁殖地[13]。目前還沒有關於此次研究涉及的鳥類遷徙的確切數據。但我們可以假設存在通過中亞飛道的遷徙聯係。我們的H5N1病毒係統發育研究[7,14]部分證實了這一點。

由於烏烏爾湖是東南亞和歐洲之間航線上的關鍵中途站之一，在該地區早期發現AIV病毒可在疫情預測、早期預警和在新的AIV病毒株開始從亞洲傳播到俄羅斯和歐洲時隔離它們方麵發揮重要作用。

與本研究中描述的菌株相關的菌株，最初是從青海湖地區從下列鳥類香料中分離出來的:Phalacrocorax碳水化合物)、褐頭鷗(Chroicocephalus brunnicephalus)、大黑頭鷗(Ichthyaetus Ichthyaetus)、大冠鳥(Podiceps cristatus)和斑頭雁(雁屬indicus)[15]。我們可以提出它在烏維斯湖出現的三種機製。

圖1:感染小鼠大腦皮層:A-對照;B - 5dp.i;C - 7d.p.i . HE(蘇木精和伊紅)染色切片。黑色箭頭-膨脹;紅色箭頭-壞死;藍色箭頭-溶血。

圖2:HA基因的最小進化係統發生樹。本研究中在Uvs Nuur湖分離的病毒用紅色和下劃線表示;2009年在青海湖分離到的病毒呈紫色帶下劃線;此前於2006年和2009年在烏維斯努爾湖俄羅斯一側分離到的野生鳥類病毒呈綠色。

首先是由野生鳥類直接傳播，這在兩個地區都很常見。我們認為grebes可以在這個機製中發揮重要作用。自2006年至今，該物種在烏維斯努爾湖和青海湖的所有檢測到的暴發中都有涉及[3,7,15,16]。蒙古的一個重要特征是該國的家禽產量很少，因此，在野生鳥類中檢測到的AIV不太可能來自家禽[17]。

第二種可能的機製是，病毒沿著青海和烏維斯努爾湖之間的飛行路線從一個物種傳播到另一個物種。[6]描述的蒙古中部的疫情可以在某種程度上證實這一假設。高致病性禽流感病毒可由禿頭鵝傳播到蒙古中部，在那裏它們引起了疫情，還傳播給了灰鳥和海鷗，然後它們又將這些病毒傳播到烏維斯努爾湖。

另一種可能的方法是在2009年引入Uvs Nuur湖後，在當地建立2.3.2 HPAIV環流。這種傳播可能涉及一些當地的動物物種(鳥類、哺乳動物)，或者病毒可以保存在環境中[18,19]。這個假設還需要進一步的研究。

我們對2005-2007年暴發和分離的高致病性H5N1(分支2.2)病毒最初出現在青海湖周圍，然後首先傳播到俄羅斯，隨後傳播到歐洲和非洲[1]的經驗使我們假設高致病性H5N1病毒分支2.3.2的傳播情況類似。最近在羅馬尼亞和保加利亞[20]爆發期間檢測到的株2.3.2 H5N1病毒證實了這一假設。

進一步調查2.3.2和2.2支高致病性H5N1病毒的全球分布，將使我們更好地理解禽流感病毒在自然宿主群體中的進化生態學。

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文章類型:簡短的溝通

引用:Sharshov K, Susloparov I，王偉，李錚，李磊，等(2015)野生鳥類H5N1流感病毒分離枝2.3.2神經病理作用。J新興疾病病毒1(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846.102

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出版的曆史:

收到日期:2015年7月20

接受日期:2015年8月5日

發表日期:2015年8月12日