摘要

背景:登革熱仍然是世界上傳播最快的蚊媒病毒感染，在過去50年裏增長了30倍，並向新的地區擴展。登革熱病毒的傳播受到城市化和國際旅行的影響。在全球變暖期間，有必要在登革熱流行區外對登革熱病毒進行檢測、識別和定量，以估計流行病學風險。

方法:從不明發熱患者的血液樣本中分離出登革病毒株。為證實臨床診斷，采用RTPCR和ELISA檢測IgM/IgG。對C-prM、E和NS5基因對應的RT-PCR產物進行測序，並進行係統發育分析進行分子分型。

結果:2012-14年期間，在俄羅斯遠東地區哈巴羅夫斯克、濱海和庫頁島地區95名不明發燒患者(13.7%)的13名血液樣本中確認了登革熱輸入病例。采用容許型組織培養方法，分離到登革1型和3型5株。采用登革血清型特異性引物RT-PCR，對C-prM、E和NS5基因對應的RT-PCR產物核苷酸序列進行係統發育分析，發現登革病毒1、2和3型。

結論:俄羅斯首次通過RT-PCR、ELISA和病毒分離等方法確診登革熱輸入性病例。分子分型結果顯示，從亞熱帶疫區旅行歸來的患者血液中檢出登革病毒1型、2型和3型。

關鍵字

分子類型;登革病毒;rt - pcr

簡介

登革病毒(DENV)仍然是一個新興的主要公共衛生問題。高流行率，每年至少有5 000萬例[1]新病例，地理分布廣泛，約有25億人生活在登革熱流行區，多種血清型的共循環(高度流行)，神經毒性和高度免疫反應都是嚴重的風險因素。自1799年以來，埃及就有登革熱暴發的記錄[1]。雖然在第二次世界大戰之前登革熱是零星的，但在二戰後，登革熱的暴發頻率顯著增加，並伴隨著與世界衛生組織(WHO)分類的登革熱相比，嚴重登革熱發病率的增長[1及其參考文獻]。目前，它已成為世界上傳播最迅速的蚊媒病毒感染，在過去50年裏，隨著地域擴張到新的地區，其發病率增加了30倍。目前，DENV突破了先前已知的美洲和太平洋流行地區的亞熱帶溫度屏障，向北延伸至尼泊爾、中國和法國，向南延伸至阿根廷，並從城市擴展到農村地區[1-11]。東南亞和西太平洋地區的發病率占全球登革熱負擔的75%以上。

黃病毒的四種基因和抗原性不同的血清型(DENV-1至DENV-4)通過該屬的蚊子在人類和高等靈長類動物之間傳播伊蚊．在城市循環中，人類是病毒的主要放大宿主。DENV傳播強度的增加受到人口密集城市數量和規模增加以及國際旅行的影響，國際旅行導致登革熱血清型和基因型的不斷輸入和交換。登革熱流行病學受DENV毒力、傳播力、宿主易感性和免疫反應、環境和氣候因素、高度地方性和流行活動的複雜相互作用影響[1-8]。

DENV具有陽性意義的單鏈RNA基因組，其長度約為10,700個堿基，包含一個單開放閱讀框，基因順序為5 ' -C-prM/M-E-NS1-NS2ANS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3 '。像大多數RNA病毒一樣，DENV通常以一群具有不同基因組的病毒存在，稱為準種。變異主要是由於病毒編碼的依賴於RNA的RNA聚合酶缺乏驗證能力，產生大量病毒基因組，以及宿主真核細胞和病毒中缺乏RNA修複係統，導致平均突變率高達10³到10⁵每個核苷酸和每輪複製的替換[12,13]。

在俄羅斯，近年來通過ELISA檢測denv特異性抗體確診了一些登革熱病例[9-11]。在俄羅斯歐洲地區，登革熱臨床病例是在患者前往印度尼西亞(22例)、泰國(11例)、印度(3例)、越南(3例)、委內瑞拉(2例)、新加坡(1例)、斯裏蘭卡(1例)、馬來西亞(1例)、哥斯達黎加(1例)和多米尼加共和國(1例)後登記的，而在俄羅斯遠東地區，登革熱的主要部分是在前往東南亞(主要是泰國)後登記的[10,11]。

登革熱與神經毒性無關。嚴重登革熱與血漿滲漏、出血和休克有關。另一種不太常見的症狀是肝炎。早期確診對暴發性感染可能的神經並發症和挽救生命是有價值的。診斷方法包括DENV分離，以及檢測病毒RNA、抗原和/或單獨或聯合使用的抗體。其中最敏感的方法是病毒分離和PCR反轉錄，如果在症狀出現後1-5天內采集標本(全血、血清、血漿、組織)，可確診為急性感染。ELISA在單一血清中同時檢測IgM和IgG抗體而不進行額外的臨床采樣可能提示可能的診斷，但需要進一步的確認[1-6,9-11,14]。

我們的研究旨在在俄羅斯遠東地區的患者中發現和確定一種急性不明發熱的病原。

材料與方法

血液采樣

2012-2014年期間，哈巴羅夫斯克、符拉迪沃斯托克、尤茲諾-薩哈林斯克和布拉戈維申斯克(俄羅斯遠東地區)醫院的工作人員好心提供了95名不明發熱患者的183份血液樣本。

DENV株的分離

通過Vero E6組織培養感染或1 ~ 2日齡ICR小鼠[4]腦內皮下感染，從患者血樣和人淋巴細胞中分離出DENV菌株。在最初感染後6-8天或感染後4-5天觀察到細胞病變效應。感染後10-13天，新生乳鼠出現以下紊亂:倦怠、震顫、麻痹和生長遲緩。采用RT-PCR方法在感染的組織培養物和小鼠腦懸浮液中檢測DENV RNA[2,3,6]。

ELISA

Elisa用於檢測抗DENV的IgM/IgG和抗西尼羅病毒(WNV)的特異性抗體，試劑盒為“Euroimmun”(德國)和“Bioservice Biotechnology Company Ltd”(俄羅斯莫斯科)，以及Victor F. Larichev博士(俄羅斯衛生部Ivanovsky病毒學研究所，俄羅斯莫斯科[9])提供的檢測係統。根據製造商的說明，使用“Vector Best”(俄羅斯新西伯利亞)試劑盒檢測抗蜱傳腦炎病毒(TBEV)的IgM/IgG抗體。

DENV NS1抗原的檢測

DENV NS1抗原的檢測是通過在人血清、血漿或全血中使用快速免疫層析檢測(Standart Diagnostics, Korea;MT Promed Consulting GmbH，德國)。

rt - pcr

使用“Riboprep”試劑盒(“InterLabService”，莫斯科，俄羅斯)分離總核酸。使用“Reverta L”試劑盒(“InterLabService”，Moscow, Russia)按照製造商說明使用隨機N6引物進行反轉錄。使用“Syntol”(俄羅斯莫斯科)合成的DENV C-preM和E基因特異性引物和對應NS5基因的黃色病毒特異性引物(表1)進行PCR，使用試劑盒«AmpliSensPCR»(“InterLabService”，俄羅斯莫斯科)。使用«AmpliSens PCR WNV - FL»(“InterLabService”，莫斯科，俄羅斯)檢測WNV RNA;2014年晚些時候，根據製造商的說明，«AmpliSens登革熱病毒型- FL»(“InterLabService”，俄羅斯莫斯科)被用於DENV RNA的檢測和分子分型。

表1:用於PCR和測序的引物列表

RT-PCR產物的核苷酸序列測定采用BigDye 3.1終止循環測序試劑盒和DNA分析儀ABI 3500 (Applied Biosystems, USA)。係統發育分析使用MEGA 6.06[15]。

本研究確定的DENV分離株的GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)登錄號為KJ396963-KJ396967, KJ417840- KJ417844;用於係統發育分析的參考菌株為HG316481;HG316482;KJ396964;U87411;數控001474;HG316483;HG316484;KJ396967;KJ417840; KJ417841; KJ417843; KJ417844; JN575594; JQ993305; JQ993306; FJ196844; AB608787; KC172831; JN054256; KF954949; GU370053; DQ18180; KJ734727; JF262782; AY762085.

結果與討論

在2012-2013年期間，觀察到全球登革熱的基本增長率，特別是在東南亞[1,5-11]。根據泰國國家年度登革熱發病率監測數據[7,8]，泰國DENV年感染率的周期性波動在8,100 ~ 174,285之間。已知所有DENV血清型在泰國同時存在，其中一種已成為周期性中度至嚴重流行病[5]的原因。2012- 2013年期間，發病率極高:2012年有74 250名患者，79人死亡[7];2013年152,768例患者，132例死亡[8]。嚴重的流行病學情況正在出現，特別是在泰國大陸，世界度假勝地、娛樂場所和眾多的旅行者明顯影響了周圍甚至是溫帶氣候國家的DENV輸入病例數量[1,5-11]。

在俄羅斯DENV感染的患者中，普遍的臨床表現是發熱性疾病和頻繁的頭痛。合並肌痛1例。它與檢測到denv特異性IgM相關，其效價超過西尼羅河病毒和TBEV的效價至少4倍;免疫球蛋白抗體;DENV RNA和NS1抗原，以及組織培養或新生小鼠中DENV的分離(表2)。

病因不明的發熱患者來自哈巴羅夫斯克地區(68例)、符拉迪沃斯托克和普雷莫裏的其他城鎮(23例)以及庫頁島(2例)和阿穆爾島(2例)。在85人中(已知感染地點)，63例(74.1%)患者之前去過泰國;10個越南，3個菲律賓，2個巴厘島，2個關島，1個智利，1個印度，3個非洲(埃及，馬裏和讚比亞)。RT-PCR檢測了95例熱帶發熱患者血清中的183份痰液、淋巴細胞和血清，檢出黃病毒和/或DENV RNA 16例(16.8%);而WNV RNA在它們中均未發現。16例PCR陽性標本中，臨床表現第一周采集11例(其中5例為denv特異性IgM抗體);4個樣本-在第2周和第3周(包含病毒RNA和特異性抗體);1例-在出現臨床表現的第4周，未檢出抗體。需要注意的是，從PCR陰性樣本(2株2759和2996)以及含有IgM抗體的人血液中可以分離到1和3型DENV菌株(表2)。用DENV特異性和通用黃病毒引物進行PCR分子分型，隨後對RT-PCR產物進行測序，發現5株DENV-1菌株;3 - denv - 2,5 - denv-3;其中12例來自泰國旅遊後的患者，1例來自越南旅遊後的患者(表2)。因此，通過PCR和測序，在95例不明發燒患者中，有13例(13.7%)確診登革熱感染。 In blood samples from 5 patients, flavivirus RNA and DNVspecific IgM antibodies allowed us to suspect Dengue fever.

病毒載量的定量

采用閾值循環RT-real - time PCR檢測血清和細胞中的DENV RNA_t)的變化範圍為11,46 - 21,95，對應於2,7 × 10⁵- 3,9 × 10⁸根據Lukyanov-Matz方程N=2，每個反應混合物的基因組當量^(40-n)，其中N - DNA在PCR前複製，N -閾值循環。考慮到血液樣本的體積100 μ l，不完全RNA分離和RT效率，可以估計DENV負載10⁷－10¹⁰1毫升病人血液中的病毒粒子。

病毒分離

18例患者(其中10例具有denv特異性抗體)的23種血漿液和淋巴細胞10%懸浮液感染10 ~ 13 d後，新生(1 ~ 2日齡)小鼠均表現為倦怠、震顫、麻痹和生長遲緩。用RT-PCR方法在感染小鼠腦懸浮液中檢測DENV RNA，第一傳代潛伏期為7 ~ 10天，第二傳代潛伏期為6 ~ 7天。然而，部分DENV菌株在第二次傳代時表現不穩定，臨床表現減少，在接下來的第三次傳代中完全沒有觀察到紊亂，但在腦組織和肝髒+脾髒聯合樣本中均檢測到DENV RNA。因此，從29例患者(其中17例為DENV特異性抗體)的48個血漿液和淋巴細胞樣本中，提取了部分DENV分離株，並在允許的組織培養Vero-E6上進行了回收。經6 ~ 8 d血液樣品感染後，Vero-E6細胞單分子膜從孔周到孔中心逐漸破壞。在隨後的傳代中，潛伏期縮短至4-5天，3-5次傳代中DENV滴度為5 lg TCID⁵⁰．在5株DENV中(表3)，一株用小鼠分離;3個Vero E6細胞和1個同時使用小鼠和Vero E6細胞。隔離DENV菌株,病人血液樣本在3 - 4天的臨床表現,其中3 flavivirus-specific或DENV RNA檢測,其中隻有一個是積極的RT - PCR和ELISA檢測IgM抗體(表2)。但值得注意的是,2 DENV菌株2759和2996年被孤立的ELISA和PCR -血液樣本,因為可能的酶的抑製劑在臨床樣本,有限的RT的敏感性,或PCR引物不匹配，不符合DENV新分離株的真實遺傳多樣性。三種方法檢測DENV的差異可能是由於它們的靈敏度極限和特異性不同。

使用Mega 6.06軟件對C-prM、E和NS5基因3個片段的核苷酸序列進行係統發育分析，發現使用5種備選算法(最大似然、鄰居連接、最小進化、UPGMA和最大簡約)和合理的自舉支持(部分可用數據見圖1)構建的係統發育樹拓撲結構相似。DENV輸入病例由DENV 1-3型引起。從俄羅斯遠東地區采集的患者血液中分析的樣本均不屬於DENV-4，盡管眾所周知在東南亞存在DENV多血清型共循環[5-8]。在泰國，DENV的主要血清型逐年變化:1990-92年為DENV-1型，1973-86年為DENV-2型，1988-89年為DENV-2型;1987年和1995-99年的DENV-3;1993-94年DENV-4[5,7]。

根據DENV E基因核苷酸序列的係統發育分析(圖1B)，兩株DENV-1菌株(2759和2969)似乎形成了一個獨立的分支，具有良好的bootstrep指數97。兩株DENV的C- prm(圖1A)、E (B部分)和NS5基因(C部分)的核苷酸序列也密切相關，與其他DENV菌株不同。在我們的研究中分離到的DENV-1菌株(2961)與之前描述的來自泰國的菌株相似(圖1A和1C)，而菌株2984位於樹的一個單獨分支上(圖1B和1C)。來自患者血液樣本的DENV RT-PCR產物的直接測序與來自受感染小鼠腦懸浮液或受感染Vero-E6細胞的病毒株的相應核苷酸序列完全一致(數據未顯示)。DENV基因組的任何片段的遺傳異質性，包括最保守的NS5基因區域[3](圖2A)和編碼蛋白多樣性(圖2B)，使我們能夠估計DENV分離株之間的進化起源和係統發育關係(圖1)。

圖1:采用Mega 6.06軟件、最大簡約(MP)算法和1000次重複對DENV C- prm (A部分)、E (B部分)和NS5 (C部分)基因片段的核苷酸序列進行多位點序列分析(MLSA)。從俄羅斯哈巴羅夫斯克地區患者血液樣本中分離出的DENV以粗體標記。

注釋:1 . PCR Flav代表PCR與通用黃病毒特異性引物(«+»-陽性結果，«-»-陰性結果，«n/d»-未做)。
²DENV是指針對DENV 1-4型的引物對PCR。
^3.用通用黃病毒和/或denv特異性引物對RT-PCR產物進行測序。
⁴ELISA測定反效價。
⁵DENV NS1抗原表達試驗。

表2:登革熱臨床病例特征(2012-14年)

結論

對俄羅斯遠東地區輸入性登革熱病例的研究證實了DENV的地理製圖。大多數DENV毒株是從沒有特異性抗體的血液樣本中分離出來的[4,9- 11]，這些樣本來自前往泰國旅行的患者(表3)，唯一的例外是DENV-1毒株2984，來自患者血液中抗DENV IgM滴度(1:16 0)較高的DENV-1毒株(表2)，這可能是由於它們的親和力較低。除了已知的有限靈敏度外，由於可能的免疫交叉反應，ELISA不允許識別病毒分離物。DENV RNA分離株和毒株的分子分型顯示了1、2和3型DENV，盡管在泰國有4種DENV血清型持續共循環，其中一種導致了暴發[5,7,8]。

除了DENV在人類血液中病毒載量在10範圍內的擴增⁷－10¹⁰病毒粒子每1毫升蚊子屬伊蚊可對新的流行地區的病毒傳播構成額外威脅。在哈巴羅夫斯克地區有37種蚊子蚊科家庭已登記:伊蚊煩惱，煩惱作為我國南部地區的優勢種，分布廣泛答:vexansnipponii、A. galloisi、A. cinereus、A. implicitus、A. nigrinus、A. flavopictus、A. communus、A. cyptius等物種[16]。從哈巴羅夫斯克地區的蚊子中分離出了一些病毒，包括TBEV (GenBank登錄號KJ744034)、Powassan、Negishi、Geta、Batai和加利福尼亞腦炎病毒[16]。盡管在俄羅斯非流行地區診斷出登革熱的可能性(近13.7%)，但除非全球變暖使該地區成為登革熱的自然棲息地，否則DENV不太可能發生本地傳播瘧蚊．需要進一步監測DENV輸入病例並開展分子流行病學研究。

致謝

我們感謝Victor F. Larichev博士(俄羅斯莫斯科Ivanovsky病毒學研究所)為我們提供ELISA試劑盒來檢測denv特異性IgG和IgM抗體，感謝Alexander M. Butenko教授(俄羅斯莫斯科Ivanovsky病毒學研究所)的鼓勵和支持。

DENV應變	的國家 感染	一年 的 隔離	臨床 情況下	登革熱 類型	GeneBank登錄號
					C-preM	E蛋白
Khabar 2759	泰國	2012	DF	我	KJ396963	KJ417841
Khabar 2961	泰國	2012	DF	我	KJ396964	KJ417842
Khabar 2969	泰國	2012	DF	我	KJ396965	KJ417843
Khabar 2984	泰國	2012	DF	我	KJ396966	KJ417844
Khabar 2996	泰國	2013	DF	3	KJ396967	n / d

表3:本研究分離的DENV株的特征

圖2:DENV NS5基因片段核苷酸序列(A部分)和推導氨基酸序列(B部分)的多重比對。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Pukhovskaya NM, Morozova OV, Bakhmetyeva SV, Zdanovskaya NI, Belozerova NB等(2015)俄羅斯遠東地區輸入性登革病毒(DENV)分離株的分子分型。J新興疾病病毒1 (1):doi: http://dx.doi。org/10.16966/2473 - 1846.101

版權:©2015 Pukhovskaya NM，等人。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2015年5月29日

接受日期:2015年6月11日

發表日期:2015年6月17日