摘要

自2019年12月出現嚴重急性呼吸道冠狀病毒-2以來，2019年是全球大流行。預防新冠肺炎最有效的方法是疫苗。本研究利用HEK293細胞係生產重組蛋白，並比較幾種候選疫苗的效率。候選蛋白的結構設計基於S1蛋白和RBD區域。三次注射後，疫苗在小鼠體內誘導了SARS-CoV-2特異性中和抗體，呈現高滴度。在無炎症反應的情況下，其最大中和活性可達90%以上，表明其對新冠病毒有很強的中和能力。

重要聲明:2019年以來，新冠肺炎疫情開始威脅人類。本文揭示了一種新的重組蛋白疫苗，可誘導小鼠對冠狀病毒產生免疫。比較了人胚胎腎293細胞表達的不同潛在疫苗的療效。它展示了它們的區別，幫助人們更多地了解COVID-19亞單位疫苗。

關鍵字

COVID-19;疫苗;HEK293;重組蛋白

簡介

隨著2019冠狀病毒病(COVID - 19)在全球大流行，已有超過1.03億例COVID - 19病例報告，超過200萬人被確診。研製新型冠狀病毒疫苗，幫助人類擺脫新冠病毒的威脅已迫在眉睫。病原體嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)是一種β冠狀病毒，導致了COVID - 19大流行[1]。SARS-CoV-2有29903nt編碼4個結構蛋白(核衣殼蛋白、膜蛋白、刺突蛋白和包膜蛋白)和16個非結構蛋白(nsp1-16)[2,3]。SARS-CoV-2進入細胞依賴於刺突蛋白。它包含兩個子單元，S1和S2。S1亞基由n端結構域(NTD)和受體結合結構域(RBD)組成，RBD與宿主細胞的受體血管緊張素轉換酶2 (ACE2)結合，確定感染入口[2-6]。據報道，新冠肺炎患者產生的抗體大部分與S1蛋白的受體結合域(RBD)結合。S1蛋白被認為是疫苗開發的成功靶點[4,7-12]。

自2020年以來，已經啟動了幾項關於COVID - 19疫苗的研究。市麵上有2種mRNA疫苗和幾種蛋白質疫苗[13-17]。這些疫苗是在S蛋白的基礎上研製的，具有很好的保護作用。盡管市場上有許多有效的疫苗，但病毒的變異和有限的生產仍然威脅著數十億人的生命[17]。特別是，目前的疫苗在防禦SARS-CoV-2變體方麵的效力下降。突變體的傳播速度較快。

多項研究表明，基於igg的支架可以增強融合蛋白的溶解性和穩定性，產生強大而持久的免疫反應[18-20]。通過補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)殺死病毒感染的細胞需要片段可結晶(Fc)區域[21,22]。一些fc融合靶向受體-配體相互作用，作為激動劑直接刺激受體功能，降低或增加免疫活性[23]。本研究比較了S1-His、RBD和S1-Fc的免疫效率。為了提高疫苗的有效性，我們利用瞬時表達係統Expi293F細胞，將S蛋白與突變IgG結合，製成S1-Fc疫苗。Expi293F細胞係以其高轉染效率和人源性受到研究人員的青睞。三劑量的S1-Fc與佐劑誘導的劑量水平依賴性增加偽病毒中和滴度和免疫小鼠體外測試。

材料和方法

細胞培養

人胚胎腎HEK293F (Expi293F^™在杜爾貝科改良的Eagle’s培養基(DMEM)中培養。對細胞株進行支原體檢測。接收後無菌汙染，膨脹和冷凍保存前。Expi293F^™細胞在Expi293中生長^™培養基與穀氨酰胺(Gibco)。所選培養基為化學成分明確、無血清、無蛋白質、無動物來源的培養基。用聚醚酰亞胺(PEI maxtmpolyciences, Inc)瞬時轉染細胞。

人胚胎腎HEK293T(來自Thermo Fisher)在杜爾貝科改良Eagle培養基(DMEM)中與穀氨酰胺培養^™(Gibco)添加10%的胎牛血清(FBS [Sigma-Aldrich])。當293T細胞生長到80%以上時，可以傳代。含10%胎牛血清、胰酶和PBS的DMEM培養基在37°C水浴中加熱。細胞用5ml PBS衝洗一次。加入3ml胰酶(0.5%)，輕輕搖動，使胰酶完全覆蓋培養瓶細胞表麵1分鍾。用含10%胎牛血清的5ml DMEM培養基終止消化。細胞離心，6.5 × 10⁵獲得細胞進行培養。當細胞生長到50%時，可用於轉染。

S蛋白的表達和純化

將蛋白基因合並如圖1所示，並進行密碼子優化。然後將該基因插入pcDNA3.4質粒中。(由Genscript)。以哺乳動物蛋白表達係統Expi293F作為宿主細胞。將重組質粒溶於1.5ml Opti-MEM (DNA密度:3ug/ml)中，與轉染試劑PEI混合。當細胞密度達到3.0 × 10時⁶細胞/ml，細胞活力>95%，將混合物加入細胞培養瓶中。培養6 d後獲得重組蛋白。

圖1:S1-Fc基因示意圖。它由信號肽、刺突蛋白和Fc區組成。

重組蛋白s1 - fc的純化采用蛋白A親和層析法。采用GenScript和AKTA AVANTTM的Monofinity A樹脂純化融合蛋白，流速為1ml/min。所使用的程序是按照協議所描述的進行的。然後進行透析和超濾濃縮。最後用安裝在AKTA AVANT上的Superdex 200進行最終淨化。SDS-PAGE用於測定重組蛋白的大小(SDS-PAGE kit Solarbio)。

使用His Trap Excel親和層析柱(1ml預填充柱，最大流速:4ml/min，最大壓力:0.5MPa)捕獲並純化帶有His標記的AKTA蛋白。平衡緩衝液A: 20mM Tris, 150mM NaCl, pH 6.5，洗脫緩衝液B: 20mM Tris, 150mM NaCl, 500mM咪唑，pH 6.5(平衡，緩衝液用超聲脫氣)。His柱衝洗，平衡，流速為1ml/min。

RBD是一種商業化蛋白，購自中國生物(Cat: 40592-V08H118)。

高效液相色譜法

用HPLC-SEC法分離蛋白。儀器為Waters™高效液相色譜儀。采用Xbridge™BEH 200 Å SEC (7.8*300mm, 3.5μm) SEC色譜柱，流動相流速(150mM磷酸鹽含10%甲醇)0.86ml/min。平衡色譜柱至基線穩定後，加載10μl，檢測波長214nm, 20分鍾內記錄色譜圖和數據。利用Empower軟件對檢測結果進行處理，根據麵積歸一化法計算蛋白質純度。

酶聯免疫吸附試驗

重組蛋白濃度采用“三明治”捕獲法和酶聯免疫吸附法(ELISA)測定。96孔板用含有32mM碳酸鈉、68mM碳酸氫鈉(pH 9.6)的碳酸鈉緩衝液在4℃下包被抗體(sinbio, Cat:40150-D003)，然後用5%牛血清阻斷。將純化產物和培養上清兩份分別加入孔中，37℃孵育2 h。然後用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯抗穗IgG (sinbio, Cat: 40150-D001-H)孵育板1小時。最後，用3,3 '，5,5 ' -四甲基聯苯胺(TMB)顯影，測量450 nm處的光密度(OD) (Molecular Devices, SpectraMax®iD3)。

采用間接法測定IgG滴度。刺突蛋白(sinbio, Cat: 40591-V08H)包被在96孔板上，用5%牛血清阻斷。在磷酸鹽緩衝液中稀釋1:100的小鼠血清重複加入孔中，進行2倍連續稀釋，然後在37°C孵育2 h。然後用HRP偶聯的山羊抗小鼠IgG(中國生物，Cat: SSA007)孵育培養皿1小時。加入TMB，測量OD。

所有的折線圖和柱狀圖均使用GraphPad繪製。繪製IgG線圖後，在GraphPad上通過log(抑製劑)與response - Variable slope(四個參數)的函數計算IC50。

ACE2綁定測試

S蛋白通過受體結合域(RBD)與細胞表麵受體ACE2結合，這是膜融合的必要步驟[5,24]。ACE2結合試驗可以評估候選疫苗結合ACE2防止病毒進入的能力。用含有32mM碳酸鈉、68mM碳酸氫鈉(pH 9.6)的碳酸酯緩衝液在4℃下用ACE2 (sinbio, Cat: LC14SE1109)包被6孔板，然後用5%牛血清阻斷。將純化產物加入不同濃度的孔中，37°C孵育2 h。阻斷血清時，將免疫小鼠血清與62.5ug/ml S1-His混合加入孔中，37°C孵育2 h。清洗培養皿，然後與帶有辣根過氧化物酶(HRP)偶聯物的抗穗IgG孵育1小時(sinbio, Cat: 40150-D001-H)。最後，用3,3 '，5,5 ' -四甲基聯苯胺(TMB)顯影，測量450nm處的光密度(OD) (Molecular Devices, SpectraMax)^®iD3)。

高峰pseudovirusneutralisation變體

293T-ACE2細胞(中國生物，Cat: OEC001)以3-5 × 10^4/ml 200ul /孔接種於96孔板中。電鍍後，置於37℃，5% CO2培養箱中24小時。假病毒(中國生物，Cat: PSV001)在使用前被稀釋2倍。試驗樣品與假病毒混合，室溫孵育1小時。吸取預先鋪好的293T-ACE2平板上清液，將假病毒混合物加入平板。在37℃下孵育48小時。每口井加入50ul顯色劑(Fire-LumiTMkit, GenScript)。試驗樣品分為陽性對照和陰性對照。抑製率(%)=1-(樣本RLU平均-陰性RLU平均)/(陽性RLU平均-陰性RLU平均)。

免疫接種

利用重組蛋白進行動物免疫實驗。免疫實驗流程圖如圖2所示。實驗使用至少25g的C57BL/6雄性小鼠。重組蛋白用PBS與鋁佐劑(v/v:3:1)混合稀釋後皮下注射。每隻小鼠注射100ul混合液。監測小鼠體重和體溫。動物實驗由KCI生物技術公司進行。所有動物程序均經KCI生物技術機構動物護理和使用委員會批準，並根據NIH實驗室動物護理和使用指南執行。所有的努力都是為了減少動物的數量，盡量減少動物的痛苦。

圖2:不同血清的偽病毒中和效價。用30μl假病毒稀釋液混合20ul 30倍稀釋的血清作為樣品。陽性對照由30ul假病毒稀釋液和20ul PBS液組成。陰性對照為50ul DMEM。抑製率(%)=1-(樣本RLU平均-陰性RLU平均)/(陽性RLU平均-陰性RLU平均)。x軸表示不同小鼠的血清。Number #為鼠標編號。AL為佐劑氫氧化鋁免疫小鼠血清。S1-His+AL為佐劑免疫了S1-His的小鼠血清。RBD+AL為佐劑RBD免疫小鼠血清。 S1-Fc+AL indicates the serum from the mouse immunized with S1-Fc with adjuvant.

結果

重組蛋白的表達

首先，S1-His被開發為我們的潛在疫苗，它被插入pcDNA3.4，然後轉染HEK293T。為了比較不同宿主細胞的作用，用HEK293F和HEK293T表達S1-His。結果表明，HEK293F的重組蛋白產量高於HEK293T(圖3A)。純化後用高效液相色譜法檢測重組蛋白。結果如圖3B和c所示。HEK293T表達的S1-His約為0.2mg/L, HEK293F表達的S1-His約為1.4mg/L。S1-His的分子量在100kDa ~ 130kDa之間。純化後，由於在HEK293T培養中補充了血清，HEK293F表達的蛋白比HEK293T更純。在純化方麵的優勢使我們更傾向於使用HEK293F作為宿主細胞。

圖3:(A) S1-His蛋白在不同宿主細胞(HEK293T和HEK293F)中的表達。(B) HEK293T表達的S1-His蛋白。S1蛋白的製備及其SDS-PAGE(左圖)、AKTA-AVANT色譜(中圖)和HPLC(右圖)的表征。(C) HEK293F表達的S1-His蛋白，用SDS-PAGE(左圖)、AKTA-AVANT色譜(中圖)和HPLC(右圖)進行表征。(D) HEK293F表達的S1-Fc蛋白，用SDS-PAGE(左圖)、AKTA-AVANT色譜(中圖)和HPLC(右圖)進行表征。(E) HEK293F中S1-His和s1 - fc蛋白的表達。

將由信號肽、冠狀病毒刺突蛋白和片段可結晶區組成的S1-Fc基因插入pcDNA3.4質粒中。S1-Fc的分子量約為102.81 kDa。從圖3D可以看出，HEK293F表達的S1-Fc在130kDa到170kDa之間。這可能表明HEK293F表達的S1-Fc存在糖基化。由於糖基化已被證明影響幾種蛋白質功能，包括蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質活性，用於生產重組蛋白質的細胞係可能對其功能有重大影響在體外而且在活的有機體內．先前的研究表明HEK293細胞表達的蛋白富含糖基化[25]。將質粒轉染HEK293F細胞係，重組蛋白表達量約為8mg/L(圖3E)。

HEK293F中S1-Fc的表達高於S1-His的表達(圖3E)。結果表明，蛋白A親和層析柱的純化效果優於His柱的純化效果。純化後的S1-Fc純度可達97%，S1-His純度可達94.78%(圖3B和C)。

血管緊張素轉換酶2結合試驗

S蛋白通過受體結合域(RBD)與細胞表麵受體ACE2結合，這是膜融合的必要步驟。與ACE2結合可以有效阻止病毒的進入[5,25]。ACE2結合試驗可以評估候選疫苗的結合能力(圖4A)。結果表明，S1-His蛋白能與ACE2結合。當濃度達到250ug/ml時，OD值在2左右，且不隨濃度的增加而增加。結果表明，重組蛋白能與ACE2結合，並能部分阻止病毒與ACE2結合。因此，病毒的進入會降低[25]。3年後的血清^{理查德·道金斯}用S1-His的免疫與S1-His孵育，然後用混合物評估其結合能力(圖4B)。結果表明，S1- his免疫具有抑製S1與ACE2結合的能力。S1- his免疫可有效中和S1與ACE2的結合。

圖4:(A) S1蛋白與ACE2受體的結合結果。x軸為S1-His濃度，單位為μg/ml; y軸為OD值(A450)的結合信號強度。(B) S1蛋白免疫小鼠血清對S1蛋白結合其ACE2受體的阻斷作用。x軸為不同的阻斷劑，包括PBS(不含血清)作為阻斷對照，PBS血清為PBS免疫的小鼠血清，以及在3^{理查德·道金斯}S1-His免疫分別為5ug/ml和25ug/ml。阻斷試驗中S1-His蛋白的濃度為62.5ug/ml。

小鼠免疫

免疫策略按照圖5A所示進行。采集血清，ELISA檢測。采用氫氧化鋁作為免疫佐劑。免疫實驗分為4組:AL組:用氫氧化鋁和PBS免疫小鼠。RBD+AL:用氫氧化鋁和RBD蛋白混合物免疫小鼠。S1-His+AL:用氫氧化鋁和S1-His蛋白混合物免疫小鼠。S1-Fc+AL:用氫氧化鋁和S1-Fc蛋白混合物免疫小鼠。各組均免疫3次。ELISA法測定血清IgG滴度。每次免疫後測定血清，結果見圖5B。 The x axis indicated the serum dilution times, and the y axis indicated the OD value.

圖5:S1蛋白的免疫。(一)蛋白質免疫策略。D-5:第一次免疫前5天;D-0為首次免疫時間，d13、d15、d22、d25、d32為首次免疫後天數。時間軸上麵的形狀表示實驗的處理。紅圈代表血清采集。綠色箭頭為重組蛋白免疫。(B)小鼠第1次免疫後血清抗體效價。(C)第二次免疫後血清抗體效價。(D)第三次免疫後血清抗體效價。

第一次免疫後，4組血清IgG滴度均較低，差異無統計學意義。第二次增強使S1-His+AL和S1-Fc+AL組血清IgG滴度高於佐劑組和RBD組。S1-His+AL的IC50為1:1457,S1-Fc+AL的IC50為1:11 30。因此，S1-His的效率略高於S1-Fc。第三次免疫後，RBD+AL滴度增加。3個試驗組血清滴度均高於AL，說明RBD、S1-Fc和S1-His三劑佐劑均有免疫作用。這一結果與前人的研究一致，表明RBD和刺突蛋白具有成為疫苗靶點的潛力[4,7,9,15,26-27]。雖然在大多數COVID - 19患者的血清中發現了RBD的抗體，但由於RBD的單一結構域體積小，免疫反應差，不適合作為疫苗。IC50值為3^{理查德·道金斯}免疫血清RBD+AL、S1-His+AL和S1-Fc+AL分別為1:2064、1:35 518、1:6 67。S1-Fc免疫小鼠體況及免疫後小鼠病理切片如圖6所示。接種疫苗沒有顯著改變身體狀況，表明S1-Fc的安全性。

圖6:(A) S1-Fc免疫小鼠病理切片。切片包括肺、肝、腦、脾、腎和心，(B) (C) (D) (E)為不同濃度S1-Fc免疫小鼠的體重、攝食量、體溫和增重天數。每組6隻。

Pseudovirus中和

測定假病毒中和率，以評估血清是否能抵抗病毒入侵。在第一次假病毒中和試驗中，在三次免疫後測定血清。用30ul假病毒稀釋液混合20ul 30倍稀釋的血清作為樣品。陽性對照由30ul假病毒稀釋液和20ul PBS液組成。陰性對照為50ul DMEM。抑製率(%)=1-(樣本RLU平均-陰性RLU平均)/(陽性RLU平均-陰性RLU平均)。AL抑製率為-46%和-57%，表明AL RLU平均值高於陽性RLU平均值，導致陰性百分比(圖2)。

S1-Fc+AL組4隻。4隻S1- Fc+AL小鼠血清中和偽病毒的能力高於AL組。S1-Fc+AL的4隻小鼠血清對偽病毒的中和作用分別為20%、-24%、34%和96%(圖2)。S1-His免疫的4隻小鼠中，有3隻小鼠對偽病毒的中和作用高於其他小鼠，S1-His血清對偽病毒的中和作用分別為16%、60%、-7%和-109%，說明S1-His+AL的中和作用低於S1-Fc+AL, RBD +AL血清對偽病毒的中和作用分別為-3%和52%。因此，S1-Fc的中和效率優於S1-His和RBD。

為了了解佐劑是否影響血清中和作用，我們比較了血清(AL、S1-Fc和S1-Fc+AL)。結果表明，佐劑對免疫效果有影響(圖7)。S1-Fc +AL中和30%的假病毒，S1-Fc和AL分別中和-24%的假病毒。佐劑在S1-Fc功能中起著重要作用。

圖7:添加佐劑和不添加佐劑血清偽病毒中和試驗。S1-Fc為無佐劑血清，S1-Fc+AL為有佐劑血清。

然後進行了第二次小鼠免疫試驗，以檢測不同劑量對免疫效果的影響。各組分別按圖5A免疫，每劑免疫劑量分別為1ug、5ug、10ugS1-Fc。試驗樣品由30ul假病毒稀釋劑和20ul血清組成。陽性對照由30ul假病毒稀釋液和20ul AL促進組血清組成。陰性對照為50ul DMEM。抑製率(%)=1-(樣本RLU平均-陰性RLU平均)/(陽性RLU平均-陰性RLU平均)。結果如圖8所示。3次免疫後，5ug組偽病毒中和率分別為55%、46%、50%、100%、63%、72%，1ug組偽病毒中和率分別為45%、47%、28%、72%、69%、51%，10ug組偽病毒中和率分別為80%、80%、97%、48%、77%、50%。結果表明，隨著劑量的增加，血清的中和效果越好。3次免疫後，血清中和效果較好。

圖8:偽病毒中和2^nd免疫接種的試驗。假病毒稀釋液30μl, S1-Fc免疫小鼠血清20μl。陽性對照由30μl假病毒稀釋液和20μl AL促進組血清組成。陰性對照為50μl DMEM。A:從1^聖劑量的免疫接種。B:用2^nd劑量的免疫接種。C:被3^{理查德·道金斯}劑量的免疫接種。

討論

首先，我們比較了S1-His在HEK293T和HEK293F中的表達。選擇HEK293F作為表達重組蛋白的宿主細胞，是因為培養的HEK293F沒有附加的異源蛋白。經純化後，S1-Fc比HEK293F表達的S1-His純度更高。先前的研究表明HEK293細胞比CHO細胞產生更多的重組蛋白[28]。HEK293F可能是一種潛在的蛋白質生產細胞。現在，我們的蛋白質產量超過8mg/L。隨著工藝的優化，未來產量將會增加。由於預測功能性SARS-CoV-2 S1蛋白至少有16個n -糖基化[11,29]，因此選擇HEK293作為宿主細胞，該細胞可以提供更多的糖基化。

為了研究S1-His和S1-Fc的療效，我們進行了免疫和ACE2結合試驗。一般來說，3劑量的1- fc和佐劑可有效誘導小鼠產生中和性抗體。我們的研究與之前的研究一致，發現與Fc區融合的刺突蛋白[29]具有很好的免疫原性。在我們的研究中，我們初步比較了S1-Fc、S1-His和RBD的療效，然後比較了不同劑量S1-Fc的療效。刺突IgG融合蛋白對SARS-CoV-2的中和作用比S1-His和RBD更有效。優化了融合蛋白的表達序列，HEK293表達係統具有表達重組融合蛋白的巨大潛力。未來我們將進行病毒挑戰實驗，並報告實驗結果。

利益衝突

林大衛，霍普生物科技(蘇州)有限公司總裁。本研究由霍普生物醫學科技(蘇州)有限公司和霍普生物科技(蘇州)有限公司聯合資助。已經申請了一項S1-Fc疫苗專利。其餘作者聲明沒有競爭利益。

道德聲明

所有的小鼠研究都在Univ-bio LabEx™中進行，方案由內部委員會批準。隻選取健康狀況無可挑剔的動物進行試驗。所有動物程序均經KCI生物技術機構動物護理和使用委員會批準，並根據NIH實驗室動物護理和使用指南執行。所有的努力都是為了減少動物的數量，盡量減少動物的痛苦。本研究是按照arrival指南進行的。

參考文獻

1. 金東，李濟勇，楊建軍，金金偉，金vn等。(2020)SARS-CoV-2轉錄組結構。細胞181:914 - 921. - e10。［Ref。］
2. 王愛梅，趙銳，高麗娟，高曉峰，王德萍，等。(2020)SARS-CoV-2:結構、生物學和基於結構的治療方法的研究進展。前細胞感染微生物10:587269。［Ref。］
3. Naqvi AAT, Fatima K, Mohammad T, Fatima U, Singh IK，等(2020)對SARS-CoV-2基因組、結構、進化、發病機製和治療的洞察:結構基因組學方法。生物化學生物物理學報分子基礎雜誌1866:165878。［Ref。］
4. 楊軍，王偉，陳錚，陸鬆，楊峰等(2020)針對SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD的疫苗誘導保護性免疫。自然586:572 - 577。［Ref。］
5. 姚紅，宋勇，陳勇，吳楠，徐娟等。(2020)新型冠狀病毒的分子結構。細胞183:730 - 738. - e13。［Ref。］
6. 吳靜，袁旭，王波，顧銳，李偉，等。(2020)嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2:從基因結構到致病機製及潛在治療。前微生物學11:1 -13。［Ref。］
7. 戴琳，鄭濤，徐坤，韓燕，徐磊等。(2020)新型冠狀病毒、中東呼吸綜合征和非典型肺炎疫苗的通用設計。細胞182:722 - 733. - e11。［Ref。］
8. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N，等(2006)接種帶有流行和人畜共患病突變的重組sars冠狀病毒的衰老小鼠的疫苗效果。公共科學圖書館醫學3:e525。［Ref。］
9. Graham RL, Becker MM, Eckerle LD, Bolles M, Denison MR，等人(2012)一種活的、保真度受損的冠狀病毒疫苗在致命疾病的老年免疫缺陷小鼠模型中起保護作用。Nat Med: 1820-1826。［Ref。］
10. 王磊，項勇(2020)尖刺糖蛋白介導的SARS冠狀病毒進入。病毒12:1289。［Ref。］
11. Vankadari N, Wilce JA(2020)新出現的武漢(COVID-19)冠狀病毒:刺突糖蛋白的聚糖屏蔽和結構預測及其與人CD26的相互作用。新出現的微生物感染9,601 -604。［Ref。］
12. Brochot E, Demey B, Touzé A, Belouzard S, Dubuisson J等。(2020)SARSCoV- 2住院患者和無症狀患者的抗刺突抗體、抗核衣殼抗體和中和抗體。前微生物11:1-8。［Ref。］
13. Knoll MD, Wonodi C(2021)牛津-阿斯利康COVID-19疫苗的療效。《柳葉刀》397:72 - 74。［Ref。］
14. van Doremalen N, Lambe T, Spencer A, Belij-Rammerstorfer S, Purushotham JN等人(2020)接種ChAdOx1 nCoV-19疫苗可在河猴中預防SARS-CoV-2肺炎。bioRxiv [Ref。］
15. Corbett KS, Flynn B, Foulds KE, Francica JR, boyogu - barnum S，等(2020)非人類靈長類動物抗SARS-CoV-2 mRNA-1273疫苗的評價。中華醫學雜誌383:1544-1555。［Ref。］
16. Vogel AB, Kanevsky I, Che Y, Swanson KA, Muik A, et al.(2020)預融合SARS-CoV-2刺突RNA疫苗具有高度免疫原性，可防止非人類靈長類動物的肺部感染。bioRxiv 1-38。［Ref。］
17. Sakr MM, Elsayed NS, El-Housseiny GS (2021) SARSCoV- 2基因組表征、藥物和疫苗開發的最新進展;綜合生物信息學綜述。微生物病原體154:104809。［Ref。］
18. Carter PJ(2011)介紹當前和未來的蛋白質療法:蛋白質工程的視角。Exp Cell Res 317: 1261-1269。［Ref。］
19. Diamos AG, Pardhe MD, Sun H, Hunter JGL, Kilbourne J，等(2020)一種高表達、可溶性和穩定的植物合成IgG融合疫苗策略增強了無佐劑小鼠的抗原免疫原性。前麵Immunol 11:576012。［Ref。］
20. Roopenian DC, Akilesh S (2007) FcRn:新生兒Fc受體成年。自然評論免疫學7:715-725。［Ref。］
21. Zeitlin L, Pettitt J, Scully C, Bohorova N, Kim D，等(2011)埃博拉病毒免疫保護劑的無聚焦單克隆抗體的增強效力。鍋108:20690 - 20694。［Ref。］
22. Shimasaki N, Jain A, Campana D (2020) NK細胞用於癌症免疫治療。Nat Rev藥物發現19:200-218。［Ref。］
23. Czajkowsky DM, Hu J, Shao Z, Pleass RJ (2012) fc融合蛋白:新進展和未來展望。EMBO Mol Med 4: 1015-28。［Ref。］
24. Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, et al. (2020) Cell 181: 271-280。［Ref。］
25. Croset A, Delafosse L, Gaudry JP, Arod C, Glez L，等(2012)HEK和CHO細胞表達重組蛋白糖基化的差異。中國生物技術學報(自然科學版)61:336-348。［Ref。］
26. 邰偉，張旭，蒲娟，Voronin D，蔣鬆等(2020)2019年新型冠狀病毒受體結合結構域(RBD)的表征:對RBD蛋白作為病毒附著抑製劑和疫苗開發的意義。細胞分子免疫17:613-620。［Ref。］
27. Grifoni A, Weiskopf D, Ramirez SI, Mateus J, Dan JM，等(2020)COVID-19患者和未接觸個體對SARS-CoV-2冠狀病毒T細胞應答的靶點。181號房:1489- 1501。［Ref。］
28. Kim CL, Ha TW, Lee GM(2016)氯化鋰組合處理可提高瞬時轉染CHO和HEK293E細胞的重組抗體生成。生物技術生物技術e21: 667- 675。［Ref。］
29. 任偉，孫浩，高廣發，陳傑，孫鬆，等。(2020)重組SARSCoV- 2 spike S1-Fc融合蛋白在非人靈長類動物中誘導高水平的中和反應。疫苗38:5653 - 5658。［Ref。］

在此下載臨時PDF

條信息

文章類型:研究文章

引用:解誌偉，林依桐，孫文華，楊文傑，張誌勇，等。(2022)一種靶向S蛋白S1的新疫苗誘導小鼠COVID-19免疫應答。國際J疫苗免疫6(1):dx.doi.org/10.16966/2470-9948.128

版權:©2022傑ZW等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2022年2月10 (

接受日期:2022年2月28日(

發表日期:09年3月,2022年