摘要

本文研究了宿主細胞成分及其抑製劑在疫苗和血液製劑中的存在，以及胰蛋白酶樣蛋白酶及其抑製劑在疫苗和血液製劑中的存在。研究發現，流感病毒疫苗(流感疫苗、瓦西格裏普疫苗、流感疫苗)、皰疹疫苗和兔熱病疫苗中含有大量胰蛋白酶樣蛋白酶抑製劑。商業性的獻血者血液製劑(免疫球蛋白、幹擾素、速凝素和梭色寧)既含有胰蛋白酶樣蛋白酶及其抑製劑。免疫球蛋白中抑製劑的含量是幹擾素的4.0倍。因此，用於治療的現代疫苗純度不夠，在治療時應考慮到流感病毒與細胞成分(酶和抑製劑)的相互作用。

關鍵字

Trypsin-like蛋白酶;抑製劑;疫苗;血液免疫生物製劑

簡介

如今，疫苗在預防流感和其他病毒感染方麵起著主導作用。周期性流感大流行(1957年和1959年、1968- 69年、1977-78年、2009-2010年)在9-10個月內覆蓋了全球30%的人口。根據烏克蘭衛生部的數據，在1998- 1999年的一個流行季節，烏克蘭7%的人口患有流感。2009-2010年，在流感大流行期間，500多萬人請求醫療援助，1127人死亡，其中100人是孕婦。流感影響了不同年齡和國籍的男人、婦女和兒童。對流行病進展情況的分析揭示了人口年齡組的變化。基本上，能夠工作的人(20到50歲)都生病了。

2012年，23366人感染流感，3969377人感染SARS。高峰出現在2012年3月至4月，最高發病率記錄在3月-15819例。感染流感的人口中最多的是兒童——144666例。兒童是SARS-4624437例患者的基本組成部分。就領土而言，烏克蘭北部和東部地區(切爾尼戈夫和頓涅茨克)的人口受流感影響最大。SARS病死率最高的地區是東部地區(頓涅茨克和第聶伯彼得羅夫斯克)和基輔。

2013年，流感和非典型肺炎共發生6134755人，其中233500人患流感。2908人發現經實驗室證實的流感病例。18人(其中1名兒童)死亡。錄得SARS病例5901275人，其中兒童3866280人。峰值出現在2013年2月[2]。

在2015-2016流行病學季，流感發病率上升，流感是由甲型H1N1病毒引起的，結果證明具有攻擊性，並觀察到大量嚴重並發症(病毒性肺炎)。疫情從烏克蘭南部地區(敖德薩地區)開始，擴散到全國所有地區。截至2016年2月9日，烏克蘭有300多名處於工作年齡的人死於流感並發症。

感染傳播的空投機製、高易感性、存在相當比例的被消滅的疾病和最短的潛伏期，導致發病率的急性“爆炸式”增長。在這種情況下，非特定的衛生防疫措施(使用流感口罩、為房屋通風、讓學童離校等)不能阻止流感的流行，而且效率有限。為了預防流感疾病，反複嚐試使用各種化學預防和免疫調節藥物。然而，這種藥物每天反複服用的必要性、副作用和短期預防作用鼓勵了全世界的科學家繼續尋找更有效的預防流感的方法。自上世紀30年代下半葉以來，研製有效流感疫苗的基礎性工作始於積極免疫作為長期預防行動的一種方法。

現在，通過接種疫苗來預防流感是傳統的，並且得到了世界各地專家的支持。世衛組織建議，接種疫苗是預防流感的一種獨特的強製性措施，以及它對流感高危人群發生並發症和死亡的後果[3,4]。

高風險人群(不同國家差異較小)包括:

• 所有60歲以上人士[5-10]
• 孤兒院的兒童和寄宿者[9,11]
• 3歲以上兒童[10]
• 患有呼吸和心血管係統慢性疾病的兒童和成人，患有支氣管哮喘、糖尿病、風濕病等慢性疾病[9,12,13]
• 所有HIV檢測呈陽性的人和醫源性免疫缺陷的人[13-15]
• 孕婦

高危人群通常約占總人口的20%，其中接種疫苗的人數從荷蘭、法國、比利時和西班牙的80%到瑞士和英國的30%不等[16]。

在所有高危人群中都建議接種疫苗，這有可能從根本上降低與流感相關的並發症數量和死亡率。然而，需要注意的是，疫苗接種的效率是可變的，在高齡人群中，它可以低於50%。科學家們不斷研究疫苗接種的新方法，渴望提高疫苗接種的效率。在以往製備流感病毒製備多價流感疫苗的研究中，通過蔗糖密度梯度高速離心法和聚丙烯酰胺凝膠電泳純化濃縮流感病毒，確定流感病毒不從胰蛋白酶樣蛋白酶中釋放[3,17]。

本研究的目的是檢查流感疫苗和其他疫苗以及國內外生產的免疫生物血液製劑中是否存在胰蛋白酶樣蛋白酶及其抑製劑。

材料和方法

本文使用了下列商業製劑:"人白細胞幹擾素"、"人胎盤免疫球蛋白"、供體10% (Biofarma，基輔)、淋球菌疫苗(Biolec，哈爾科夫)皰疹疫苗(敖德薩細菌製劑敖德薩工廠)、2002/2003季流感預防疫苗" Influvac "，其中包括流感病毒株的血凝素和神經氨酸苷酶:А/莫斯科/10/99 H3N2)、А/新喀裏多尼亞/20/99 (H/N)、B/香港/330/2001(荷蘭Solvay製藥公司)、“Fluarix”(由(H1N1) A/新喀裏多尼亞(H3N2)株的血凝素組成)、А/巴拿馬和В/Shandont 17/97 (Smith Klein Beecham Biologicals，比利時)和“Vaxigrip”(由三株流感病毒組成)、甲型肝炎疫苗“Avaxim”(法國Pasteur Merier Connot，法國)，肝素(抗xa因子)血液製劑-“快速parine”(賽諾菲- Сhinoin，法國)，用於血液透析的小牛血液製劑“Solcoseryl”(Solco，瑞士)。這些製劑在保質期屆滿前進行了研究。所有的製劑都在敖德薩的藥店購買。

用A. Levitsky的方法測定了我們修飾[4]中tripsin -like蛋白酶及其抑製劑的活性，用O. Lowry的方法測定了總蛋白[18]的活性。

結果與討論

如圖1所示的研究結果表明，在所有研究過的商業製劑(人免疫球蛋白、白細胞幹擾素、國家工業生產的皰疹疫苗、淋病疫苗和兔熱病疫苗)中，都在幹擾素、免疫球蛋白和皰疹疫苗中發現了胰蛋白酶樣蛋白酶的存在。在豬流感疫苗和淋病疫苗中，未發現胰樣蛋白酶。因此，抑製劑和胰蛋白酶樣蛋白酶的存在並不是所有血液製劑中必需的，它們的存在是抗病毒疫苗和製劑所特有的。

圖1:供血商業製劑中胰蛋白酶樣蛋白酶活性和蛋白消退。
注:1免疫球蛋白;2 -幹擾素;3 -皰疹疫苗;4 - Gonovaccine;5 - Tularemic疫苗

在人胎盤免疫球蛋白、白細胞幹擾素和皰疹疫苗中發現了胰蛋白酶樣蛋白酶及其抑製劑(圖2)的存在。胰蛋白酶樣蛋白酶抑製劑活性最高的是人胎盤免疫球蛋白(60,185 c.u.)。胰蛋白酶樣蛋白酶抑製劑也在幹擾素(15,79 c.u)和皰疹疫苗(19,750 c.u)中被發現。Tularemia疫苗隻含有胰蛋白酶樣蛋白酶抑製劑活性(0,544 c.u.)(圖2)。在淋病疫苗中，既沒有發現抑製劑，也沒有發現蛋白水解活性。因此，免疫球蛋白製劑具有最高的抑製劑活性，抗菌疫苗的製備伴隨著其降低。

圖2:從獻血者血液中獲得的商業製劑中胰蛋白酶樣蛋白酶抑製劑和蛋白質消滅物的活性。
注:1免疫球蛋白;2 -幹擾素;3 -皰疹疫苗;4 - Gonovaccine;5 - Tularemic疫苗

在免疫球蛋白中，胰蛋白酶樣蛋白酶抑製劑的活性是幹擾素的4.0倍。

一方麵，已有的事實證明了供血製劑的蛋白質汙染和工業生產的γ -球蛋白純度不足。另一方麵，胰蛋白酶類蛋白酶的蛋白水解活性和胰蛋白酶類蛋白酶抑製劑活性的測定可以作為製劑純度的標誌。可以假設係統蛋白酶/抑製劑在某種程度上與抗體有功能聯係。

因此，與我們認為對許多嚴重傳染病產生部分保護作用的其他製劑相比，商用免疫球蛋白製劑含有胰蛋白酶樣蛋白酶抑製劑的活性最高。另一方麵，那些來自免疫球蛋白的血液組分可以被認為是抑製劑的來源。

我們的研究結果允許我們假設，顯然，國家製劑沒有充分純化蛋白質。

國外公司的製劑中也含有一種抑製劑和胰蛋白酶樣蛋白酶。其中一種抑製劑的含量在250倍以上超過了蛋白酶的含量(表1)。在抗流感疫苗“流感”(180,86 g/l)中，抑製劑的含量最大，在一種製劑中，“快速parine”(111,30 g/l)略少。“Avaxim”(肝炎滅活疫苗)製劑中含有最少數量的胰蛋白酶樣抑製劑蛋白酶。

表1:在國外公司生產的商品免疫生物製劑中存在蛋白酶及其抑製劑(n=3)

從這三種抗流感疫苗中，我們可以認為“Vaxigrip”的效率最高，因為它含有最少數量的胰蛋白酶樣蛋白酶和相當數量的抑製劑，在我們看來，影響機體保護性的形成，而蛋白酶可以促進病毒感染的發展。

“流感疫苗”在這些指標中排名最後，因為它含有最多的胰蛋白酶樣蛋白酶。然而，在I. Chaloupka和同事[19,20]。這種疫苗具有卵白蛋白的高度維持性，在常用的疫苗中產生的效果最好[10,12]。

" Avaxim "(肝炎疫苗)由甲型肝炎病毒GBМ株(160抗原單位)組成，與其他疫苗相比，它含有最少數量的抑製劑和蛋白酶。

血液製劑“速速parine”由碎片元素糖胺聚糖和肝素(9500 МЕ)組成。活性物質是nadroparin鈣——在特殊條件下通過解聚的方法從標準肝素中獲得的低分子肝素。在我們的數據中，“速速parine”含有大量胰蛋白酶樣蛋白酶和極少量蛋白酶的抑製劑。根據說明書，它的特征是與Ha因子有關的表達活性。J. Nagai和同事[21]認為Ha因子將流感病毒的血凝素分裂在精氨酸的唯一一個片段上，在兩個亞基上——НА1和НА2。病毒激活蛋白酶與Ha因子不僅在結構上相似，而且在功能上也相似。在勃林格曼海姆生物化學的分類中，Ha的因子與絲氨酸蛋白酶有關。因此，“速凝素”可能被認為是一種類似胰蛋白酶的抑製劑。

“Solkoseryl”由去蛋白質的小牛血提取物和含有廣泛的天然低分子物質。根據我們的資料，“Solkoseryl”含有大量的抑製劑，少量的蛋白酶和大量的一般蛋白。

從以上所述出發，可以得出這樣的結論:外來製劑不能100%清除雜質，或者不可能從細胞成分中分離病毒蛋白。病毒蛋白質與細胞成分密切相關，因此有必要研究流感病毒的結構，考慮到它與細胞酶及其抑製劑的相互作用。

結論

• 國內商業製劑(人免疫球蛋白、人幹擾素、皰疹疫苗)含有胰蛋白酶樣蛋白酶及其抑製劑。tularemic疫苗不含胰蛋白酶樣蛋白酶，隻有微量的抑製劑。淋病疫苗，不含胰蛋白酶樣蛋白酶，無其抑製劑。
• 國外的抗流感疫苗(" Fluarix "、" Vaxigrip "、" Fluarix ")和血液製劑("快速parine "和" Solkoseryl ")含有相當數量的胰蛋白酶樣蛋白酶抑製劑。

測定商業製劑生產過程中的蛋白酶和抑製活性，可作為製劑潔淨度質量的標誌。

參考文獻

1. Hendon YZ, Markushin ST, Akopova II(2003)建立感冒改編流感病毒活疫苗重組培養。vor病毒2:12-17。
2. Divocha VA(2014)流感病毒和SARS發病率的趨勢//SES。保存醫學1:36 -38。
3. Divocha VA(2003)用離心純化流感病毒的蛋白水解活性研究。敖德薩醫學J 1:16 -19。
4. Divocha VA(1998)一種生產胰蛋白酶類蛋白酶抑製劑的方法/專利23548 А烏克蘭，МПК6 А 61 К 35/00。
5. 德Bruijn IA, Nauta J, Cramer WC, Gerez L, Palache AM(2005)滅活病毒體流感疫苗的臨床經驗。疫苗23:39-49。［Ref。］
6. de Jong JC, Palache AM, Beyer WE, Rimmelzwaan GF, Boon AC，等(2003)流感病毒血凝抑製抗體。生物技術學報(巴塞爾)115:63-73。［Ref。］
7. Heckler R, Baillot A, Engelmann H, Neumeier E, Windorfer A(2007)接種裂解疫苗後對甲型和乙型流感同源漂移變異的交叉保護。Intervirology 50: 58 - 62。［Ref。］
8. Huckriede A, Bungener L, Stegmann T, Daemen T, Medema J，等(2005)流感疫苗的病毒體概念。疫苗23:26-38。［Ref。］
9. ishak I, Mahayiddin AA, Ismail R(2007)流感疫苗在預防老年人流感樣疾病中的有效性。東南亞熱帶醫學公共衛生雜誌38:841-648。［Ref。］
10. 朱芳芳，周偉，潘宏，陸林，Gerez L，等(2008)兩種亞單位流感疫苗在健康兒童、成人和老年人中的安全性和免疫原性:中國疫苗26:4579-4584的隨機對照試驗。［Ref。］
11. Schmidt-Ott R, Schwarz T, Haase R, Sander H, Walther U，等(2007)一種三價流感裂解疫苗對6-9歲和10-13歲未接種疫苗兒童的免疫原性和反應原性。疫苗26:32-40。［Ref。］
12. Jahnz-Rózyk K, Brydak LB, Targowski T, machaka M, Plusa T(2004)流感疫苗接種對過敏性支氣管哮喘患者免疫應答和血清eotaxin水平的影響。炎症調節因子13:195-199。［Ref。］
13. Stojanovich L(2006)係統性紅斑狼瘡(SLE)和類風濕性關節炎(RA)患者的流感疫苗接種。臨床發展免疫學雜誌13:373-375。［Ref。］
14. Durando P, Fenoglio D, Boschini A, Ansaldi F, Icardi G，等(2008)兩種流感病毒亞單位疫苗(含或不含MF59佐劑)接種於1型人類免疫缺陷病毒血清陽性和血清陰性成人的安全性和免疫原性。臨床疫苗免疫15:253-259。［Ref。］
15. Magnani G, Falchetti E, Pollini G, Reggiani LB, Grigioni F，等(2005)兩種流感疫苗在心髒移植受者中的安全性和有效性:一項前瞻性蛋白酶對照研究。《心肺移植雜誌》24:588-592。［Ref。］
16. Das Gupta R, Guest JF(2002)英國流感職業疫苗接種計劃的成本效益評估模型。藥物經濟學20:475 - 484。［Ref。］
17. Divocha VА(1996)流感疫苗中的蛋白水解酶。現代藥學在醫療實踐中的成就。哈爾科夫96 - 97。
18. Lowry OH, Rosenbrough NY, Farr AL, Randai RY(1951)用Folin苯酚試劑測定蛋白質。中國生物化學雜誌(英文版)［Ref。］
19. Rudenko AA, Vovk AA, Bobrova IА (2000) Cycloferon治療感染性疾病:方法推薦。基輔24。
20. Chaloupka I, Schuler A, Marschall M, Meier-Ewert H(1996)歐洲6種流感疫苗的比較分析。中華臨床微生物感染雜誌15:121-127。［Ref。］
21. Gotoh B, Ogasawara T, Toyoda T, Inocencio NM, Hamaguchi M，等(1990)雞胚病毒趨向性的決定因素與血衣因子X同源的內源性蛋白酶。EMBO 5: 4189 - 4195。［Ref。］

在此下載臨時PDF

條信息

文章類型:研究文章

引用:Divocha VA(2016)疫苗和免疫生物血液製劑中所有者細胞成分的存在。國際J疫苗免疫2(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470- 9948.112

版權:©2016 Divocha VA.這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、發布和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2016年4月12日

接受日期:2016年5月09

發表日期:2016年5月13日