摘要

背景:本研究旨在探討血紅蛋白E或A基因型患者血清中總免疫球蛋白G的含量與抗感染能力的關係惡性瘧原蟲．

方法:這是一項為期5個月的對越南人血清的前瞻性研究。

血清來自於2002年對研究對象進行靜脈穿刺采集的全血。收集的每個患者的血液被離心，獲得的血清被混合到冷凍管中，在20°C保存，用於免疫研究(IgG檢測)。為了最大化ELISA檢測的靈敏度，我們用戊二醛和高度聚合的聚l -賴氨酸作為樹脂偶聯抗原肽。酶解反應在加入底物後在黑暗中進行30分鍾，然後使用波長為405 nm的分光光度計(Opsys MR Dynex®Technology)讀取結果。

結果:共采集了來自35個家庭的182份血液樣本。在采樣時，所有受試者均無瘧疾臨床症狀。年齡分布為3 ~ 79歲;性別比(M/F)為1.6。血紅蛋白占血紅蛋白AA攜帶者的42%，血紅蛋白EA和EA攜帶者的58%。惡性瘧原蟲抗原肽(MSP-1、MSP- 2和SR-11.1)特異性總IgG在不同年齡組呈年齡依賴性分布。在3-19歲的受試者中，特異性總IgG滴度惡性瘧原蟲低於20多年來的水平。惡性瘧原蟲抗原多肽MSP-1、MSP-2和SR-11.1特異性IgG在各年齡組的比較，MSP-1的平均值顯著高於SR-11.1和MSP-2 (Khi2=4.12)。血紅蛋白E攜帶者抗惡性瘧原蟲抗原多肽總IgG的陽性率高於血紅蛋白a攜帶者(p=0.004)。

結論:我們發現，與AA基因型相比，20歲以上血紅蛋白E基因型患者的特異性總Ig G對瘧原蟲抗原(MSP-1、MSP-2和SR-11.1)的反應有所改善。在20歲以下的受試者中，不同組間血紅蛋白無顯著差異。MSP-2和MSP-1在不同年齡組的免疫原性明顯高於SR11.1。

關鍵字

血紅蛋白E;MSP1;MSP2;SR11.1;ELISA;免疫球蛋白

簡介

在西非，研究表明，在長期接觸密集傳播後;它逐漸發展出一種非殺菌的免疫力惡性瘧原蟲．此外，在這些流行地區，一些人似乎自然地免受臨床瘧疾和/或嚴重形式瘧疾[1]的感染。在小鼠模型中已明確證明遺傳因素控製瘧原蟲感染[2,3]，這暗示了瘧疾臨床感染耐藥性的基因控製。研究已經清楚地證明了異常血紅蛋白在抵抗瘧疾攻擊中的作用。在這種耐藥性中，由於甘氨酸β鏈(6 β:穀氨酸→纈氨酸)的改變而導致的鐮狀細胞性狀(Hb AS)是研究最多的紅細胞遺傳異常[4-6]。由此可見，易感性惡性瘧原蟲S型或C型血紅蛋白攜帶者感染和瘧疾發作的頻率較低[7-9]。然而，這種阻力的中介機製尚不清楚。

提示對血紅蛋白病的保護作用可能部分是由於抑製惡性瘧原蟲S寄生紅細胞增加[10,11]，從而可能誘導這些血紅蛋白病[4]攜帶者的免疫球蛋白G反應的調節。

最近的一項保護惡性瘧原蟲攜帶血紅蛋白C和S的機製表明，它與感染鐮狀細胞C或S[6]表麵的抗原暴露PfEMP1異常有關。其他免疫流行病學研究也表明，對瘧疾的保護至少部分是由抗體[12]引起的，在Hb AS/SS/SC對抗AA的情況下，高滴度的Ig G直接針對瘧疾抗原[9,13,14]。因此，[15,16]表明嗜細胞性抗體(IgG1和IgG3)可預防惡性瘧原蟲通過FcgRIIA激活效應細胞，而IgG4和IgG2阻斷保護機製。移植HbS、IgG3對MSP-2的反應可能影響IgG2標題的減少。

另一種血紅蛋白E(純合子或雜合子)是由於β -珠蛋白鏈第26個氨基酸段的賴氨酸被穀氨酸取代而引起的，在東南亞很常見，並被描述為對紅細胞增殖產生抵抗力惡性瘧原蟲而且間日瘧原蟲(10、17)。Chotivanich等人[18]表明，患者攜帶的血紅蛋白E中寄生蟲密度較低，這可以保護患者免受瘧疾嚴重症狀的影響。很少有研究表明血紅蛋白E參與調節對不同階段不同表麵抗原的免疫反應惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲．

已有數據表明，血紅蛋白E在嚴重瘧疾病例和簡單瘧疾患者的耐藥性中所起的作用。本研究的目的是建立血紅蛋白E或A基因型受試者血清中總免疫球蛋白G的含量與抗感染能力之間的關係惡性瘧原蟲．

方法

病人

這是一項為期5個月的前瞻性研究，研究對象是居住在廣治省XaTanh公社的3-79歲越南人的血清。該研究在馬賽蒂莫內藥學院進行:md3混合研究單元(宿主-寄生蟲關係和免疫遺傳學藥物治療)。

我們的血清來自於2002年通過靜脈穿刺收集的全血。收集的每個患者的血液被離心，獲得的血清被混合到冷凍管中，在20°C保存，用於免疫研究(IgG檢測)。選擇Xa Thanh鎮是合理的，因為該地區瘧疾發病率高，血紅蛋白病E在該地區發病率高。

實驗室檢測:肽與戊二醛偶聯後ELISA檢測

合成肽在ELISA板上直接增敏通常是低效的，高度依賴於它們的大小和電荷。為了最大化我們測試的靈敏度，我們使用戊二醛和高度聚合的聚l -賴氨酸作為樹脂來偶聯抗原肽。

原則:聚l -賴氨酸通過暴露具有反應功能的側鏈CHO戊二醛的NH3+基團，被塗在起錨作用的板上。然後用化學反應後形成的共價鍵將偶聯劑固定在板上。戊二醛的第二醛基功能和一個初級氨基(NH3+末端或側位)之間的第二個反應允許血漿抗原(MSP-1, MSP-2和SR-11.1)共價附著在聚l -賴氨酸上，從而更好地附著在ELISA板上。甘氨酸的氨基功能被用來阻斷醛基功能。我們使用了以下協議:

聚l -賴氨酸在4℃下包覆於板上過夜(40µg/ml，碳酸酯緩衝液pH=9.6)， 100µl/孔。用PBS 1X衝洗三次，然後用1%的戊二醛稀釋PBS 1X緩衝液100 μ l/孔室溫孵育30分鍾。然後洗滌三次，在孔中加入抗原肽溶液(10µg/ml稀釋在PBS 1X緩衝液中)(100µl/孔)。在室溫下孵育一夜，洗滌三次，然後用1 M甘氨酸(PBS 1X, 200 μ l/孔)在室溫下阻斷自由反應官能團1小時。最後，用PBS-3%牛奶洗滌並飽和(室溫2小時，250 μ l/孔)。然後我們遵循以下步驟:

在培養皿飽和後的每個階段，在0.05%的PBS吐溫中洗滌三次，每孔200 μ l。

含有待測特異性抗體的樣品在PBS 1X中稀釋1/20，用於測定特異性總IgG。

對於每個平板，標準包括使用非洲受試者血漿池作為陽性對照。陰性對照是用歐洲人未接觸的自體等離子體建立的惡性瘧原蟲以及用PBS 1X稀釋緩衝液取代血漿的“白色”。標準是在1 / 2的稀釋範圍內製定的。

將稀釋後的血漿(1:20)按100µl/孔沉積，室溫孵育2 h。

然後在培養皿上塗上山羊的抗人免疫球蛋白G，這是一種與堿性磷酸酶偶聯的二抗(根據製造商的建議，在PBS 1X中稀釋1/3000)^®) 100 μ l /孔，室溫孵育2 h，攪拌。

通過沉積酶的底物堿性磷酸酶，對硝基苯磷酸(pNPP)，以200 μ l /孔的速率臨時製備。酶解反應在加入底物後在黑暗中進行30分鍾，然後使用波長為405 nm的分光光度計(OpsysMRDynex®Technology)讀取結果。

數據統計分析

數據的處理和分析使用Excel 2007軟件進行表格和圖表。

在所有吸光度值處，都用“白色”的吸光度減去。

為了比較不同過程中得到的值，我們對正池的值進行了標準化。然後對每個血清的光密度進行校正。

樣品滴定使用的是從生活在流行地區的非洲人的血清池中獲得的範圍。使用了以下稀釋因子:20;50;100;200年和400年。1/400稀釋的吸光度值與10 AU/ml相關。從該範圍得到的趨勢線的方程允許我們計算每個吸光度的等效單位為AU/ml(圖1-3)。

圖1:從MSP-2範圍內得到趨勢線方程

圖2:從SR-11.1範圍內得到趨勢線方程

圖3:從MSP-1範圍內得到趨勢線方程

用於比較平均數和比例的檢驗是卡方檢驗和Fisher, Kruskal Wallis檢驗。P值<0.05有統計學意義。

結果

研究人群和研究區域的特征

血液樣本采集於黃化區Xa Thanh鎮。這個小鎮位於一個高於海平麵的地區，沿著Sêpon河形成了老撾和越南的邊界。全社占地1200公頃，轄9個小村。上一次人口普查的人口有2203名居民和382個家庭。所有的居民都屬於Bru-Vân Kiêu民族。他們主要是農民和牧民。這些家庭平均有4.8個孩子，受教育程度仍然很低。Bru Van Kiêu實行間歇性種植，每年使用遠離永久房屋的燃燒區。他們經常在森林裏過夜。它們的棲息地大多是傳統的; with the kitchen in the middle of the house (net use is limited due to fire fears). The people have very close relations with Laos and make frequent visits to Laos.

黃化區是瘧疾高發地區。已發現按蚊30餘種(全省共31種)。兩種主要的傳播媒介是一個。最小的東西而且一個。Dirus．該省的大部分捕撈是在Huong Hoa區進行的(88%一個。最小的東西和95%的一個。Dirus)．瘧疾病例在雨季(6月至9月)特別多。1997年至2001年在Xa Thanh公社藥房收集的數據表明，在2203人的人口中，平均每年發生125例瘧疾病例，每年的變化從72例到194例不等。60%的瘧疾病例被觀察了4個月，從6月到9月。惡性瘧原蟲感染(98%)和惡性瘧原蟲感染(98%)。間日瘧原蟲(2%)。共采集了來自35個家庭的182份血液樣本。在采樣時，所有受試者均無瘧疾臨床症狀。年齡分布為3 ~ 79歲;性別比(M/F)為1.6。

受試者按血紅蛋白類型和年齡分布

我們把人們分成四個年齡組:0-10歲的兒童、11-19歲的青少年、20-31歲的年輕人和32歲以上的成年人。在每個年齡組中，個體AA和AE的比例是相似的。用電泳法測定了受試者的血紅蛋白表型。血紅蛋白占血紅蛋白AA攜帶者的42%，血紅蛋白EA和EA攜帶者的58%。

不同年齡的總免疫球蛋白G率

在我們的不同年齡組中，抗抗原肽(MSP-1, MSP-2和SR-11.1)的特異性總IgG惡性瘧原蟲顯示年齡相關的分布。在3-19歲的受試者中，特異性總IgG滴度惡性瘧原蟲低於20多年來的水平。惡性瘧原蟲抗原肽MSP-1、MSP-2和SR-11.1特異性IgG在各年齡組的比較，MSP-1的平均值顯著高於SR-11.1和MSP-2 (chi2=4.12)(圖4)。

圖4:年齡和血紅蛋白對抗msp - 1總IgG率的影響

血紅蛋白對3 ~ 19歲患者特異性總IgG率的影響

20歲以下的人由106人組成，平均年齡為11.7歲。血紅蛋白在血紅蛋白AA攜帶者中分布為41/106(39%)，在血紅蛋白AE攜帶者中分布為(47/106)44.3%，在血紅蛋白EE攜帶者中分布為(16/106)15.1%。在瘧疾流行地區，接觸抗原的受試者需要獲得性免疫，這取決於傳播水平。我們觀察了抗惡性瘧原蟲P抗原(如MSP-1)的特異性總IgG的陽性率;各組血紅蛋白中獲得的MSP-2和SR-11.1差異無統計學意義(p=0.07)(圖4-6)。

圖5:年齡和血紅蛋白對抗msp - 2總IgG水平的影響

圖6:年齡和血紅蛋白對抗sr -11.1總IgG率的影響

20多年血紅蛋白對特異IgG的影響

該年齡組血紅蛋白組間特異性總IgG陽性率差異有統計學意義。因此，攜帶血紅蛋白E的受試者抗抗原肽的總IgG比率高於血紅蛋白A(圖4-6)。差異顯著(p=0.004)。因此，在年齡大於20歲的血紅蛋白E攜帶者中，特異性總IgG的獲得有所不同。

討論

在我們的研究中，我們觀察到血紅蛋白E的比率為(58%)。這些結果高於Fucharoen G等人在泰國(50%)和Flatz等人在老撾(43%)發現的結果。

盡管如此，我們的數據證實了血紅蛋白病E在亞洲的強烈代表性及其與瘧疾當前分布的一致性。血紅蛋白S分布在撒哈拉以南非洲、赤道帶、中東和印度部分地區。血紅蛋白C在非洲西北部很常見，它的分布與血紅蛋白s的分布一致。它們在亞洲是不存在的。

我們還觀察到，在年齡組中特異性IgG抗MSP-1水平的比率明顯高於SR-11.1和MSP-2水平。我們注意到，在我們的研究中，對三個多肽MSP-1, MSP-2和SR-11.1的特異性抗體的識別率很低。

這些抗原特異性抗體的低滴度使得很難評估不同血紅蛋白組之間的明確關係。這一結果可以用對多種寄生蟲抗原的反應選擇的可變性來解釋。這也可以解釋為，IgG2(和IgG4)被認為是非嗜細胞性抗體，能夠通過阻止嗜細胞性抗體識別抗原來阻斷保護機製[22,23]。

我們使用的三種抗原肽，MSP-1和MSP-2比SR-11.1具有更強的免疫原性。

在我們的研究中，在少於20年的受試者中，血紅蛋白組特異性總IgG滴度之間沒有發現顯著差異。Ntoumi等人在2005年對患有血紅蛋白AS的加蓬兒童進行了[15]檢測，結果顯示抗體滴度不同。這可以用紅細胞入侵的複雜途徑來解釋惡性瘧原蟲增加了抗MSP-1和MSP-2的嗜細胞IgG滴度。

我們的研究結果可以用以下事實來解釋:在瘧疾流行地區，年輕人所需的抗瘧疾免疫的獲得取決於傳播水平，並且與年齡有關[24,25]。在我們的人群中，20歲以下的受試者還沒有達到特異性IgG的峰值最大值。

在20歲以上年齡組中，血紅蛋白E攜帶者的抗原肽特異性總IgG水平(MSP-1、MSP-2和SR-11.1)高於血紅蛋白AA攜帶者。這種差異是顯著的。Verra等人在布基納法索也做了同樣的研究。[26]。結果表明，當受試者為血紅蛋白S或C攜帶者時，抗瘧疾抗原(MSP-1、MSP-2、MSP-3、EBA-175和AMA-1)的特異性總IgG水平較高。

這些結果表明，血紅蛋白E攜帶者具有較好的特異性總IgG MSP-1的產生能力;MSP-2和SR-11表位與正常血紅蛋白AA攜帶者比較。惡性瘧原蟲基因型的多樣性可能有助於增加惡性瘧原蟲的識別庫，從而加速獲得對瘧原蟲的保護性免疫。

結論

我們的結果分析表明，越南血紅蛋白病的發生率(58%)較高。我們已經發現，與AA基因型相比，20歲以上血紅蛋白E基因型患者的特異性總IgG對瘧原蟲抗原(MSP-1, MSP-2和SR-11.1)的反應有所改善。在20歲以下的受試者中，不同組間血紅蛋白無顯著差異。在不同年齡組中，即使對MSP-2和MSP-1的IgG陽性率較低，也比SR11.1具有更高的免疫原性。

作者的貢獻

構思和設計實驗:SY TY FF。完成實驗:SY TY FF。貢獻試劑/材料/分析工具:SY TY FF。SI BW撰寫論文:SY FF TY SI SG。

的利益衝突

我們聲明我們之間沒有利益衝突。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Sourabié Y, Bazié WW, Sangaré I, Sanou G, Fumoux F，等(2016)異常血紅蛋白EA或EE攜帶者瘧疾感染的免疫學分析。國際J疫苗免疫2(2):doi: http://dx.doi.org/10.16966/2470-9948.110

版權:©2016 Sourabié Y，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2015年11月02

接受日期:2016年04月01

發表日期:2016年04月04