摘要

牛皰疹病毒1型(bohev -1)可引起牛呼吸道感染和流產，是牛呼吸道疾病複合物(BRDC)的重要組成部分。bohev -1也已從患有呼吸係統疾病的羊身上分離出來。實驗中，綿羊和山羊經鼻內接種BoHV-1後，產生對BoHV-1的免疫應答。我們已經設計了一種三基因突變的牛皰疹病毒1型(bohev -1 tmv)疫苗病毒，它對犢牛的bohev -1具有保護作用。在本研究中，我們檢測了鼻內接種後羔羊的bohev -1型tmv傳染性和血清中和抗體滴度。結果表明，BoHV-1型tmv在鼻黏膜中複製良好，滴度適中，感染羔羊產生血清中和滴度。

關鍵字

牛皰疹病毒1型;三重基因突變;羊;鼻內接種疫苗

簡介

牛是牛皰疹病毒1型(BoHV-1)的天然宿主，然而羊和其他小型反芻動物可以感染BoHV-1型。在牛中，bohev -1會導致嚴重的呼吸道感染，即傳染性牛鼻氣管炎(IBR)，並導致懷孕牛流產。此外，bohev -1是牛呼吸疾病複合物(BRDC)的重要組成部分，也被稱為“運輸熱”[1-5]。在綿羊中，bohev -1感染可能不會引起臨床顯著疾病;然而，它可能引起中度的漿液性膿性鼻分泌物。我們最近開發的三突變株bohev -1具有作為疫苗載體病毒的巨大希望。在世界各地很重要的幾種綿羊病毒性疾病，如裂穀熱、藍舌病和邊境病，缺乏有效的疫苗。使用bohev -1三突變株的病媒疫苗可能是治療這些疾病的可行方法。在牛中，野生型bohev -1逃避了細胞免疫反應並避免宿主細胞毒性CD8+ T細胞識別，因為包膜蛋白UL49.5暫時性下調了主要組織相容性複合體(MHC) I類分子的細胞表麵表達[6-8]。這使得病毒在鼻腔和上呼吸道上皮細胞中活躍複製，並導致膿皰和潰瘍性病變[9]。 This combined with immunosuppression, facilitates secondary bacterial infection resulting in pneumonia and/or BRDC [4,8,10].

在沒有繼發性細菌感染的情況下，受感染的動物通常存活，但成為BoHV-1的終生攜帶者。bohev -1在呼吸黏膜或鼻上皮細胞中初始複製後，進入鼻咽部三叉神經的感覺神經末梢(軸突末梢)。隨後，核衣殼和被膜結構被逆行運輸(沿三叉神經軸突向上)到三叉神經節(TG)中相應的神經元細胞體，在那裏它們建立終身潛伏期[3]。此後，在潛伏感染動物的整個生命周期內，壓力可誘導潛伏病毒重新激活。這通常導致它的順行運輸(沿軸突向下，遠離細胞體)到鼻咽部的神經末梢(三叉神經的上頜分支)。這進一步導致鼻病毒脫落和隨後的病毒傳播到易感動物，從而加強了病毒在動物群體[3]中的維持和傳播。實驗上，綿羊和山羊在鼻上皮細胞中支持BoHV-1的多產複製。經鼻內感染的綿羊和山羊通過鼻分泌物排出病毒[11,12]。一些實驗研究也表明，受感染的綿羊和山羊在鼻內感染後對boh1產生免疫應答[11,12]。BoHV-1也在綿羊和山羊的三叉神經節在鼻內感染後建立潛伏感染。 Like in cattle, the latent virus reactivates due to stress and results in recurrent virus nasal excretion and seroconversion (rising antibody titers) [11,12].

我們已經設計了一種三基因突變的牛皰疹病毒1型(bohev -1 tmv)疫苗，該疫苗不下調MHC-I細胞表麵表達，缺乏毒性，在從潛伏期重新激活後不會在鼻分泌物中脫落。這是因為在BoHV-1 tmv中，BoHV-1 UL49.5中下調MHC-I的結構域被刪除，整個糖蛋白gE的細胞質尾序列對毒性和順行性都很重要

神經元傳輸和順行軸突傳輸所需的整個Us9編碼序列被刪除[13]。最近，我們已經確定，在犢牛鼻內接種/感染後，bohev -1型tmv明顯減弱，但複製效率高，並與ge刪除病毒相比產生明顯更好的保護性免疫反應，後者也有正向神經元轉運缺陷，在潛伏期[14]重新激活後不會在鼻分泌物中脫落。

由於野生型(wt) bohev -1可經鼻內感染綿羊，引起中度臨床症狀和誘導血清中和抗體[11]，我們假設bohev -1 tmv在綿羊體內經鼻內給藥會減弱;然而，在鼻內感染後，它會誘導boh1特異性免疫反應。如果這是正確的，那麼bohev -1型tmv可以作為病毒載體來表達感染牛、羊和山羊的其他病毒的保護性抗原，如裂穀熱[15]、小反芻動物病毒[16]、藍舌病[17]和邊界病。我們在綿羊鼻內感染後測定了bohev -1型tmv的複製/脫落特性和血清中和抗體反應。我們的結果表明，BoHV-1型tmv感染綿羊，並在經腸內感染後誘導BoHV-1特異性血清中和反應。

材料和方法

細胞和病毒株

用於病毒繁殖的MDBK細胞係保持如前麵描述的[18]。bohev -1 tmv病毒在早期[13]使用親本bohev -1 Cooper株構建。

羔羊鼻內感染

動物感染、處理、樣本采集和安樂死協議之前都得到了LSU機構動物護理和使用委員會的批準。12隻4-6月齡bohev -1和BVDV陰性的公羊羔(凱士丁品種)，體重約。選擇60-80磅。每隻羊羔被隨機分配到lsu ag中心大型動物隔離設施的兩個房間。羔羊感染情況及樣本采集方案見表1。感染組動物按前麵描述的[13]鼻腔內接種1 × 10⁷斑塊形成單位(PFU) 0.5 ml/鼻孔bohev -1 tmv(總2 × 10⁷每隻羊微升)。對照組未感染羔羊分別飼養，以0.5 ml /鼻孔的細胞培養基進行同樣的接種。

對於臨床體征，每次就診時記錄直腸溫度、鼻分泌物和鼻腔病變，並對每個參數進行臨床評分。直腸溫度分為0-4分(<39.0°C、39.5°C、40.0°C、40.5°C、>40.9°C)，鼻分泌物分為0-4分(正常、漿液性、輕度和重度粘液膿性)，鼻腔病變分為0-3分(正常、充血、膿皰和潰瘍)。

病毒滴定和病毒中和試驗

為了進行病毒滴定，MDBK細胞以約3 × 10的濃度接種於24孔板(康寧)⁵細胞前一天500 μl/孔。用含有2%胎牛血清的DMEM稀釋病毒懸液，稀釋倍數從10-1到10-7。從含有細胞的24孔板中倒出培養基後，將每種稀釋液中的200 μl等分液加入到相應的兩個孔中，在CO中孵育2 h₂孵化器在37°C。然後，在每孔中加入400 μl覆蓋培養基，1.3%的羧甲基纖維素在含有2% FBS (Sigma #C5013)的DMEM中，在37℃下進一步培養48 h。用4%甲醛溶液室溫固定30min，然後用0.35%結晶紫溶液染色(15min)。病毒滴度用空斑形成單位(pfu)/ml表示，公式如下:

表1:羔羊鼻內感染bohev -1型tmv研究設計方案。

=斑塊平均數目×病毒稀釋倍數的倒數× 5。

在病毒中和試驗中，如上製備了24個含有MDBK細胞的孔板。血清樣品在56°C滅活30分鍾，在含有2% DMEM的雙倍稀釋培養基中稀釋，每個試管中保留250 μl稀釋後的血清。在37°C下用250 μl含100 pfu /100 μl的病毒懸液孵育1 h。作為對照，5個含DMEM (250 μl)的試管與250 μl含100 pfu /100 μl的病毒懸液孵育。隨後，將每種血清/病毒稀釋劑和對照物中的200 μl等分液一式兩份加入上述24孔板的相應孔中，在37°C下進一步培養48 h。細胞按上述方法固定並染色，計數每孔中的斑塊數量。對照孔中平均計數的斑塊數記為Vo，每種血清稀釋劑中平均計數的斑塊數記為V。每種血清稀釋劑中剩餘斑塊的百分比在Microsoft Excel中計算公式如下:=(V*100)/V_o)，然後繪圖計算每個血清樣本的50%斑塊減少效價。滴度表示為與病毒對照相比導致斑塊數量減少50%的最高血清稀釋度的倒數。

結果與討論

BoHV-1型tmv在羔羊體內的致病性和鼻病毒脫落

在初次感染/接種疫苗後，確定受感染羔羊的臨床評分。根據結果(數據未顯示)，這些動物沒有發燒、明顯的鼻腔病變或鼻腔分泌物。因此，他們的臨床評分與受感染的對照組沒有顯著差異(數據未顯示)。bohev -1型tmv在鼻上皮細胞中有效複製，並在感染後7天內釋放病毒。鼻拭子中病毒的最高產量是在4 dpi (1-2 × 10⁴我們早期的小牛疫苗挑戰研究結果也表明，即使bohev -1型tmv複製良好(2 × 105 - 8 × 10⁵感染犢牛的鼻上皮中PFUs)，犢牛沒有明顯的臨床體征(直腸溫度、鼻分泌物和鼻腔病變[13])。

圖1:羊原發性鼻內感染/免疫bohev -1型tmv後鼻病毒脫落作為對照，假感染羔羊也在原發感染期間進行檢測。在指定的時間點，在1 ml含青黴素/鏈黴素的DMEM中收集鼻拭子。用標準空斑法對鼻拭子進行病毒滴定。正如預期的那樣，對照組的假感染羔羊沒有產生任何可檢測到的病毒。

早些時候，Hage等人[11]報道，wt bohev -1，菌株lam在羊的鼻上皮細胞中複製，並導致鼻病毒脫落，持續時間可達15 dpi，病毒產量高達10^7．5TCID50。此外，接種的羊有中度的漿液性膿性鼻分泌物。在犢牛中，與親本野生型菌株Cooper相比，BoHV-1 tmv在鼻病毒脫落的持續時間和臨床體征[13]方麵均減弱。在犢牛中，BoHV-1wt和BoHV-1 tmv鼻病毒脫落分別持續了12 dpi和9 dpi。值得注意的是，bohev -1型tmv感染的犢牛沒有表現出任何臨床症狀。在羔羊中，BoHV-1型tmv的鼻病毒脫落持續了7天，比Hage等人[11]報道的綿羊BoHV-1型鼻病毒脫落短9天。在本研究中，我們沒有比較bohev -1 wt Cooper菌株在羔羊體內的病毒脫落情況。然而，基於我們在犢牛中使用的與本研究基本相同的方法的早期結果，我們認為與犢牛一樣，bohev -1 tmv在羔羊[13]中顯示出衰減的生長表型。這些結果也與bohev -1型tmv在羔羊中比在犢牛中表現出稍強的衰減特性的假設一致。

bohev -1型tmv感染羔羊的中和血清抗體滴度

為了評估接種了BoHV-1 tmv的羔羊的特異性免疫應答，從BoHV-1 tmv感染羊和假感染羊(表1)的0、7、14和21 dpi收集的血清中檢測抗BoHV-1 wt的血清病毒中和(VN)抗體滴度。如圖2所示，感染BoHV-1 tmv的羔羊在原發性感染後產生VN抗體滴度，到21-28 dpi時，平均血清病毒中和滴度為6-8。早期，在犢牛中，經鼻內接種BoHV- 1tmv (SN滴度在15-20之間)後，我們獲得了稍好的血清中和滴度。雖然接種了BoHV-1型tmv疫苗的羔羊獲得的抗BoHV-1的血清中和效價低於犢牛，但它們可能具有保護作用。如果沒有，我們相信通過同時肌內注射疫苗病毒可以獲得更高的血清中和效價。

總之，減毒的牛肝病毒-1型tmv在羔羊中保留了其傳染性和免疫原性，因此顯示了其作為抗牛肝病毒-1型疫苗和病毒載體疫苗的進一步研究潛力。我們目前正在進行的研究取得了令人鼓舞的結果，表明bohev -1 tmv可以作為其他牛呼吸道病毒的保護性抗原載體，如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)包膜蛋白E2[18,19]，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)包膜蛋白F和G[20,21]。此外，我們認為它可以作為牛和小反芻動物裂穀熱病毒(RVFV)保護性抗原Gc和Gn的載體[22,23]。在綿羊、山羊、水牛和牛等關鍵家畜種中感染裂穀熱病毒，通過死亡、流產和產奶量下降[24]造成重大經濟損失。此外，感染裂穀病毒的羊和牛是人類的主要感染源。2000年，沙特阿拉伯有747例人感染病例，這可能是由於朝覲期間動物和人的大規模流動。目前，我們正在研製一種抗裂穀病毒的bohev -1型tmv病媒疫苗，如果有效，可用於接種綿羊、山羊、牛，也許還有水牛，以防止未來人間裂穀病毒暴發。

Figure2:羊經鼻內感染/免疫後的病毒中和抗體滴度在指定的時間點收集血清樣本，加熱滅活(56°C 30分鍾)並在-20°C保存。用空斑減少法計算血清病毒中和效價。不出所料，對照組假感染羔羊bohv -1特異性中和抗體呈陰性。

確認

這項工作得到了美國農業部對S.I. Chowdhury(2009- 35204-05200和2007- 35204-17358)的資助。

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文章類型:研究文章

引用:Lay CT, Burke JM, Paulsen DB, Chowdhury SI(2016)羔羊鼻內注射bohev -1的三基因突變體在鼻上皮細胞中有效複製並誘導中和抗體。國際J疫苗免疫2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/ 2470-9948.108

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出版的曆史:

收到日期:2016年1月11日

接受日期:2016年1月25日

發表日期:2016年1月29日