摘要

背景:LncRNA GHRLOS是一種長鏈非編碼rna (lncRNAs)。表達譜微陣列檢測顯示lncRNA GHRLOS在結腸癌組織中顯著低表達，而其在腫瘤中的作用尚不清楚。

摘要目的:探討lncRNA GHRLOS在結直腸癌中的作用及生物學意義，闡明其影響結直腸癌惡性生物學行為的分子機製。

方法:通過收集結直腸癌患者配對的腫瘤組織和癌旁組織檢測GHRLOS的表達。收集患者複發、轉移、生存狀況等隨訪資料，分析GHRLOS表達水平與生存時間等指標的關係。改變結腸癌細胞中lncRNA GHRLOS的表達，檢測其對細胞遷移和侵襲的影響。結直腸癌的腫瘤承載模型原位構建裸鼠模型，觀察lncRNA GHRLOS表達對轉移的影響。改變lncRNA GHRLOS的表達後，檢測GHRL基因mRNA和E-cadherin的表達變化。

結果:GHRLOS在結直腸腫瘤組織中的表達明顯低於癌旁組織。GHRLOS表達下調與結直腸癌的淋巴結轉移和遠處轉移相關，是影響結直腸癌患者預後的獨立危險因素。在人結直腸癌細胞中，GHRLOS的低表達使細胞變得更加紡錘狀，從而在轉錄後水平負向調控GHRL基因的表達，從而顯著抑製E-cadherin的表達，促進細胞遷移和侵襲。GHRLOS過表達可抑製腫瘤轉移。

結論:lncRNA GHRLOS可通過直接影響結腸癌組織中GHRL基因的成熟mRNA，增強E-cadherin的表達，進而促進腫瘤細胞的轉移、遷移和侵襲。

關鍵字

結腸癌;lncRNA;GHRLOS;鈣粘蛋白

簡介

結直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。結直腸癌的發病率在男性和女性惡性腫瘤中均位列前三，是全球腫瘤相關死亡的主要原因之一，在全球範圍內呈逐年上升趨勢[1,2]。隨著預防策略和早期診斷技術的完善，有助於早期診斷和治療方案的優化，結腸直腸癌患者的生存時間和生活質量得到了提高。然而，轉移性結直腸癌仍缺乏有效的治療措施，導致預後不理想[3]。結直腸癌的轉移是一個複雜的過程，受多種生物學因素的影響。目前，對其內在機製還沒有統一、全麵的認識。因此，識別影響結直腸癌轉移行為和預後的關鍵分子，對治療和預後也有臨床意義，具有重要的學術價值。

長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, lncrna)是一類轉錄本長度超過200，但缺乏完整開放閱讀框[4]的功能性非編碼RNA分子。長期以來，lncRNA被認為是轉錄過程的副產品，沒有生物學功能[5]。在腫瘤研究領域，lncRNA表達異常已在包括結直腸癌在內的多種腫瘤中被發現，並已被證明與腫瘤[6]的形成、生長、侵襲和轉移密切相關。

之前的一項研究對收集的結直腸癌患者的腫瘤組織和配對的癌旁組織進行了mRNA/ lncRNA表達譜的芯片檢測，篩選出了174個lncRNA在癌症組織表達中顯著變化的lncRNA。同時，共獲得254個差異表達mrna。我們分析了差異表達lncRNA和mrna的共表達網絡，並進一步鑒定了共表達網絡中的7個樞紐基因，包括lncRNA GHRLOS[7]。在本研究中，我們改變了GHRLOS在結直腸癌中的表達，以深入研究其在結直腸癌轉移行為過程中的作用和機製。

材料和方法

患者，組織收集和實驗材料

選取2007 - 2012年在我院普外科行結直腸癌根治術的患者。納入標準如下:1)病理證實為結直腸癌;2)初次接受手術治療;3)術前無放化療;4)完整的醫療記錄。排除標準為:1)不值得尊敬的遠處轉移性疾病，僅行姑息性手術;2)病理標本RNA提取不足;3)拒絕參加研究。

本研究共納入366例患者。收集腫瘤組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣5cm處>)。所有臨床病理資料均來自醫療記錄。患者的病理分期依據AJCC大腸癌分期標準。本研究經華山醫院醫學倫理委員會批準，按照《赫爾辛基宣言》實施。

本實驗使用的細胞係從中國科學院細胞庫購買:SW116、SW480、LOVO、COLO和293T。主要試劑包括GHRLOS- sirna過表達慢病毒載體和GHRLOS, Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司，中國;熒光素酶報告基因檢測試劑盒，碧雲天生物科技有限公司，RG005;cDNA合成試劑盒，11123ES60，上海億盛生物技術有限公司，中國;qPCR試劑盒，1120ES08，上海億盛生物科技有限公司，中國;BCA蛋白定量試劑盒，c503021，上工生物工程(上海)有限公司，中國;ECL化學發光試劑盒，abs920，伊必信生物技術股份有限公司;HPR-DAB顯色試劑盒，PA110，天根生物技術有限公司，中國;HRP標記山羊抗兔，A0208，碧雲天生物技術有限公司;HRP標記山羊抗小鼠，A0216，碧雲天生物技術有限公司; E-cadherin antibody, 610182, BD Biosciences, USA and N-cadherin antibody, 22018-1-AP, Proteintech, UAS.

石蠟包埋切片，HE染色，RNA提取

術後立即收集離腫瘤邊緣5cm以上的新鮮腫瘤組織及癌旁組織，存放在80°C液氮中提取RNA。RNA用Trizol Reagent(中國賽默飛世爾科技公司)提取，用Primescript RT Reagent Kit(寶日醫療生物技術(北京)有限公司)進行反轉錄。獲得的合成cDNA作為模板，使用FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche診斷，上海)對lncRNA的表達進行定量PCR分析。GAPDH被用作加載控製，內部控製。使用的引物如下:GHRLOS上遊引物5´- TGGAAACTCCCCTAGCCACA;GHRLOS下遊引物5´- GCATCTCTCCTCTGTTCCGT;GAPDH上遊引物5´- ATCC TGGGCTACACTGAGCACC和GAPDH下遊引物5´- AAGTGG TCGTTGAGGGCAATGC。

跟進的病人

所有入組患者每三個月隨訪一次，隨訪終點為2016年10月或死亡。隨訪包括體檢、實驗室檢查、影像學檢查(內窺鏡、超聲、CT、MRI、PET)和必要的活檢(如有需要)。

數據分析

用配對t檢驗比較GHRLOS在腫瘤組織和癌旁組織中的表達情況。采用卡方檢驗評價GHRLOS表達與臨床病理特征的關係。采用Kaplan-Meier法繪製生存曲線，時間序列檢驗分析生存曲線差異。采用Cox回歸模型進行單因素和多因素生存分析。單因素分析中p<0.05的變量納入後續多因素分析。采用SPSS12.0進行數據分析，統計學顯著性水平設為5%。

細胞轉染

結腸癌細胞在含5%CO的潮濕氣氛中培養於含高葡萄糖的DMEM培養基中₂/95%空氣在37°C。簡單地說，細胞與過表達的GHRLOSsiRNA和GHRLOS的慢病毒載體和Lipofectamine®3000 (Invitrogen)轉染試劑在37ºC, 5%CO中培養₂分別為48小時。收集細胞，觀察各組細胞形態。建立以下細胞係:SW116-GHRLOS-NC、SW116-GHRLOS-OE、SW480-GHRLOS-NC、SW480-GHRLOS-siRNA、LOVO-GHRLOS-NC、LOVO-GHRLOSsiRNA、col320 - ghrlos -NC、col320 - ghrlos - oe (NC:空白對照;OE: GHRLOS過表達;siRNA:敲除GHRLOS)。

熒光素酶病毒的轉染和熒光素酶活性的檢測

首先將病毒轉染到293T細胞中，在細胞培養箱中培養72小時，收集病毒液。濃縮後，病毒液轉染結腸癌細胞。細胞裂解後，加入熒光素酶檢測試劑，記錄激發光560nm處的吸光度值。

Transwell細胞侵襲實驗

在上隔室共植入5 × 104個細胞。無血清培養基添加到上隔室，而血清培養基添加到下隔室。連續培養48h後，觀察到細胞穿透。甲醛固定，結晶紫染色後，洗去結晶紫，擦拭上層細胞，顯微鏡下觀察下層細胞數量。

劃痕試驗

首先，用記號筆在6孔板背麵均勻畫水平線，大約每0.5-1cm一條線穿過孔，每個孔至少穿過3條線。然後在培養皿中加入5 × 105個細胞。24小時後，用移液管尖端與背麵水平線成90°角劃動。去除被刮掉的細胞，加入完整的培養基。5%的公司₂用37℃培養箱培養，分別於0、6、24、48h拍照。

免疫印跡

細胞消化離心收集細胞，加入裂解液進行裂解。離心收集上清，即細胞的總蛋白溶液。用BCA試劑盒測定提取的蛋白濃度，將所有樣品的蛋白濃度調整為2mg/ml。製備SDS-PAGE凝膠。加入蛋白質樣品後進行電泳和膜轉移，然後加入一抗和二抗。最後用ECL化學發光檢測係統對結果進行檢測。

qPCR

用Trizol提取RNA，用Hieff合成cDNA^®qPCR SYBR Green Master Mix係統，按供應商說明操作。引物序列(5′-3′)如下:E-cadherin:上遊引物為TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT，下遊引物為TGCGTTCTCTATCCAGAGGCT。GHRL(材料mRNA):上遊引物為AAGATGGAGGTCAAGCAGAAGG，下遊引物為TCCCAGAGGATGTCCTGAAGAA;GHRL (pre-RNA):上遊引物為GGGCAGAGGATGAACTGGAA，下遊引物為CCTGGCTGTGCTGCTGGTA;GADPH:上遊引物為AGGTGA AGGTCGGAGTCA，下遊引物為GGTCATTGATGGCAACAA。

結腸癌模型的建立原位

實驗動物為3月齡雄性Balb/c小鼠，SPF級(20 ~ 25g)，購自中國上海思珀比凱實驗動物有限公司。所有動物被安置在溫度22±1℃，相對濕度50±1%，明暗循環12/12h的環境中。所有動物研究(包括小鼠安樂死程序)均按照複旦大學機構動物護理的規定和指南進行，並按照AAALAC和IACUC指南進行。

造模過程如下:裸鼠麻醉後，打開腹腔，暴露直腸。用胰島素注射器吸收100μL細胞懸液(細胞總數為5 × 106)，接種於結腸漿液層。腫瘤細胞接種後每兩周進行一次小動物顯像。成像方法:麻醉後，裸鼠腹腔注射熒光素酶底物100μL(濃度為15mg/ml)。等待15分鍾後，將裸鼠依次置於活體動物成像儀中以仰臥位和俯臥位進行拍照。喂養6周後，水合氯醛麻醉開腹拍照，取標本觀察腫瘤轉移情況。

石蠟包埋切片，HE染色和免疫組化

取裸鼠結腸癌模型的原發性和轉移性組織，經修剪、固定、脫水、包埋後切成切片。分別進行HR染色和免疫組化，E-cadherin作為一抗。

結果

lncRNA GHRLOS在結腸癌組織中顯著低表達

采用RT-PCR檢測366例手術標本的結腸癌組織及配對癌旁組織中lncRNA GHRLOS的表達。如圖1所示，總的來說，lncRNA GHRLOS在結腸癌組織中的表達明顯低於癌旁組織(P<0.001)。366例患者(圖2)中，199例(54.4%)lncRNA GHRLOS在腫瘤組織中的表達低於配對癌旁組織(差異倍數)

圖1:366例結直腸癌患者腫瘤組織GHRLSO表達的變化* * * P < 0.001。

圖2:Kaplan-Meier生存分析GHRLOS表達對結直腸癌患者預後的影響。
(A) Kaplan-Meier生存分析不同GHRLOS表達變化組結直腸癌患者的DFS。
(B)不同GHRLOS表達變化組結直腸癌患者生存率Kaplan-Meier生存分析。

GHRLOS表達在直腸癌患者預後中的意義

為了確定GHRLOS在結腸癌患者預後和生存中的作用，我們評估了GHRLOS表達與DFS和OS之間的關係。366例結直腸癌患者中，132例在隨訪中死亡(圖2)。結直腸癌患者術後隨訪時間為5個月至85個月，中位隨訪時間為56個月。所有結腸癌患者的5年總DFS和OS分別為57%和63%。生存分析顯示，GHRLOS表達顯著降低患者的DFS (p<0.001)和OS (p<0.001)均低於GHRLOS表達正常患者，提示GHRLOS表達顯著降低可能是預後不良的標誌。

過表達的熒光素酶在SW480、SW116、LoVo和COLO320細胞係中活性顯著升高

動態檢測腫瘤生長在活的有機體內通過小動物成像，我們製作了過表達熒光素酶的SW116- GHRLOSOE、sw480 - GHRLOSOE - nc、SW480-GHRLOS-siRNA、LOVOGHRLOS-NC、LOVO-GHRLOS-siRNA、col320 - ghrlos - nc和col320 - ghrlos - oe細胞係。用熒光素酶檢測熒光素酶活性(圖3)，結果表明，成功構建了上述8個熒光素酶過表達細胞係。敲除SW480和LoVo GHRLOS基因後，檢測GHRL前體mRNA和成熟mRNA的表達水平。

圖3:熒光素酶在四種細胞係中均過表達。(A-D)熒光素酶過表達前後SW116、SW480、LoVo和COLO320熒光素酶活性圖譜。SW116-NC為SW116-GHRLOS-NC, SW116-OE為SW116-GHRLOS-OE。同樣，其他細胞係也會忽略GHRLOS。設計師小金代表熒光素酶;RLU表示相對光單位;*** vs NC, P<0.001;*** vs OE/siRNA, P<0.001。

在人結直腸癌細胞中，GHRLOS低表達顯著抑製了GHRL成熟mRNA的表達

為了初步探討GHRLOS調控GHRL基因表達的機製，我們在敲除SW480和LoVo GHRLOS基因後，檢測GHRL前體mRNA和成熟mRNA的表達水平。結果表明，GHRLOS基因敲除後，GHRL前體mRNA表達水平無明顯變化。相比之下，成熟mRNA的表達量顯著增加(圖4)，提示GHRLOS可能在結腸直腸癌的轉錄後水平負向調控GHRL基因的表達。

圖4:GHRLOS抑製GHRL成熟mRNA的表達。
(A) qPCR檢測GHRLOS基因敲除前後LoVo細胞中GHRL前體mRNA和成熟mRNA的表達水平。
(B) qPCR檢測GHRLOS基因敲除前後SW480細胞GHRL前體mRNA和成熟mRNA表達水平;*, P < 0.05。

在人結直腸癌細胞中，GHRLOS低表達導致細胞變得更紡錘狀，並顯著抑製E-cadherin的表達

我們觀察到，在敲除GHRLOS基因後，SW480和LoVo細胞的形態發生了變化，它們變得更加紡錘狀(圖5A和B)。隨後，我們檢測了SW480和LoVo細胞中E-cadherin的表達量，結果顯示，敲除GHRLOS後，E-cadherin蛋白(圖5C和D)和mRNA(圖5E)的表達量均顯著降低，這表明GHRLOS可能通過抑製結直腸癌的EMT而具有抗癌作用。

圖5:GHRLOS低表達促進人結腸癌細胞EMT。
(A-B)分別用顯微鏡觀察敲除GHRLOS基因前後LoVo和SW480細胞的形態學變化。
(C-D)低表達GHRLOS對WB檢測LoVo和SW480細胞中E-cadherin蛋白表達水平的影響。
E顯示GHRLOS低表達對qPCR檢測LoVo和SW480細胞E-cadherin mRNA表達水平的影響;*, P < 0.05;* *, P < 0.01。

在人結直腸癌細胞中，GHRLOS低表達促進細胞遷移和侵襲

劃痕測試和transwell實驗顯示，敲除GHRLOS基因後，SW480和LoVo細胞的遷移和侵襲能力顯著增強(圖6)。

圖6:GHRLOS低表達促進人結腸癌細胞遷移和侵襲。
(A-B)敲除GHRLOS基因前後LoVo和SW480的遷移能力圖譜。
(C) GHRLOS基因敲除前後LoVo和SW480的入侵能力圖譜;*, P < 0.05。

GHRLOS過表達促進了原發病變組織中E-cadherin的表達，抑製了N-cadherin的表達，從而阻礙了轉移的形成。

進一步驗證GHRLOS是否也具有抗腫瘤作用在活的有機體內，我們構建了結直腸癌的腫瘤承載模型原位在裸鼠中使用SW116和SW480細胞。每兩周進行一次小動物成像。原發性(結腸)病變的IHC結果也顯示GHRLOS過表達促進E-cadherin的表達，抑製N-cadherin的表達(圖7)^th一周後，小動物的成像結果和裸鼠的最終解剖結果顯示，過表達GHRLOS可以抑製腫瘤轉移的形成(圖8)。所有疑似腫瘤轉移經HE染色驗證，結果均為癌變(圖8)。這些結果表明，過表達GHRLOS可以抑製EMT和腫瘤遷移。

圖7:GHRLOS過表達促進結腸癌原發病灶中E-cadherin的表達，抑製N-cadherin的表達。
(A-B)免疫組化檢測結腸癌原發病變中E-cadherin的表達。
(C-D)免疫組化檢測結腸癌原發病變中n -鈣粘蛋白的表達;A1-D1尺度為100 μm;A2-D2為A1-D1局部放大圖像，比例尺為50 μM。

圖8:GHRLOS過表達抑製結腸癌轉移
(A) SW116-NC組第6周小動物影像學結果。
(B) SW116-NC組在執行和取樣第6周時的解剖圖。
(C) SW116-OE組第6周小動物影像學結果。
(D)執行和取樣第6周SW116-OE組解剖圖;紅色箭頭表示腫瘤的位置。

討論

lncrna被認為在腫瘤的生物學行為中起著至關重要的作用。lncRNA的表達變化參與了腫瘤的發展，可能是[8]患者潛在的預後標誌物。在結腸癌中，許多lncrna的異常表達，如HOTAIR[9]、NEAT1[10]、H19[11]等被認為與結腸癌的預後有關。在我們之前的研究中，我們比較了結腸癌組織和配對癌旁組織的表達譜，發現了許多差異表達的lncrna和mrna[12]。進一步對這些異常表達的lncRNA和mRNA進行共表達分析，發現lncRNA GHRLOS是結腸癌[12]中lncRNA/mRNA共表達網絡的樞紐基因之一。然而，GHRLOS在結腸癌中的臨床意義尚不清楚。

在本研究中，我們分析了366對結腸癌組織和癌旁組織中GHRLOS的表達。我們的研究結果顯示，在腫瘤組織中，GHRLOS的表達大量減少，提示GHRLOS在結腸癌的進化過程中具有重要作用。此外，我們發現GHRLOS表達下調與結直腸癌患者預後不良呈正相關。以上結果提示，GHRLOS可能具有腫瘤抑製基因的功能，下調GHRLOS可能促進結直腸癌的進展和轉移。因此，檢測GHRLOS的表達可以幫助識別結腸直腸癌複發的高危患者。因此，有必要評估這一人群是否需要更積極的治療。

在臨床上，GHLOS表達下調與結直腸癌患者預後不良呈正相關。從細胞的生物學行為來看，我們的結果顯示GHRLOS的低表達導致細胞變得更紡錘狀。此外，它們還能促進細胞遷移和侵襲，而GHRLOS過表達可促進原發病變組織中E-cadherin的表達，抑製N-cadherin的表達，從而阻礙轉移瘤的形成。而GHRLOS敲除後，GHRL成熟mRNA的表達水平顯著降低，提示GHRLOS可能在結腸直腸癌中轉錄後水平調控GHRL基因的表達。綜上所述，GHRLOS可能通過調控GHRL基因的表達來影響腫瘤細胞的EMT過程，從而影響細胞的遷移、侵襲和轉移。

由於GHRLOS是生長激素釋放肽(Growth hormone erelelpeptide, GHRP)基因的一種反義RNA，許多學者認為GHRLOS在調節生長素軸[13]中起著至關重要的作用。GHRP是一種重要的胃腸道肽激素，是生長激素釋放受體[14]的配體。它在調節能量代謝中起著重要作用，但也與許多腫瘤的生長和進展密切相關[7,14,15]。在結直腸癌中，GHRP在腫瘤細胞係和病理腫瘤組織[16]中均有過表達。在結腸癌患者的血清中也發現了GHRP的增加，支持了腫瘤分泌GHRP的假說。既往研究證實GHRP可促進結直腸腫瘤的增殖、遷移和侵襲[16,17]。下調GHRP受體可抑製結直腸癌細胞的生長在體外和體內。由於GHRLOS是GHRP基因的反義RNA，因此GHRLOS的下調有可能導致GHRP信號通路的激活，促進結直腸癌的生長和轉移。然而，GHRLOS表達的調控機製尚未完全闡明，調控GHRLOS表達的轉錄因子尚未發現。

總的來說，我們的結果顯示，大部分lncRNA GHRLOS的表達在結腸腫瘤組織中被下調。在臨床上，IncRNA GHRLOS不僅有望作為預測轉移的生物標誌物，還有望預測患者的預後。在細胞水平上，GHRLOS的低表達使細胞變得更加梭形，促進細胞的遷移和侵襲。相反，GHRLOS過表達可促進E-cadherin的表達，抑製原發病變組織的轉移。在分子水平上，GHRLOS基因敲除後，GHRL成熟mRNA的表達量顯著降低，這可能是GHRLOS發揮生物學功能的內在機製。報道的觀察結果需要進一步的實驗研究來證實。

結論

LncRNA GHRLOS可直接作用於結腸癌組織中GHRL基因的成熟mRNA，從而增強E-cadherin的表達，進而抑製腫瘤細胞的轉移、遷移和侵襲。

的利益衝突

沒有宣布。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:毛霞，劉娟，吳鬆(2021)lncRNA GHRLOS對結腸癌轉移的抑製作用及其分子機製。J外科開放訪問7(4):dx.doi.org/10.16966/2470-0991.251

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出版的曆史:

收到日期:2021年7月28日

接受日期:2021年8月20日,

發表日期:2021年8月28日