簡介
造血幹細胞(HSCs)具有自我更新的能力和分化為所有血細胞譜係的潛力，被認為是造血係統的唯一來源[1- 5]。盡管造血幹細胞可用於治療血液病和惡性疾病[6]，但其臨床應用一直受到限製，主要原因是造血幹細胞僅占骨髓細胞的一小部分，且難以維持其自我更新能力在體外避免移植過程中造血幹細胞的免疫排斥[2,3]。
誘導多能幹細胞(Induced pluripotent stem, iPS)可通過特異性因子的過表達產生[7-9]，具有自我更新能力和分化為任何細胞類型的潛力;因此，這些細胞在疾病治療[10,11]、藥物篩選[12]、毒理學和再生醫學[13]中具有重要意義。然而，iPS細胞的生成既耗時又低效(0.001-0.1%)，最重要的是涉及到幾個安全問題[14,15]。為了克服這些問題，研究人員開發了細胞直接轉化的方法[16-18]。根據最近的報告，這些重編程過程產生了各種中間細胞類型;例如，iPS細胞是體細胞重編程的產物之一。然而，這些重新編程過程的最終結果取決於許多具體條件[18,19]。Bhatia的研究小組報告說，人類成纖維細胞可以通過轉錄因子(TF)與造血調節區域[19]的結合轉化為多譜係的血液祖細胞，他們的結果表明，Oct4作為一個譜係特異性的TF[18]。
此外，最近有報道稱，Gata2、Gfi1b、c-Fos和Etv6四種轉錄因子的組合可誘導內皮樣前體細胞形成造血細胞。這些細胞表現出CD45+cKit+CD150+CD48因子-表型與LT-HSCs[20]相似。然而，這些重新編程細胞的造血潛能是有限的。另一份報告顯示，Run1t1、Hlf、Lmo2、Prdm5、Pbx1和Zfp37的聯合作用促進了造血幹細胞向造血幹細胞的轉化，提示造血幹細胞[21]的基因網絡受特定因素的調控。然而，由於血細胞是一種獨特的細胞類型，將MEF細胞轉化為造血幹細胞仍然是一個挑戰。最近，研究發現FOSB、GFI1、RUNX1和SPI1在人臍靜脈內皮細胞和人成人真皮微血管內皮細胞中的表達可誘導產生具有長期MPP活性的造血細胞[22]，盡管獲得人內皮細胞比較困難。相比之下，在重新編程過程中很容易獲得mef。Lacaud的團隊還證明了造血轉錄因子誘導成纖維細胞向造血祖細胞的轉化。然而長期在活的有機體內[23]未顯示移植能力。
對造血係統的深入了解和體細胞重編程的最新發現促使我們研究小鼠體細胞是否可以通過結合造血幹細胞特異性因子和多能相關基因重編程為造血祖細胞(HPCs)，然後在造血幹細胞特異性培養條件下培養這些轉導細胞。在這項研究中，我們能夠生成譜係c- kit+本來就+(LKS)，長期HSC (LT-HSC;CD34-Flk2-CD150+CD48- LKS)，短期HSC (ST-HSC;CD34+Flk2-CD150+CD48因子-LKS)和MPP (CD34+Flk2+CD150——CD48因子-通過pMXs-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc/Lmo2/c-Fos/c-Myb (pMXs-7TF MEFs)轉染小鼠胚胎成纖維細胞(mef)[24,25]。此外，pMXs-7TF mef成功分化為兩種免疫細胞在體外而且在活的有機體內．非常有可能的是，成功生成的造血幹細胞將解決與在個體患者中使用匹配的造血幹細胞相關的主要困難在體外擴大造血幹細胞的臨床應用。
材料和方法
老鼠
C57BL/6J小鼠和同源CD45.1+C57BL/6小鼠購自Jackson實驗室(Bar Harbor, ME, http://www.jax.org)， Rag2-/- ii2 γg-/-小鼠(C57BL/6J X C57BL/10SgSnAi)購自Taconic Farms[26]。按照先前報道的[27]構建了攜帶PAC克隆的hCD34轉基因小鼠(C57B6)，該PAC克隆包含整個hCD34基因和12.8 kb的5 '和25.6 kb的3 '側翼序列。所有小鼠均維持在特定的無病原體條件下，我們使用8至12周大的雄性小鼠。所有實驗均按照韓國生物科學與技術研究院(KRIBB)機構動物護理與使用委員會(kbbe - aec -13013)的指導方針進行。
細胞培養
肝星狀細胞(Lin-c-Kit+本來就+；使用FACSAria流式細胞儀(BD Biosciences)從小鼠BM中分離LSK)或Lin-c-Kit+ (LK)細胞。pMXs-7TF mef和造血幹細胞在添加2µg/ml吲哚美辛、20µg/ml慶大黴素、30 ng/ml SCF、50 ng/ml Flt3L、20 ng/ml TPO和20 ng/ml IL-6的Myelocult長期培養基(ST05350, STEMCELL Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada)中培養。所有細胞因子均購自PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)。MEF細胞在含有10%胎牛血清(HyClone)的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)中培養。
MEF準備
mef製備自妊娠13.5天的小鼠，用於1-2次傳代。取小鼠頭部和內髒，軀幹切碎，在37°C 0.1%胰蛋白酶(HyClone)中分散30分鍾。細胞被培養為兩個群體加倍(被認為是一個傳代)，然後存活冷凍。這些mef被用於所有後續的實驗。mef維持在含有10%胎牛血清(HyClone)的DMEM中，並在達到彙合時以1:3的稀釋倍數繼代培養。培養少於三代的mef用於pMXs-7TF mef的生成和飼養細胞的製備。
逆轉錄病毒感染
10月3日至4日，利用pMXs載體轉導Sox2, Klf4, c-Myc, LIM域僅2 (Lmo2)， c-Fos, c-髓母細胞增生(c-Myb)和c-Jun。從Addgene中獲得表達Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的pMXs質粒。Lmo2、c-Fos、c-Myb和c-Jun片段來源於21C前沿人類基因庫(KRIBB)。為了生成表達pMXs的Lmo2、c-Fos、c-Myb和c-Jun質粒，將c-Fos、c-Myb和c-Jun導入到pMXs質粒的BamHI/ indiii位點;Lmo2被引入pMXs的BglII/ hindii位點。鉑- e逆轉錄病毒包裝細胞(plate - e細胞，Cell Biolabs Inc.，[28])以6 × 10的速度接種於6孔板上5細胞每口井。第二天，根據製造商的說明，使用Lipofectamine和PLUS試劑(Invitrogen)對這些細胞進行pMXs逆轉錄病毒載體轉染。4小時後，用含10%胎牛血清的5ml DMEM替換培養基，細胞在37°C培養箱中培養。48小時後，收集培養基作為第一批含病毒上清，並更換為新鮮培養基。24小時後，收集第二份含有病毒的上清。用0.45 μm纖維素過濾器(Millipore)過濾病毒，混合等量的病毒，在4 g/ml聚苯乙烯(Sigma-Aldrich)存在的情況下轉移到mef中。這一感染過程每12小時重複三次。
感應的手持電腦
為了生成hpc, mef與pMXs-Oct 4/Sox2/ Klf4/c-Myc/Lmo2/c-For/c-Myb共感染3天。感染後第1天，按1-2 × 10重種細胞5在含有絲裂黴素C (Sigma-Aldrich)處理的MEF喂養細胞的0.1%明膠塗層六孔板中，每孔細胞。細胞在添加HSC細胞因子(2µg/ml吲哚美辛、20µg/ml慶大黴素、30 ng/ml SCF、50 ng/ml Flt3L、20 ng/ml TPO和20 ng/ml IL-6)的Myelocult長期培養基中培養。14-21天後，用100 μ l移液器采集菌落。為了將菌落打碎成小塊，用胰蛋白酶- edta (Hyclone SH30042.01)在37°C處理15min。將菌落重新播種到MEF飼養細胞中。菌落在添加HSC細胞因子的Myelocult長期培養基中培養。為了確保hpc的生成，對菌落進行HSC標記(c-Kit+,本來就+, CD34+/-, Flk2+/-, CD150+/-, CD48因子+/-，缺乏譜係標記)，並通過FACS進行分析。為了確認HPCs的生成，我們進行了PCR和western blot分析。為了驗證逆轉錄病毒介導的候選基因過表達，我們通過RT-PCR分析每個候選基因和GAPDH基因的mRNA水平。
流式細胞術
為了分析HSC標記物的表達，在4℃下用CD34、FLK2、hCD34、CD48、CD150、CD117和Ly6a抗體對細胞進行染色30分鍾。采用生物素化抗小鼠Mac-1 (CD11b)、Gr-1 (Ly6C)、Ter-119、NK1.1、CD2和B220的混合抗體進行譜係染色。為了區分供體細胞和受體細胞，使用CD45.1和CD45.2抗體，供體細胞用CD45.2抗體染色，受體細胞用CD45.1抗體染色。采用抗Gr-1、Mac-1和Ter- 119抗體分析髓係和紅係標記的表達。這些抗體從BD Biosciences或eBiosciences購買。使用FACSCanto流式細胞儀(BD Biosciences)生成數據，並使用FlowJo軟件(ThreeStar, Ashland, OR, USA)進行分析。
免疫印跡分析
細胞在含有1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 1% Triton X-100, 30 mM焦磷酸鈉，25 mM β-磷酸甘油，1 mM Na的裂解緩衝液中裂解3.簽證官4和1 mM PMSF。裂解物經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分解，分離蛋白轉移到PVDF膜(Millipore)上，0.1%染色朱紅色年代的解決方案。用5%脫脂牛奶或BSA阻斷後，將膜在抗c- kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)、抗cd150 (Abcam, Cambridge, MA, USA)或抗肌動蛋白(Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA)抗體中孵育。
逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和定量RT-PCR (QPCR)
總RNA提取使用TRIzol試劑(Invitrogen)。RT-PCR分析中，使用M-MLV逆轉錄酶和oligo (dT) 15引物(Promega, Madison, WI, USA)將每個RNA反轉錄為cDNA。然後，用Emerald Amp PCR Master Mix (Takara)擴增該cDNA，根據製造商的協議使用SYBR Premix Ex Taq (Takara)進行qPCR。RT-PCR和qPCR數據均歸一化至GAPDH表達水平。所用引物序列見補充表1。
菌落形成細胞(CFC)測定
為了進行CFC測定，使用了Methocult M3434培養基(STEMCELL Technologies)。首先，將0.4 ml pMXs-7TF mef加入到4 ml含有適當細胞因子的甲基纖維素基培養基中，並對管進行旋渦處理，以確保細胞與培養基混合。細胞混合物孵育5 min;然後，將1.1 ml的混合物滴入一個30毫米的培養皿中。細胞在37°C 5% CO中培養2在95%的濕度下保持14天。在40倍放大倒置顯微鏡下，對3、7或14天後的菌落進行形態學評價和計數。
染色染色
為了進一步分析細胞的分化和增殖，將細胞收集並重新懸於冷PBS中。然後，用Cytospin離心機將細胞轉移到玻片上進行吉氏染色。甲醇固定2min，吉姆薩染色液(Sigma)染色4min。載玻片轉移至磷酸鹽緩衝液中，用水衝洗。待載片完全幹燥後，滴入安裝液，覆蓋載片。顯微照片是在1000倍放大倍率下拍攝的。
在體外從pMXs-7TF mef分化NK細胞
從造血幹細胞中分化出NK細胞的過程基本上和前麵描述的一樣。簡單地說，將HSCs或pMXs-7TF mef接種於12孔板中，在含有10%熱滅活FBS、消炎美辛(2µg/ml, Sigma)、慶大黴素(20µg/ml)、SCF (30 ng/ml, PeproTech)、Flt3L (50 ng/ml, PeproTech)和IL-7 (0.5 ng/ml, PeproTech)的RPMI 1640培養基中培養7天，生成前體自然殺傷細胞(pNK)。然後收集pNK細胞，重新播種，在IL-15 (50 ng/ml, PeproTech)存在下培養6天，產生成熟的自然殺傷(mNK)細胞。采用抗cd3e和抗nk1.1抗體的流式細胞儀檢測mNK細胞的純度。
在體外pMXs-7TF mef的髓係分化
為了分化髓係細胞，將pMXs- 7tf mef和轉染pMXs控製載體的mef接種於12孔板中，並在添加10ng /ml IL6、10ng /ml GM-CSF、10ng /ml G-CSF、50ng /ml SCF、20ng /ml IL3和10ng /ml BMP4的RPMI 1640培養基中培養。兩周後，我們觀察到pMXs-7TF mef能夠分化為髓係。為了通過FACS分析骨髓標記物的表達，用抗mac -1和抗gr -1抗體對細胞進行染色。
細胞毒性分析
使用鈣鈣素- am釋放試驗(Invitrogen)評估NK細胞死亡，如前所述[29]。簡單地說，Yac-1細胞在5µg/ml鈣黃蛋白- am中培養1小時，37°C，偶爾搖晃。洗滌後，將細胞按指定的效應物:靶細胞(E:T)比例鍍於96孔圓底板中，在37°C下培養4小時。孵育後，收集100µl的上清液，使用熒光板閱讀器(激勵過濾器485 nm，發射過濾器530 nm, BerThold，德國)分析板。
調整分析
對於競爭性重組分析，MEF (CD 45.2+， 5 × 104)或LK細胞(CD45.2+， 5 × 104將pMXs-7TF mef或BM細胞與整個BM細胞混合(1 × 106C57BL/6 (CD 45.1)+老鼠)。然後將這些混合物靜脈注射到8周大的C57BL/6 cd45.1+同源小鼠接受致死γ輻射(9 Gy)。在連續骨髓移植(BMT)中，供體來源的骨髓細胞(3 × 106)被注射到第二組受體小鼠(cd45.1+16歲)th第一次BMT後一周。采集外周血，通過流式細胞儀(FACS)分析供者來源細胞的再生率。成功的pMXs-7TF mef移植是基於16歲時骨髓中供者來源的hsc陽性細胞的鑒定th第二次移植後一周。這些移植的受者被維持在特定的無病原體條件下。
統計分析
除非另有說明，數據以平均值±SD值表示。為了比較兩組，我們使用PRISM軟件(聖地亞哥)進行雙尾配對t檢驗。CA, USA)並使用Microsoft Excel進行雙尾配對學生t檢驗。p值小於0.05被認為是顯著的。
結果
重新編程mef以生成hpc
為了生成hpc，我們根據早期的基因表達序列分析(SAGE)數據集(補充圖1A)[30]的結果選擇候選基因。根據SAGE數據集，c-Jun (J)、Lmo2 (L)、c-Fos (F)、c-Myb (B)和c-Myc (M)在造血幹細胞中的表達高於自然殺傷(NK)細胞。已知這些tf在淋巴係的發展中起作用。為了證實這些tf在造血幹細胞(LKS細胞)中的表達增加，我們通過RT-PCR分析驗證了這些候選基因在造血幹細胞中的mRNA水平。如圖1B所示，與其他細胞類型如mef和pNK、mNK細胞和胚胎幹細胞(ES)細胞相比，這些基因在造血幹細胞中的表達水平增加。接下來，利用基於pmxs的逆轉錄病毒係統，將這些候選基因與包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc (OSKM)在內的多能相關基因結合應用於mef。流式細胞術分析顯示，rfp陽性的MEF細胞占細胞總數的90%以上(補充圖1C)，且每種基因在MEF中特異性過表達(補充圖1D)。
為了進行重編程，將MEF與候選基因一起轉導，並在長期缺乏白血病抑製因子(LIF)的HSC培養基(Myelocult, M5300)中培養MEF喂養細胞。LIF是一種化合物，在維持小鼠ES細胞[31]的自我更新中起著至關重要的作用。培養14 ~ 21 d後，取集落，在添加吲哚美辛、慶大黴素和SCF、Flt3L、TPO、IL-6等造血細胞因子的長期HSC培養基中，將其接種於MEF飼養細胞上。為了確保生成hpc，我們對菌落進行HSC標記染色，並通過FACS進行分析。總體方案如圖1A所示。測試候選基因的各種組合，以確定轉導的最佳基因(補充圖2A)。菌落的數量取決於哪些基因與OSKM結合。組合，如OSKML, OSKMF, OSKMB, OSKMLF, OSKMLB, OSKMFB, OSKMLFB誘導菌落形成(補充圖2B)。特別是，OSKMLFB組合產生了最多的菌落(補充圖2C)，並產生了一個獨特的LKS細胞種群(補充圖2D)。因此，我們選擇OSKMLFB組合(pMXs-7TF)作為最優重編程條件。圖1B顯示了對照mef (pMXs)、pMXs- 7tf mef和原始造血幹細胞的形態。 The pMXs-7TF MEFs exhibited a round morphology that was similar to that of primitive HSCs. Transduction with pMXs-7TF increased the number of formed colonies compared to transduction with pMXs (Figure 1C). Next, to define the emergent hematopoietic cells, we examined the time-course of gene expression during pMXs-7TF MEFs generation. After transduction, the cells were harvested at the indicated times, and HSC marker expression was analyzed via qPCR. The expression of fibroblast-specific genes, such as Vim and Acta2, decreased gradually (Figure 1D and supplementary figure 3A), but the expression of HSC-specific markers, including c-Kit, Sca-1, CD150, CD45, Il3ra and Csf3r [20], increased in cells transduced with pMXs-7TF (Figure 1E and supplementary figure 3B). Western blot analysis confirmed that c-Kit and CD150 were highly expressed in the pMXs-7TF MEFs compared with the control pMXs-transduced cells (Figure 1F).
圖1:利用七個因素將mef重新編程為HPCSs。(一)pMXs-7TF mef重編程過程的示意圖。mef感染逆轉錄病毒共3天。第一天後，病毒感染的MEF被重新播種到絲裂黴素c處理的MEF飼養細胞上。細胞在添加多種造血細胞因子的骨髓培養長期培養基中培養。14 ~ 21 d後，取菌落重新播種於24孔板中。(B)亮場顯微照片顯示轉導了pMXs控製載體或pMXs- 7f載體和造血幹細胞的細胞形態。在pmxs - 7f處理的細胞中檢測到小圓形細胞(白色箭頭)。原始放大倍數:200X和320X。(C)用七轉錄因子表達(pMXs- 7tf)載體或pMXs對照載體轉導mef。感染後14 ~ 21天計數菌落數。誤差條表示sd (n=3);*p與pmx轉導的mef相比<0.05。(D)成纖維細胞相關基因(Vim和Acta2)在pmxs - 7tf轉導的mef中的相對表達水平。轉導的MEF或菌落在MEF飼養細胞上重新播種後的0-6周(W)收割。用qPCR檢測靶基因表達，歸一化至GAPDH表達水平。以造血幹細胞作為對照。(E)用七個轉錄因子表達載體(pMXs-7TF)轉導mef。轉導後，在指定的時間收集細胞，並分析HSC標記的表達。以造血幹細胞或胚胎幹細胞作為對照。用qPCR檢測靶基因表達，歸一化至GAPDH水平。所有實驗都獨立重複至少三次，誤差條表示sd。(F)HSC標記物表達的時間過程分析。Western blot檢測c-Kit、CD150和β-actin的表達。(-)表示pmxs控製載體轉導細胞;(+)表示pmxs - 7tf轉導細胞。
圖2:pMXs-7TF mef的多功能能力在體外．(一)為了探索細胞向NK細胞分化的能力，將HSCs或pMXs- 7TF mef與絲裂黴素c處理的OP9細胞在Flt3L、SCF和IL-7的存在下共培養6天。6天後，為了生成mNK細胞，將細胞在IL-15的存在下培養6天。然後用抗cd3和抗nk1.1抗體對細胞進行染色。通過FACS分析確定CD3e-NK1.1+亞型的表型。評估NK細胞在門控淋巴細胞群中的百分比。以造血幹細胞為陽性對照。(B)來自pMXs-7TF mef或pmxs轉導mef的mNK細胞的細胞毒性。將mNK細胞按指示的E:T比(10:1、5:1、2.5:1或1.25:1)孵育在鈣黃素am標記的Yac-1細胞中。4小時後，收集上清液，使用熒光板閱讀器(485 nm激發，530 nm發射)檢測培養皿。所有實驗都獨立重複至少三次。(C)誘導pMXs-7TF mef的髓係分化在體外， pMXs-7TF mef在含有多種細胞因子的髓係培養基中維持。兩周後，用抗mac -1和抗gr -1抗體對細胞進行染色，並通過流式細胞術進行分析。(D)CFC圖像和來自pmxs - 7tf轉導細胞的CFU形成的相對頻率。左圖顯示了CFU-E、CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM菌落的圖像。原始放大:40 x。右邊的麵板顯示了菌落形成的相對頻率。給出了三個獨立實驗的代表性結果。(E)第14天對pMXs-7TF MEFs衍生的Methocult菌落進行吉氏染色。原來放大:1000 x。(F-H)流式細胞術測定細胞群分化狀態。紅色的細胞(F)骨髓細胞(G)14天後，采集Methocult菌落，並用係係特異性抗體染色。
為了驗證多能性的承諾，我們檢查了多能性標記在指定的時間點的表達模式。Oct4、Sox2和Klf4的總表達水平隨時間的推移而下降，在pMXs-7TF mef和HSCs中高表達的c-Myc表達水平升高(補充圖4A)。在pMXs-7TF mef中，Oct4和Sox2的內源性表達低於ES細胞(補充圖4B)。作為多能細胞標記的Nanog和E-Ras在pMXs-7TF mef中以基礎水平表達(補充圖4C)。綜上所述;這些結果表明，pMXs-7TF mef重編程過程不需要產生iPS細胞。
為了進一步分析細胞表型，我們檢測了轉導細胞的表麵抗原表達。LKS細胞、長期HSC、短期HSC和MPP (CD34 .+Flk2+CD150-CD48因子-LKS)細胞群在來自個體菌落的pMXs-7TF mef中檢測到。如補充圖5A-5B所示，Sca-1，而不是c-Kit，在與pMXs控製載體轉導的mef中表達。Sca-1在多種細胞中表達，包括間充質幹細胞、心肌細胞和成纖維細胞[32,33];這種廣泛的表達解釋了在pmx轉導的細胞中檢測到Sca-1。盡管pMXs-7TF mef中的表麵抗原表達與原始造血幹細胞中的不完全相同，但pMXs-7TF mef明顯包含LKS細胞群。接下來，我們進行qPCR比較pMXs-7TF mef、HSCs和ES細胞之間的基因表達譜(補充圖5C)。這些HSC標誌物在pMXs-7TF mef中的表達水平與HSCs中的表達水平相似。接下來，我們進行RT-PCR分析。如補充圖5D所示，在HSCs中高表達的HSC表麵標記物，如c-Kit、Sca-1、CD150和CD34，以及在我們的pMXs-7TF mef和HSCs中強表達的tf，如c-Jun、Lmo2、c-Fos、c-Myb和Trim28。Nanog在pmxs - 7tf轉導的細胞中不表達。 In addition, the protein levels of these factors were verified via Western blot analysis. As expected, c-Kit and CD150 were expressed in the pMXs-7TF MEFs (Supplementary figure 5E), and these results were verified via immunocytochemistry using antibodies against SSEA (a pluripotent cell marker), c-Kit and Sca-1 (Supplementary figure 5F). The HSC surface markers c-Kit and Sca-1 were highly expressed in pMXs-7TF MEFs and HSCs, but SSEA was not expressed in pMXs-7TF MEFs. Taken together, these results demonstrated that pMXs- 7TF MEFs display similar molecular characteristics to primitive HSCs. To determine whether these pMXs-7TF MEFs continually expand and maintain their HSC properties在體外， pMXs-7TF mef在長期HSC培養基中培養2個月。我們發現培養兩個月後LKS細胞數量仍然存在(補充圖5G)。
差異化潛力評估在體外
接下來，我們通過測量pMXs-7TF mef分化為淋巴係和髓係的能力來檢測其多能性。為了證實淋巴係分化，我們用兩步法從pMXs-7TF mef中生成NK細胞在體外差異化協議[34]。如圖2A所示，pMXs-7TF mef可分化為CD3e-NK 1.1+mNK細胞，正如已經觀察到的原始造血幹細胞，這些細胞對其他NK細胞標記物呈陽性，如DX5(補充圖6A)[35]。然後，我們檢測了pMXs-7TF mef衍生的mNK細胞的細胞毒性。來自pMXs-7TF mef的mNK細胞(補充圖6B)顯示出對Yac-1腫瘤細胞的細胞毒性活性，而pmx誘導的細胞沒有顯示出這種活性(圖2B)。接下來，為了驗證pMXs-7TF mef向髓係分化，將細胞培養在含有多種細胞因子的分化培養基中，包括IL6、GM-CSF、G-CSF、SCF、IL3和BMP4。兩周後，我們觀察到pMXs-7TF mef分化為Gr-1+Mac-1+髓係譜係(圖2C)。為了確定pmxs - 7tf轉導細胞的特定造血潛能，我們使用添加了重組細胞因子(M3434)的甲基纖維素培養基進行了CFC試驗。從pMXs-7TF mef中成功衍生出紅係集落形成單元(CFU-E)、粒細胞巨噬細胞集落形成單元(CFU-GM)、紅係爆發形成單元(BFU-E)和粒細胞-紅細胞-巨噬細胞集落形成單元(CFU-GEMM)集落(圖2D)。基於CFC實驗得到的菌落用Giemsa染色，大多數菌落形成細胞表現出粒細胞和巨噬細胞譜係特征(圖2E)。為了進一步驗證這些譜係的身份，我們用針對Mac-1和GR-1(髓係，圖2F)、Ter119(紅係，圖2G)和B220(淋巴係，圖2H)的抗體對基於CFC試驗獲得的菌落進行染色。我們發現這些細胞表達髓係和紅係標記。這些結果證實了pmxs - 7tf - mef的集落形成潛力和多世係分化能力。
pMXs-7TF mef的功能特性在活的有機體內
造血幹細胞在移植到接受骨髓切除術的受者體內時，對造血重建至關重要[3,36,37]。為了研究這些pMXs-7TF MEF再生造血係統的能力，我們將重組細胞培養在MEF飼養細胞上。2-3周後，pMXs-7TF mef (CD45.2+)或BM (HSC, CD45.2+)與同源競爭對手(BM, CD45.1+)轉化為γ輻照致死性同基因小鼠(CD45.1+)．16周後，我們通過FACS分析重組細胞群(圖3A)。為了驗證供者來源細胞在血液中的植入，我們在移植後5周、9周和12周收集外周血。與bm來源的LK細胞(HSC)相似，pMXs-7TF mef來源的LK細胞(pMXs-7TF)顯示出在外周血中的重建能力(圖3B-3C)，以及供者來源的CD45.2+在移植受體小鼠的BM中檢測到LKS細胞群。此外，供體來源(CD45.2+)免疫細胞，包括NK細胞、T細胞和B細胞在受體小鼠中觀察(圖3D和補充圖7A)。
為了證實這些細胞的重建特性，將pMXs-7TF mef移植到Rag2/ ii2g雙敲除小鼠中，其中不含可檢測到的NK1.1+NK細胞或Thy1+T細胞[38]。移植後9周，NK1.1+DX5+NK + CD4+CD8+在pMXs-7TF MEFs和hsc -移植受體小鼠的脾髒中觀察到T細胞(圖3E和補充圖7B)。先前的報道表明，10月4日可以誘導來自人成纖維細胞的血液祖細胞的直接轉化，這些細胞可以分化為髓係細胞，但不能分化為淋巴細胞[19]，我們檢測了骨髓係細胞在移植自pMXs-7TF mef或BM細胞的LK細胞(CD45.2)的受體小鼠(CD45.1)中的存在。我們發現CD45.2+Gr-1+Mac-1+骨髓係細胞存在於受體骨髓中(圖3F和補充圖7C)。這些數據表明，pMXs-7TF mef具有分化為淋巴係和髓係的潛力。
為了證實這些pMXs-7TF mef再生造血係統的能力，我們進行了一係列BMT。LK細胞來自pMXs-7TF mef (CD45.2+)或BM (HSC, CD45.2+)與同源競爭對手(BM, CD45.1+)轉染致死性輻照同基因小鼠(CD45.1+在第一次骨髓移植後的16周，從受體的供者來源的骨髓移植細胞被注射到二次受體小鼠(cd45.1+)(圖4)。每次BMT後16周，采集外周血(PB)，通過FACS分析供體來源細胞的再生百分比(圖4B和補充圖8A)。第二次BMT後16周，我們通過FACS分析重組細胞群。首先，為了驗證血液中供者來源細胞的植入，我們在移植後4、8、12和16周收集了PB(圖4C和補充圖8B)。與BMderived LK cells (HSCs)類似，pmxs - 7tf - mefs - LK細胞通過PB中B細胞和髓係細胞的程度表現出多譜係重構(圖4D-4E和補充圖8C)。此外，供體來源的CD45.2+在移植受體小鼠的BM中檢測到HSC種群(圖4F和補充圖9A)。Donor-derived (CD45.2+)免疫細胞，包括NK細胞、T細胞、B細胞和髓係細胞(圖4G，補充圖9B和9C)。這些數據表明，pMXs- 7TF mef具有分化為淋巴係和髓係的潛力。
圖3:pMXs-7TF mef的多功能能力在活的有機體內．(一)競爭性重建分析的實驗設計。輻照後的同源CD45.1小鼠按5 × 10的比例移植5LK細胞來自供體來源的BM (CD45.2)或pMXs-7TF mef (CD45.2)與競爭細胞(CD45.1, 1 × 106)．16周後，通過FACS分析測定供體來源的LKS、NK、T和B細胞的頻率。(B)在骨髓移植後5周、9周和12周采集外周血，測定供者來源細胞的百分比。誤差條表示sd (n=4)。(C)采用流式細胞術分析外周血供者來源細胞(CD45.2+)。(D)Donor-derived (CD45.2+)受體BM中的LKS、NK、B或T細胞(CD45.1+)移植後16周。誤差條表示sd (n=4)。與pMXs控製載體轉導的mef相比，*p<0.05， **p<0.01。；參見補充圖7。(E)pMXs-7TF mef移植到Rag2 KO小鼠體內。9周後，處死野生型小鼠(C57BL/6J, WT)、Rag2 KO小鼠(pMXs)和HSC移植小鼠(HSC)或pMXs- 7tf MEFs移植小鼠(pMXs- 7tf MEFs) Rag2 KO小鼠，采用FACS分析。左邊是NK細胞，右邊是T細胞。；參見補充圖7。誤差條表示sd (n=3)。從三個重複實驗之一的代表性結果顯示。(F)確認骨髓細胞群的生成在活的有機體內，我們驗證了CD45的存在+GR-1+Mac-1+供體來源細胞中的細胞群。LK細胞(5 × 105)從iHSCs或BM細胞移植到致死性輻照的同源小鼠(CD45.1)。9周後，供者來源的髓樣細胞(CD45.2+)在受體的外周血(CD45.1+)．；參見補充圖7。誤差條表示sd (n=3)。
圖4:pMXs-7TF mef的串行BMT。(一)串聯BMT法的實驗設計。輻照後的同源CD45.1小鼠按5 × 10的比例移植5LK細胞來自供體來源的BM (CD45.2)或pMXs-7TF mef (CD45.2)與競爭細胞(CD45.1, 1 × 106)．第一次骨髓移植後16周，供體來源的骨髓幹細胞(3×106)被注射到第二組受體小鼠(cd45.1 +)。(B)第一次BMT和第二次BMT後16周收集PB，以確定供體來源細胞的百分比;參見補充圖8。(C)為了驗證血液中供者來源細胞的植入，我們在二次BMT後4、8、12和16周收集了PB。(d e)二次BMT後16周PB指示種群的重建。供體嵌合率以供體細胞百分比表示。(做減法)Donor-derived (CD45.2+)受體BM中的HSC群體、NK、T、B和髓係細胞(cd45.1+)第二次BMT試驗後16周;參見補充圖9。誤差條表示sd (n=3)。與HSC比較，*p<0.05， **p<0.01
hCD34在小鼠lt -造血幹細胞中的表達
為了進一步證實pMXs-7TF- mef的重編程能力，我們使用了攜帶hCD34位點和12.8 kb的5 '和25.6 kb的3 '側區的轉基因(tg)小鼠，這是在LT-HSCs[27]中專門指導hCD34表達所必需的，從而可以根據hCD34的表達來監測pMXs-7TF mef的再生。從hCD34 tg小鼠中獲得的mef用攜帶候選基因10月4日Sox2、Klf4、c-Myc、LMO2、c-Fos和c-Myb的逆轉錄病毒轉導。從hCD34 tg衍生的mef中獲得pMXs-7TF mef後，分析HSC標記的表達。如補充圖10A所示，hCD34+在LT-HSC人群中觀察到細胞。然後進行qPCR和RT-PCR驗證hCD34和HSC標記基因的表達。如預期的那樣，c-Kit、Sca-1、CD150和hCD34在pmxs - 7tf轉導的細胞中高度表達;然而，hCD34在pmx轉導的野生型或hCD34 tg mef、ES細胞或造血幹細胞中不表達(補充圖10B和10C)。這些結果證實了pMXs-7TF mef在hCD34基因表達方麵與原始造血幹細胞相似。
討論
在本研究中，我們證實了mef可以通過表達Lmo2、c-Fos、c-Myb、Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc轉化為小鼠hpc。首先，重組的pMXs-7TF mef表達HSC表麵標記物，如c-Kit和Sca-1，並產生可檢測的長期HSC、短期HSC和MPP細胞群。其次，維持pMXs-7TF的mef在體外期的延長。為確定pMXs-7TF mef是否能長期擴增，將pMXs-7TF mef在添加造血細胞因子的Myelocult長期培養基中進行培養。兩個月後，我們觀察到LKS細胞群仍然存在於pmxs - 7tf轉導的細胞中。第三，pMXs-7TF mef的基因表達譜與原始造血幹細胞幾乎相同。在造血幹細胞中高表達的造血幹細胞表麵標記(c-Kit, Sca-1, CD34和CD150)和轉錄因子(c-Jun, Lmo2, c-Fos, c-Myb, c-Myc和Trim28)在pmxs - 7tf轉導的細胞中強烈表達，盡管多能細胞標記SSEA, Nanog和E-Ras在這些細胞中檢測不到。第四，pMXs- 7TF mef表現出多譜係分化的潛力在活的有機體內而且在體外．當pMXs-7TF mef被注射到致死性輻照的同源或免疫缺陷小鼠時，它們表現出強大的重建能力。此外，pMXs-7TF mef分化為淋巴係和髓係，具有不同的功能。綜上所述，這些結果表明，pMXs-7TF mef可以使用特定的基因進行重編程，而不需要產生iPS細胞，這些pMXs-7TF mef顯示了hpc的表型和功能特征。
根據SAGE數據集，c-Jun、Lmo2、c-Fos、c-Myb和c-Myc在造血幹細胞中的表達有選擇性地升高。這些轉錄因子是調節造血幹細胞自我更新和分化潛能等特性所必需的。c-Myc是造血幹細胞分化和存活的重要轉錄因子之一[39,40]，調節造血幹細胞[41]的自我更新和分化之間的平衡。Lmo2和c-Myb對造血幹細胞的發育至關重要[42-44]，特別是Lmo2對於促進胚胎成纖維細胞[23]的造血命運是必要的。c-Fos是AP-1轉錄因子的一個成員，在與c-Jun蛋白的複合物中調節AP-1結合基因[45]的表達。AP-1轉錄因子在造血前體細胞向成熟血細胞的發育過程中起著多重作用，包括粒細胞單核細胞和紅係細胞[46,47]。c-Fos在造血幹細胞[48]中高度表達，對造血幹細胞的細胞生長和G0/G2過渡非常重要。根據最近的研究，c-Fos促進內皮和造血基因[20]的表達。在目前的研究中，我們發現了hsc特異性轉錄因子的組合，在Oct4, Sox2和Klf4存在的情況下，誘導mef轉化為HPCs。
綜上所述，hscs特異性轉錄因子如Lmo2、c-Fos、c-Myb和多能相關基因如Oct 3/4、Sox2、Klf4、c-Myc的結合可誘導多能iHSCs由mef直接轉化。目前的研究表明，造血幹細胞具有分化為免疫細胞和造血功能的潛力在活的有機體內．從患者自身體細胞中成功生成體外造血幹細胞將促進多種疾病的治療，並可用於替代造血幹細胞。該方法將加速體外造血幹細胞作為患者特異性造血幹細胞再生的平台技術在臨床的應用。
確認
作者非常感謝Daniel G. Tenen(哈佛醫學院)提供的hCD34轉基因小鼠。這項工作部分得到了研發融合計劃(R&D convergence Program)的研究資金支持。NST的CRC- 15-02-KRIBB)， GRL項目(FGM1401223)，科學、ICT和未來規劃部，韓國衛生技術研發項目(A121934)，韓國衛生和福利部，以及KRIBB研究倡議計劃，韓國。
作者的貢獻
H.Y.S.設計了實驗並撰寫了論文。H.Y.S、H.W.S、Y.K.K、W.K.和s.y進行了實驗。E.L.產生了hCD34轉基因小鼠。e.l.、h.j.、S.R.Y、t.d.k.和Y.J.P.提出了批評意見。I.C.監督了這個項目並撰寫了論文。
利益衝突披露
作者聲明沒有競爭的經濟利益。
