摘要

摘要目的:

驗證人類和犬牙齦間充質幹細胞具有相似的幹細胞特性，而低強度脈衝超聲(LIPUS)增強了這些特性的假設。

方法:

將人、犬牙齦間充質細胞(HGMCs和CGMCs)分離、擴增後分為2個亞組，1個亞組給予LIPUS處理20 min，另1個亞組作為對照組。LIPUS使用的超聲設備產生的空間平均時間平均強度為30 mW/cm²．脈衝為1.5 MHz，脈衝重複頻率為1 kHz。24 h後采集細胞，流式細胞術檢測幹細胞標記CD11b;CD14;CD34;CD45;CD73;CD90和CD105。同時，細胞也在常規的Alpha DMEM或成骨培養基中培養。進行堿性磷酸酶、DNA和MTT分析。

結果:

流式細胞術分析顯示，對照組和LIPUS處理的犬CGMCs僅CD90部分陽性，其餘幹細胞標記均為陰性。然而，與非LIPUS治療的cgmc相比，LIPUS治療的CD90表達降低了(5%)。另一方麵，HGMCs的CD73、CD90和CD105表達高於CGMCs。此外，LIPUS增強了這些幹細胞標記物在HGMCs中的表達。MTT在普通或成骨培養基中均升高，而在成骨培養基中僅在CGMCs中升高。在有或沒有應用LIPUS的成骨培養基中培養，HGMCs的ALP顯著增加。在DNA表達方麵，cgmc和hgmc沒有區別。

結論:

與CGMCs相比，無論是否應用LIPUS, HGMCs均表現出更強的多能潛能，特別是當其在成骨培養基中培養時。

關鍵字

牙齦幹細胞;低強度脈衝超聲;小獵犬的狗;人類

簡介

近幾十年來，牙麵領域的研究主要集中在幹細胞治療和組織工程兩個方麵。幹細胞治療和/或組織工程需要足夠數量的幹細胞來治療有缺陷的組織或器官，或用於組織工程化丟失或有缺陷的器官。幹細胞治療和/或組織工程的挑戰之一是幹細胞資源的可用性。近年來，在顱麵組織工程[1]中，牙齦幹細胞已被研究為替代骨髓間充質細胞的來源。近年來，與其他幹細胞來源相比，齦幹細胞由於其可用性和分離技術無太大侵入性，在使用細胞治療或組織工程進行顱麵再生方麵受到了極大的關注[1-5]。已有研究表明，機械應力可誘導不同類型細胞產生生物學效應[6,7]。低強度脈衝超聲(LIPUS)是機械應力的一種形式，近年來對其在人顱麵區的再生潛力進行了廣泛的研究。LIPUS已被證明對不同類型的細胞有合成代謝作用，包括骨成膜細胞、牙周韌帶細胞、牙齦細胞、皮膚成纖維細胞、肌肉細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、骨膜細胞、骨髓幹細胞和人臍帶來源的間充質幹細胞[2-4,8-22]。目前，超聲對Beagle犬牙齦幹細胞的影響尚未見報道。轉譯研究假設，當人類患者經曆類似的治療方式時，動物實驗結果反映在人類身上。 In reality, there are many differences in treatment responses between animals and in human. Therefore, it is not usually expected that a positive treatment outcome in animals would produce similar effect in human. For this particular reason. The aim of this study was to compare the effect of LIPUS on canine (Beagle dogs) and human gingival stem cells.

材料和方法

比格犬和人類牙齦細胞

齦間充質幹細胞分離自7隻比格犬(CGMCs)和其他10名人類患者(HGMCs)。從比格犬的牙齦中分離cgmc是作為加拿大埃德蒙頓阿爾伯塔大學先前批準的動物護理方案的一部分進行的。此外，根據阿爾伯塔大學批準的人類倫理協議，從人類牙齦組織中分離牙齦幹細胞。分離牙齦間充質幹細胞的方法已有報道[2,6]。細胞分別用MEM Alpha培養基(Alpha MEM: 450 ml，胎牛血清(FBS): 50 ml，青黴素/鏈黴素:5 ml, HEPES: 10 mmol)或成骨培養基(DMEM: 450 ml，胎牛血清(FBS): 50 ml，地塞米鬆:10 nM, b -甘油磷酸酯:10 mmol，抗壞血酸:50 mg/l, HEPES: 10 mmol，青黴素/鏈黴素:5 ml)處理，並用LIPUS或不使用LIPUS處理。細胞在37°C和5% CO培養₂然後擴展10天至P4，每3-4天更換一次培養基。所有的測定在三個不同的孔中進行了三次，每次測定共9個讀數。組間比較采用單因素方差分析，土耳其采用SPSS (Version 22)統計包(SPSS, Chicago, IL, USA)進行事後比較。

LIPUS治療

細胞擴增後，將細胞播種於12孔板上，播種後1天，LIPUS處理20分鍾，持續1天。LIPUS使用定製的LIPUS設備(SmileSonica公司，埃德蒙頓，加拿大)，產生1.5 MHz脈衝，脈衝重複頻率為1 KHz，強度為30 mW/cm²換能器表麵積的。使用超聲凝膠(SmileSonica Inc.， Edmonton, Canada)從培養箱的下方和內部將LIPUS應用於細胞培養板。

細胞生存能力

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)測定法如前所述用於評估細胞活力[2,21]。簡單地說，在每個含有0.5 ml基本培養基(杜爾貝科改良鷹培養基(DMEM)、100 U/ml青黴素和100 mg/ml鏈黴素(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的細胞孔中加入100 ml MTT溶液(以5 mg/ml溶解在漢克平衡鹽溶液(HBSS)中)。

2小時後，用2ml二甲基亞碸取代培養基，溶解形成的MTT福馬讚晶體。然後，在570 nm處量化吸光度，並用於評估細胞活力[2,23]。

流式細胞術免疫表型分析

為了鑒定HGMCs或CGMCs的細胞表麵標記物，采用fitc標記抗體CD11b、CD14、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105，通過流式細胞術分析[24]檢測相應結合位點的存在。CD14和CD11b在單核細胞和巨噬細胞上顯著表達，單核細胞和巨噬細胞是MSC培養中最可能發現的細胞，cd34 - r -藻紅素(它標誌著原始造血祖細胞和內皮細胞)，CD45-藻紅素(是泛白細胞標記物)，CD73(被稱為ecto 5 '核苷酸酶，最初被單抗SH3和SH4識別)，CD90 (Thy1) r -藻紅素和cd105(被稱為內溶素，最初被單抗SH2識別)[24](R-PE, BD Bioscience, Mississauga, on，加拿大)。fitc偶聯同型-小鼠IgGa1和pe偶聯同型-小鼠IgGk1作為第二抗體(對照抗體)。采集10000個標記細胞，使用運行Cell Quest軟件的FACS流式細胞儀(Becton Dickinson, Mississauga, ON, Canada)進行分析。

高山/ DNA化驗

ALP是一種膜結合酶，在礦化開始前活性最高，是成骨/成骨細胞分化的生化標記物[2,21,22]。用HBSS洗滌細胞，用ALP緩衝液(0.5 M 2-氨基-2-甲基丙烷-1-醇和0.1% (v/v) Triton X-100溶解細胞;pH值10.5)。裂解一小時後，將100ml裂解溶液(一式兩份)添加到96孔板中，並將100ml 2mg /ml ALP底物對硝基苯酚磷酸鹽(pNPP) (Sigma, St.Louis, MO)添加到裂解細胞中，使最終濃度為1mg /ml pNPP。在405 nm處周期性間隔測量吸光度，持續時間長達20分鍾。根據形成的p-NPP產物(對硝基苯酚;以mmol/min/ml)，與DNA含量歸一化，得到特定的ALP活性(ALP/DNA)。根據製造商的說明，使用CyQUANT DNA試劑盒(Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)測定裂解物的DNA含量。用CyQUANT試劑盒自帶的DNA標準品進行校準，並測定各組細胞的DNA濃度。使用熒光平板閱讀器(美國維諾斯基BioTek儀器公司生產的ELx 800通用平板閱讀器)定量DNA(激發波長為480 nm;發射在527 nm)。

結果

LIPUS對細胞活力的影響

采用MTT法評價LIPUS對CGMCs和HGMCs活力的影響。造骨培養基中使用LIPUS後，cgmc和hgmc的MTT吸光度均顯著增加(P<0.005)。然而，當CGMCs與Alpha培養基處理時，LIPUS的MTT吸光度沒有表現出任何差異。相比之下，LIPUS顯著增加了HGMSCs的MTT吸光度(P=0.031)(圖1A和B)。與CGMCs相比，hgmmcs在所有組中MTT值均有統計學意義更高(圖1C)。

LIPUS對細胞標記物表達的影響

與具有幹細胞標記的門控標記細胞的比例(CD73、cd90、CD105、CD11b、CD14、CD34和CD45)表現出與幹細胞類似行為的HGMCs相比，CGMCs不表現出CD73或CD105的+ve表達。然而，CGMSCs與HGMSCs在所有其他標記的表達上相似。在cgmc中(圖2A和2B)， LIPUS不影響對CD11b、CD14、CD34、CD45、CD73或CD105的-ve反應。而LIPUS則使CD90標記的門控cgmc的平均百分率降低5% (P<0.05)。另一方麵，LIPUS增加了標記CD73 (P<0.005)、CD90和CD105 (P<0.001)的平均門控hgmc (P<0.001)(圖2b)。

LIPUS對ALP/DNA的影響

HGMCs與CGMCs的比較顯示，與HGMCs相比，CGMCs的ALP、DNA和ALP/DNA比值均顯著降低(圖3A、3B和3C)。LIPUS降低了成骨培養基中HGMCs的ALP和ALP/ DNA比值，差異不顯著(圖3A和3C)。此外，LIPUS沒有改變α或成骨培養基中CGMCs中的ALP和DNA濃度(圖3A和3B)。盡管LIPUS增加了cgmc中的ALP/DNA比值，但這種增加在統計學上並不顯著(圖3C)。

圖1:CGMCs在α和成骨培養基中MTT吸收的比較。* * * = P < 0.001。

圖1 b:CGMCs在α和成骨培養基中MTT吸收的比較。* * * = P < 0.001。

圖1 c:α和成骨培養基中CGMCs和HGMCs MTT吸收的比較。* * * = P < 0.001。

圖2:應用LIPUS前後hgmc的流式細胞術比較。** = p <0.005， *** = p <0.001。

圖2 b:應用LIPUS前後CGMCs的流式細胞術比較。* = P < 0.05。

討論

雖然已經有假設認為人類牙齦成纖維細胞可能用於細胞治療和組織工程，但研究這些細胞的細胞表麵標記，以便將其視為間充質幹細胞是合乎邏輯的。雖然已有報道表明這些細胞具有一些幹細胞表麵標記[4]，但這些標記還需要進一步研究，以確認或放棄將其歸類為潛在的幹細胞。已有研究表明LIPUS對人牙齦成纖維細胞[2]有合成代謝作用。然而，目前尚不清楚LIPUS是否會改變CGMCs和HGMCs中的這些幹細胞表麵標記物。因此，我們的研究目的是測試LIPUS對HGMCs的影響。此外，在轉化研究中，像比格犬這樣的高等動物被認為是臨床前實驗的理想動物模型。因此，了解CGMCs是否具有幹細胞標記以及LIPUS對這些幹細胞表麵標記的影響也很重要。我們的研究首次評估了CGMCs中的間充質幹細胞標記物以及應用LIPUS對這些標記物、細胞活力(通過MTT評估)和ALP、DNA活性/濃度的影響。細胞活力測定顯示LIPUS增加了HGMCs和CGMCs的MTT吸收。這反映出LIPUS對這兩種細胞類型都沒有顯示出任何有害作用。 This is in agreement with previous studies [2,11-15,19,26,27]. Our study showed that beagle dogs’ gingival mesenchymal cells lack the expression of CD73 and CD 105. Previous position paper reported that in order to identify cells as mesenchymal stromal cells and have pluripotent characteristics, these cells must be expressing CD73, CD90 and CD105 more that 95%. The lack of expression of CD73, CD105 by CGMSCs suggest that CGMCs cells cannot be identified or considered as potential stem cells as they fail to have these important criteria. In addition, CGMCs expression of CD 90 was 50% without LIPUS and 45% with LIPUS. Regardless the decreased CD90 expression by LIPUS in CGMCs, these cells at the current time may not be considered as stem cells. Also, HGMCs, although showed expression of CD73, CD90 and CD105, these markers expression in our study was lower than 95%. Although LIPUS increased CD73, CD90 and CD105 expression, one LIPUS application did not increase the expression of these markers to the 95% level that can make these cells considered as stem cells. Future studies may be aimed at changing LIPUS parameters in order to increase the expression of these markers to the 95% level. It is to be noted that previous study showed an anabolic effect of LIPUS on human gingival fibroblasts, this anabolic effect was noted mainly after 3-4 weeks [2]. In our study, LIPUS application was for one time only based on other previous studies that applied LIPUS to different cells for one application [14,26,27]. Future studies may evaluate these effects on longer effect on both types of cells. Our results also showed no effect of ALP, DNA or ALP/ DNA ratio. This is in agreement with previous studies during the first week of their studies [2,13]. Future studies may be conducted to evaluate these effects on long term basis (1,2,3 and 4 weeks) with different LIPUS application times (5,10,15 and 20 minutes).

圖3:應用LIPUS前後α和成骨培養基中CGMCs和HGMCs ALP測定的比較。* * * = P < 0.001。

圖3 b:應用LIPUS前後α和成骨培養基中CGMCs和HGMCs DNA測定的比較。* * * = P < 0.001。

圖3 c:應用LIPUS前後α和成骨培養基中CGMCs和HGMCs ALP/DNA比值的比較* * * = P < 0.001。

結論

對於短期應用，LIPUS增強了常規和成骨培養基中HGMCs的細胞活力，僅在成骨培養基中。LIPUS在HGMSCs的人類幹細胞標記物中表達增加，而在GMCs唯一陽性的幹細胞標記物(CD90)中表達減少。cgmc的成骨分化潛力低於hgmc。

確認

本研究由卡塔爾國家研究基金# NPRP09- 557-3-144資助。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:El-Bialy T, Kucharski C, Farid M, Ghaffar KA, Fawzi E, et al.(2015)人和狗的牙齦幹細胞是不同的。Int J Stem Cell Res 1(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2472-6990.103

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出版的曆史:

收到日期:2015年6月24日

接受日期:2015年7月15日

發表日期:2015年7月22日