摘要

背景

據報道，透明質酸(HA)為基礎的水凝膠在齧齒類動物模型移植後可以提高幹細胞存活率。在此，我們在一個大型動物模型中測試了在HA-血清水凝膠(通過自體血清交聯HA合成)中封裝MSCs的效果。我們在豬慢性心肌缺血模型中進行了當前的研究，將含有和不含水凝膠的間充質幹細胞注入慢性缺血心肌，以比較移植後幾個時間點的細胞存活情況。

方法

將自體間充質幹細胞注入或不注入水凝膠，分別注入缺血區域內的標記區域(4周前在旋左動脈近端周圍應用ameroid縮窄器形成)。分別於細胞移植後2、4、6、12周處死動物，進行組織病理學檢查。

結果:

與沒有水凝膠注射的區域相比，水凝膠包裹的MSCs移植在短期內促進了移植細胞在注射區域的保留，並刺激了血管生成。值得注意的是，盡管注入的水凝膠中MSCs分散均勻，但MSCs仍從水凝膠中分離並遷移到周圍心肌。這表明，一旦注入骨髓間充質幹細胞，對宿主組織有更強的親和力。

結論

在大型動物模型中，ha -血清水凝膠包裹的MSCs在心肌移植早期增強了心肌細胞的保留，並促進了血管生成。基於這些結果，為了優化ha -血清水凝膠在細胞基礎治療中的應用，有必要進一步研究經壁梗死心肌的囊化細胞傳遞。

關鍵字

水凝膠;間充質幹細胞;慢性心肌缺血

簡介

間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)在實驗動物研究和臨床心肌缺血或梗死患者中被廣泛用於改善心功能的細胞治療[1-6]。然而，移植後細胞保留和存活的問題仍然是細胞基礎治療的主要障礙。人們的努力集中在幹細胞基因操作[7,8]或利用水凝膠[9-12]等材料，目的是增加移植後的細胞存活和歸巢。

透明質酸(HA)是心肌細胞外基質的主要成分之一。細胞通過細胞表麵受體CD44和CD168與HA結合，這兩種受體在細胞粘附和運動中起重要作用[10-12]。HA降解產物在血管生成[10]中發揮作用，這是心髒再生的機製之一。HA的羧基用n -羥基琥珀酰亞胺(NHS)修飾得到HA-NHS基團。這些HA-NHS基團與血清中的胺基團以及細胞和組織發生反應，形成酰胺鍵。水凝膠誘捕幹細胞並粘附在組織上。血凝素:血清水凝膠可用於幹細胞移植到心髒通過心肌內注射或心外膜應用。我們之前的工作表明，透明質酸(HA)水凝膠增強了移植後的幹細胞在齧齒類動物模型的存活。本研究通過將含有和不含水凝膠的骨髓間充質幹細胞注射到豬模型慢性缺血心肌中，測試了將骨髓間充質幹細胞包封在HA-血清水凝膠(HA與自體血清交聯合成)中的效果，目的是評估移植幹細胞在移植後幾個時間點的存活情況

材料和方法

動物

實驗方案得到了國家心髒，肺和血液研究所動物護理和使用機構委員會的批準，調查符合實驗動物的護理和使用指南(美國國家學院出版社，1996年，華盛頓特區)。試驗選用8頭初始體重15-20公斤的約克郡家豬。所有的豬都被關在一個籠子裏，並允許免費獲得水和商業豬糧。

研究設計

如圖1所示，8隻動物在全麻下進行了小型左側開胸手術，並在旋左動脈近端周圍放置了ameroid縮窄器，以創建先前描述的慢性心肌缺血模型[5,6]。在第一次手術中，骨髓(15毫升)被收集體外MSC擴張。4周後，對每隻動物進行第二次左胸切開術，在回旋區(缺血區)暴露並注射體外擴增的MSCs，在另一個標記區注射MSCs +水凝膠，均在缺血區內。在注射後的2、4、6和12周，2隻動物的隊列被犧牲，然後心髒被收獲和切片。用H & E染色和抗馮·維氏因子抗體和平滑肌肌動蛋白免疫組化染色檢測注射細胞命運和血管生成效果。

骨髓間充質幹細胞的製備和培養

采用上述方法製備和培養骨髓間充質幹細胞[5,6]。檢測骨髓間充質幹細胞的CD標記、核型分析及各自的多能分化能力。

改性玻尿酸的製備與貯存

反應條件為10 w/v% HA (MW 16 kDa;(LifeCore Biomedical)用67 w/v% 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC;Sigma)， 25 w/v% n -羥基琥珀酰亞胺(NHS;Sigma)在磷酸緩衝鹽水(PBS)中，如前所述[9]。

自體豬血清采集

術前用血清管采集每頭豬的外周血。血清分離時，血液以1500轉/分離心10分鍾。

水凝膠的製備

HA:以10 w/v% HA- nhs溶解在PBS中與豬血清以1:1.5的比例混合製備Ser水凝膠。所有的聚合都在p^H7-7.4和室溫5分鍾。細胞懸浮於適量血清中，HA溶解於PBS中。兩種組分混合30秒，最後600µl的水凝膠用粘性移液管轉移到0.5 mL無菌注射器的筒中。為了獲得最佳的注射用水凝膠粘度和最大的粘附性，我們在共600µl和HA中選擇了1:1.5的血清比例。為了保證移植後NHS組的功能，在PBS中溶解HA的5分鍾內合成水凝膠。

圖1:實驗時間線顯示ameroid放置，隻注射MSCs或MSCs加水凝膠，動物安樂死和實驗結束時的組織學評估。

單純骨髓間充質幹細胞和骨髓間充質幹細胞加水凝膠的移植

放置ameroid四周後，體外擴增的自體間充質幹細胞(1.2 × 10⁸)按照前麵描述的方法製備和清洗[5,6]。MSCs懸浮於2.4 ml生理鹽水中，平均分成兩等份。一個(隻有MSCs, 6 × 10⁷)用25號針(注射深度0.5 cm)在左心肌缺血區(12個注射位點，每個位點100 μ l)的縫線標記區域內進行心肌內注射。按照上述方法將混合好的MSCs與剛製備好的水凝膠混合，並按上述方法注射到缺血區另一個標記區域內。

組織學和免疫組化分析

在注射後2、4、6和12周，每個時間點處死2隻動物。在缺血區內分別小心地切斷MSCs標記區和MSCs +水凝膠標記區。切除標本周圍組織，切成4塊。每片再切成3個5 × 5mm厚的切片，收集後用10%緩衝福爾馬林進行石蠟包埋固定，或用OCT進行冷凍切片，不固定。石蠟切片用蘇木精、伊紅和三色馬尾鬆染色進行形態學分析。使用小鼠單克隆抗人抗體進行免疫組化或免疫熒光染色。初抗孵育後，檢測異硫氰酸鹽或與抗小鼠IgG結合的羅丹明熒光，並用4 '，6-二胺基-2-苯林多(DAPI)標記細胞核。

結果

動物預後和存活

水凝膠包覆骨髓間充質幹細胞移植後無不良反應。2隻動物在放置ameroid後1-2周內因大麵積心肌梗死而意外死亡(其中一隻動物死於嚴重的手術傷口感染，另一隻死於屍檢確定的放置ameroid後肺水腫)。在本初步研究中未發現與細胞後注射相關的動物死亡。有八隻動物存活下來並按計劃實施了安樂死。

組織學分析

在這項大型動物模型研究中，我們發現，與早期隻注射MSC區域相比，水凝膠包裹的MSCs移植促進了移植細胞在注射區域的保留，並刺激了血管生成。注射2周後，水凝膠注射區域顯示出比僅注射間充質幹細胞區域更多的細胞聚集。在間充質幹細胞加水凝膠移植組中，間充質幹細胞向靠近周圍心肌的細胞群外圍遷移(圖2)。盡管注射前水凝膠和細胞分散均勻，但這種遷移還是發生了。這表明，一旦注入骨髓間充質幹細胞，在宿主組織附近會有更多的聚集。此外，在之後的時間點，與隻注射MSC相比，水凝膠組仍然可以看到更多的細胞團塊(圖3和圖4)。

水凝膠降解:注入水凝膠後，水凝膠凝固，在2周時間點的H&E染色切片中可以觀察到白色區域(圖2)。重要的是，在4周時注入水凝膠的證據很少(圖3)，這歸因於降解。

纖維化:我們觀察到，與隻注射MSC相比，水凝膠注射區域的纖維化量更大(圖3和圖4)——差異在6周和12周時最為明顯。12周時，纖維化變得更加嚴重，肉眼可見，僅MSC和MSC加水凝膠注射區之間有顯著差異(圖5和圖6)。

圖2:注射2周後，水凝膠注射區域顯示出更多的細胞團塊(A,B,C)，與隻注射MSC相比(D,E,F)。凝固的水凝膠位於細胞團塊的中心(A和B中的箭頭)，注射的細胞遷移到細胞團塊的邊緣(B中的箭頭)。放大倍數為AD=10倍，BE=50倍，CF=200倍。

圖3:4周時，水凝膠逐漸被吸收(A,B箭頭)，但與隻注射MSC相比，注射區域顯示更多的纖維化。D中，黑色箭頭表示注射細胞團塊，白色箭頭表示用於注射標記的縫線。放大倍數為AD=10倍，BE=50倍，CF=200倍。

炎性細胞浸潤、血管生成:在第2周和第4周間隔，也觀察到含有水凝膠區域的炎症細胞浸潤。我們在注射後2、4、6和12周對冰凍切片的VIII因子和平滑肌動蛋白進行免疫熒光染色。在水凝膠注射的動物中，球形細胞簇周圍的陽性因子VIII和SMA染色提示毛細血管密度增加。這些差異在之後的時間點變得不那麼明顯(圖7)。

評論

自從細胞療法在世紀之交作為一種刺激缺血性心髒病治療性血管生成的方法被引入以來[13-23]，最佳細胞輸送技術一直是一個激烈的爭論話題。缺血性冠狀動脈疾病患者最初嚐試冠狀動脈內灌注[3,13-18]。這種做法的主要限製是需要在細胞輸注期間和隨後幾秒鍾阻塞冠狀動脈血流，這可能會導致再灌注後細胞的衝刷。類似地，靜脈輸注異體間充質幹細胞導致大多數移植細胞被困在肺而不是心髒，正如[4]成像報道的那樣。研究人員也曾嚐試使用特殊的注射裝置[20,21,24]將細胞送入心膜外，或在直視心髒手術中通過直接心外膜注射[2]。這部分解決了細胞返回目標組織的問題。然而，注射到跳動心肌後，細胞保留率不理想。因此，人們研究了基於多糖的策略，試圖創造一個友好的環境，以增加細胞在給藥後的存活和保留[9-12]。研究者認為細胞外基質的缺乏是[25]分娩後細胞滯留減少的主要原因之一。

圖4:6周時，水凝膠注射區纖維化明顯增加。與隻注射MSC相比，水凝膠組仍可見更多的細胞團塊。箭頭表示細胞團塊，箭頭表示纖維化組織。放大倍數為AD=10倍，BE=50倍，CF=200倍。

圖5:12周時，水凝膠注射區域出現大麵積的纖維化組織。箭頭是其中一個纖維化區域。放大倍數為AC=100倍，BD=200倍。

圖6:12周時，水凝膠注射區可見大片纖維化組織，肉眼可見。白色箭頭表示從標記注射區域切割出來的組織塊中的纖維化區域，顯示僅MSC和MSC加水凝膠注射區域之間的顯著差異。

透明質酸，或稱透明質酸，是細胞外基質的重要組成部分的幾種多糖之一[10-12]。由於HA具有較強的黏度和保水能力，它在組織內穩態和生物力學完整性中起著非常重要的作用。我們使用改良的含血清的HA製劑(我們稱之為水凝膠)，在具有心球源性細胞(cdc)的急性心肌梗死齧齒動物模型中，發現這些水凝膠在注射部位停留長達4周。水凝膠包埋CDC已被證明能促進心肌梗死後的生存和增殖，並改善左心室射血分數[9]。

在目前的研究中，我們在豬慢性心肌缺血模型中測試了水凝膠的效果，以觀察在MSC和水凝膠移植後的幾個時間點，細胞保留和存活是否得到改善。我們發現水凝膠在早期顯著增加了細胞保留率，促進了血管生成，但從4周開始水凝膠也引起了大量的纖維化，在12周達到峰值。我們仔細地將這些結果與我們的齧齒類動物模型進行了比較，由於注射是在心肌瘢痕組織中進行的，所以沒有引起明顯的纖維化。在大動物研究模型中，我們將水凝膠細胞注入缺血但存活的心肌，由於凝膠滯留在心肌內，可能導致注射道內心肌細胞的破壞。因此，水凝膠注射到活心肌可能由於水凝膠注射後凝固而引起心肌損傷，並需要較長時間被吸收。水凝膠注射引起的纖維化是否對左心室功能有影響尚不清楚。功能研究有必要進一步描述在缺血心肌中囊化細胞傳遞的任何好處。這些研究可能為ha -血清水凝膠是否導致注射幹細胞的協同效益提供更明確的數據，並可能進一步優化ha -血清水凝膠在細胞基礎治療中的使用。雖然注射的幹細胞分化為功能心肌細胞是細胞基礎治療的最終目標，但一些研究表明，移植後細胞分化較差。可能的解釋包括細胞植入不良、存活不足和增殖不足。

圖7:在僅注射MSC和MSC +水凝膠注射後2、4、6、12周，冰凍切片免疫熒光染色的因子VIII(綠色)、平滑肌肌動蛋白(SMA)(紅色)和DAPI(藍色)。在水凝膠注射的動物中，球形細胞簇周圍的陽性因子VIII和SMA染色提示毛細血管密度增加。這些差異在後來的時間點變得不那麼明顯。白色箭頭表示細胞簇。放大100倍。

致謝

作者特別感謝他們在動物醫學和外科實驗室(NHLBI)的同事們，感謝他們為這項研究提供動物手術方麵的幫助。

參考文獻

1. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R，等(1999)成人間充質幹細胞的多譜係潛力。科學。284:143 - 147。［Ref。］
2. Patel AN, Geffner L, Vina RF, Saslavsky J, Urschel HC Jr，等(2005)充血性心衰合並自體成體幹細胞移植:一項前瞻性隨機研究。中華胸心血管外科雜誌130:1631- 1638. 2。［Ref。］
3. 陳林林，方偉偉，葉芳，劉永華，錢健，等。(2004)自體骨髓間充質幹細胞冠狀動脈內移植對急性心肌梗死患者左心室功能的影響。美國心髒雜誌。94:92-95。［Ref。］
4. Hare JM, Traverse JH, Henry TD, Dib N, Strumpf RK，等(2009)急性心肌梗死後靜脈注射成人間充質幹細胞(Prochymal)的隨機、雙盲、安慰劑對照、劑量遞增研究。J CollCardiol。54: 2277 - 2286。［Ref。］
5. 周勇，王鬆，於誌，Hoyt RF Jr, Sachdev V，等(2009)自體間充質幹細胞直接注射改善心肌功能。生物化學與生物物理學報。39:902-907。［Ref。］
6. 周勇，王鬆，餘錚，Hoyt RF Jr，曲旭，等(2011)骨髓基質細胞移植到缺血心肌後向血管分化的研究。Ann Thorac醫生，91:1206-212。［Ref。］
7. Jo J, Hong S, Choi WY和Lee DR(2014)細胞穿透肽(CPP)結合蛋白是操縱人類間充質間質細胞的有效工具。科學報告4:4378。［Ref。］
8. Jo J，宋浩，Park SG, Lee SH, Ko JJ，等(2012)細胞穿透肽介導共激活子相關精氨酸甲基轉移酶1蛋白胞漿內傳遞對人間充質幹細胞分化潛能的調控作用。幹細胞。30:1703-1713。［Ref。］
9. 張春春，陳阿特，Armstrong PA，羅慧卿，Higuchi T，等(2012)玻尿酸-人血水凝膠用於幹細胞移植。生物材料33:8026 - 8033。［Ref。］
10. Gerecht S, Burdick JA, Ferreira LS, Townsend SA, Langer R, et al.(2007)透明質酸水凝膠對人胚胎幹細胞自我更新和分化的控製。國家科學院院刊104:11298-11303。［Ref。］
11. Toole BP(2001)透明質酸在形態發生中的作用。細胞發育生物學雜誌12:79-87。［Ref。］
12. Toole BP(2004)透明質酸:從細胞外膠到細胞周線索。巨蟹座4:528-39。［Ref。］
13. Assmus B, Schächinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R，等(2002)急性心肌梗死前體細胞移植與再生促進作用(TOPCARE-AMI)。循環106:3009 - 3017。［Ref。］
14. Britten MB, Abolmaali ND, Assmus B, Lehmann R, Honold J，等(2003)急性心肌梗死患者冠狀動脈內祖細胞治療後的梗死重塑(TOPCAREAMI)——來自係列增強磁共振成像的機製研究。發行量108:2212 - 2218。［Ref。］
15. Schächinger V, Assmus B, Britten MB, Honold J, Lehmann R，等(2004)急性心肌梗死的祖細胞移植和再生增強——TOPCARE-AMI試驗的最終一年結果。J Am collcardi44:16 90-1699。［Ref。］
16. (2002)自體冠狀動脈內單核骨髓細胞移植修複人心肌梗死。發行量106:1913 - 1918。［Ref。］
17. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Bartsch T, Schannwell C，等。(2005)冠狀動脈內自體骨髓細胞移植對慢性冠狀動脈疾病患者心肌梗死再生的研究。美國大學心髒科46:1651-1658。［Ref。］
18. Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, rings - lichtenberg S, Lippolt P，等。(2004)心肌梗死後冠狀動脈內自體骨髓細胞轉移:BOOST隨機對照臨床試驗。《柳葉刀》364:141 - 148。［Ref。］
19. Meyer GP, wollerert KC, Lotz J, Pirr J, Rager U，等。(2009)心肌梗死後冠狀動脈內自體骨髓細胞轉移:隨機對照BOOST試驗的5年隨訪。歐洲心髒雜誌30:2978-2984。［Ref。］
20. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, Silva SA, Sousa AL，等(2003)經心內膜自體骨髓細胞移植治療嚴重慢性缺血性心力衰竭。發行量107:2294 - 2302。［Ref。］
21. Fuchs S, Baffour R, Zhou YF, Shou M, Pierre A，等(2001)經心內膜輸送自體骨髓增強實驗性慢性心肌缺血豬的側支灌注和區域功能。J Am Coll Cardiol 37: 1726- 1732。［Ref。］
22. Fuchs S, Satler LF, Kornowski R, Okubagzi P, Weisz G，等(2003)導管自體骨髓心肌注射治療晚期冠狀動脈疾病的可行性研究。J Am Coll心髒雜誌41:1721-1724。［Ref。］
23. 康海傑，金海生，張永雲，樸克偉，趙海傑，等(2004)心肌梗死冠脈支架術後灌注粒細胞集落刺激因子動員的外周血幹細胞對左心室收縮功能和再狹窄的影響:MAGIC細胞隨機臨床試驗。《柳葉刀》363:751 - 756。［Ref。］
24. 陶博，崔敏，王超，馬鬆，吳峰，等(2015)經皮骨髓間充質幹細胞心肌內灌注對豬心肌梗死左心室功能的改善優於骨髓單個核細胞。開展5:196 - 205。［Ref。］
25. 王春春，陳春春，林偉偉，黃明生，謝昌平，等(2008)心肌內直接注射間充質幹細胞片對梗死後心功能的改善作用。心血管雜誌77:515-524。［Ref。］

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條信息

文章類型:研究文章

引用:周勇，王勝，於錚，Hoyt RF Jr, Karakas MF，等。(2015)水凝膠在豬慢性心肌缺血細胞基礎治療中的作用。Int J Stem Cell Res 1 (1): doi http://dx.doi。org/10.16966/2472 - 6990.102

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出版的曆史:

收到日期:2015年5月20

接受日期:2015年6月17日

發表日期:2015年6月23日