圖1 a-1d:它顯示了CML患者外周血細胞培養的MSCs細胞係的相位和光鏡照片。圖1a為培養第5天的貼壁細胞,圖1b為生長良好的融合細胞,圖1c為傳代10次獲得的多能性克隆,圖d為吉氏染色細胞,形態拉長
全文
慢性髓係白血病(CML)外周血BCR-ABL-ve間充質幹細胞的分離、鑒定及在增強CML患者骨髓移植潛力中的應用
普拉文·D Potdar*Kaur Navjeet Lotey
賈斯洛克醫院和研究中心分子醫學和生物科,孟買,400026,馬哈拉施特拉邦,印度*通訊作者:Pravin D. Potdar博士,M.Sc, phd, DMLT, DHE, DMS,賈斯洛克醫院和研究中心分子醫學和生物學係主任,G. Deshmukh Marg博士,印度馬哈拉施特拉邦孟買400026,電話:91-22-66573445;傳真:91-22-23520508;電子郵件:ppotdar@jaslokhospital.net或ppravin012@gmail.com
摘要
慢性髓係白血病(CML)是一種導致骨髓增生性母細胞不受控製生長的疾病。酪氨酸激酶抑製劑在晚期並沒有什麼用處,它們有自己的副作用、反應和耐藥性。迄今為止,隻有骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)才能完全治愈CML,但有其自身的局限性,需要進一步研究以提高CML患者的生存率。我們在賈斯洛克醫院的實驗室一直致力於研究和表征各種類型的血液惡性腫瘤間充質幹細胞。我們提出了一個概念,從CML患者的外周血中分離和表征間充質幹細胞(MSCs),可以與同一CML患者的骨髓移植聯合使用。我們的研究發現CML患者外周血幹細胞為BCR/ABL負.我們將這種細胞係命名為“BCR/ABL”負”細胞係。這些細胞的分子特征進一步證實了它們的間充質表型,CD105、CD13和CD73基因的明顯表達。有趣的是,這些細胞也表達多能性基因,如OCT4和NANOG以及細胞因子,如IL6和TNFα。進一步證實BCR/ABL表型正常負通過免疫熒光顯微鏡定位細胞中H-Ras、Rb、P53、P16、P21、EGFR和Ki67癌症相關蛋白的表達在體外轉換試驗。因此,我們認為這些正常的BCR/ABL負在不久的將來,CML患者外周血中提取的MSCs可用於BMT程序之外,以更好地恢複CML疾病。
關鍵字
慢性骨髓性白血病;間充質幹細胞;BCR / ABL;多能細胞;分子標記;幹細胞移植
簡介
慢性髓係白血病(CML)是骨髓係[1]的一種疾病。它幾乎占所有成人白血病的15%。它導致被稱為母細胞的白細胞不受控製和異常生長。疾病發展分為三個主要階段,即慢性期、加速期和細胞危亡期,這取決於患者血液中存在的細胞數量。如果不及早治療,病情將分別發展到第二階段、第三階段、加速階段和爆發危機階段[2]。這一進展背後的真正誘因仍不清楚。但是,在大多數情況下,互惠易位突變t[9:22]也被稱為費城染色體,由於這種融合BCR/ABL基因蛋白[3],導致酪氨酸激酶活性的組成性增加。這種融合基因的組成性表達是這種疾病的中心靶點。FDA已經批準了某些藥物,如伊馬替尼(ST1571,來自諾華的Glivec),現在已經被確定為CML的一線治療藥物,在大約大多數初始階段[4]的患者中產生完整的細胞遺傳反應。類似的改善酪氨酸激酶抑製(TKI)機製的藥物已經出現,但沒有一個能夠建立自己的完全治愈治療。 Most of the TKIs have not been much effective on patients at advanced stages. Patients with certain point mutations are resistant to these treatments [5-7]. It is only effective to inhibit the TK activity but not effective in eradicating the cancer stem cell subpopulations [8]. At such a condition, Bone Marrow Transplant (BMT) remains as the only known cure for this disease [9] but, it also has its own limitations. Finding a suitable donor is one of the major problems in this therapy and patients also require crucial care to check graft vs. host reactions [10]. Hence, not all of the CML patients can be treated with allogeneic stem cell therapy, as it requires certain optimal conditions in patient’s body. This has provoked scientists since long to establish autologous stem cell therapy (ASCT) as a full curative measure. ASCT could be used for children, older aged patients and those suffering from advanced form of this disease. It does not trigger adverse graft reactions and hence can be widely used for a variety of patients.
我們的實驗室一直致力於從許多血液惡性腫瘤中分離間充質幹細胞,並發現分離出的間充質幹細胞在體外,顯示非惡性表型或無病基因[11]。近年來,MSCs被認為是一種替代方法,可通過與已有的治療方法聯合使用來克服異基因造血幹細胞移植相關的問題[12-14]。因此,我們建議從CML陽性患者的外周血中分離間充質幹細胞,並使用特定的分子標記對其進行表征,以了解其表型和性質。由於CML具有BCR/ABL基因的特征性融合,我們考慮檢測這些細胞的BCR/ABL轉錄,並對一些常見的致癌標誌物進行分析。除了BCR/ABL外,我們還使用其他幾種致癌標記對這些分離細胞進行分析和表征,通過免疫熒光、RT-PCR分析和錨定獨立生長試驗檢查其正常表型。如果它們被發現是正常的,沒有任何異常,這些細胞可以與BMT一起更好地治療這種疾病。
材料和方法
樣品收集
根據印度孟買Jaslok醫院和研究中心的倫理指南收集CML患者的外周血(10 ml)。用Ficoll hypaque (Himedia, India)方法分離等分細胞。抽吸中間層,轉移至1.7 ml Eppendorf管中。以4000 rpm離心10 min,得到顆粒,懸浮在1 ml RPMI培養基中,添加10% FBS、0.2%穀氨酰胺、0.1%胰島素和1% Pen Strep,得到單層細胞懸浮液,在65 mm Nunc中培養®在37°C和5% CO中孵育過夜2濕度為90%的CO2孵化器。剩餘部分血漿用於RNA提取,具體步驟如下。
CML患者外周血間充質幹細胞的分離
細胞懸浮於上述培養基中,37℃,5% CO孵育2濕度為90%的CO2如上所述的孵化器。用1X PBS清洗貼壁細胞,用含有10%胎牛血清、0.2%穀氨酰胺、0.1%胰島素和1% Pen Strep的DMEM培養基進行培養。每天觀察這些細胞的生長情況,並使用附在相位對比顯微鏡上的相機拍照。這些細胞在培養20天內開始融合。將融合細胞用0.25% PBS-Trypsin進行胰蛋白酶化,在幾個65 mm燒瓶中進一步擴增,然後將這些細胞在-85°C冷凍,直到進一步實驗。用Trizol對這些細胞的一部分進行RNA提取®方法和用於基因表達研究
相襯顯微術
使用蔡司公司的相位對比顯微鏡觀察細胞的生長、增殖和外部形態特征,並借助附帶的相機和TS視圖軟件逐步記錄圖像。觀察是在20倍和40倍放大下進行的。
光學顯微鏡
複合光學顯微鏡下觀察,1 × 105每毫升細胞在無菌蓋片上生長直到達到亞融合水平。用吉姆薩染色法研究和觀察這些細胞的表型特征。蓋片上的細胞用1XPBS清洗,用50%甲醇固定10分鍾。過濾吉姆薩染色劑(菲舍爾科學®)用於染色細胞約10分鍾。用蒸餾水清洗多餘的汙漬,讓蓋套風幹,然後在20倍和40倍放大的光學顯微鏡下觀察。
免疫熒光顯微鏡
為了製備用於免疫熒光的細胞,我們每毫升在無菌蓋片上培養1 × 105個細胞。細胞部分融合後,用阻塞緩衝液浸泡約半小時,然後用4%多聚甲醛固定。我們選取了腫瘤細胞中常見的7種致癌抗體,即H-Ras、p53、Rb基因、Waf1、p16、EGFR和Ki-67。用1X PBS洗滌細胞,孵育2小時後加入1:10稀釋的阻斷緩衝液一抗。用FITC標記的山羊抗小鼠IgG作為普通二抗,在1X PBS中稀釋1:100,在黑暗條件下與所有一抗一起接種。用1X PBS洗淨一抗,暗培養2小時後加入。將蓋片衝洗、幹燥並倒置在帶有Fluromount安裝介質的玻片上(Sigma Aldrich, USA)。用指甲油固定蓋片的邊緣,然後在FITC激發的熒光附件相襯顯微鏡下進行觀察,並對圖像進行拍照和記錄。
安克雷奇的獨立分析
用0.8%瓊脂糖溶液加入等體積的雙強度RPMI培養基(含20% FBS、2% Penstrep和0.4%穀氨酰胺),製備0.4%軟凝膠混合物。將溶液冷卻至40°C,將1.5 ml溶液分別倒在35mm的Nunc上®文化的菜肴。用0.25% PBS-Trypsin對細胞進行次融合培養,在上述密度為1 × 10的培養基中製備單層細胞懸液4將該懸浮液倒在軟瓊脂分層培養皿上。觀察細胞後,用含10X胎牛血清、1% Penstrep和0.2%穀氨酰胺的0.5 ml RPMI每周2-3次,連續2周。兩周後,我們觀察瓊脂平板上出現的細胞集落,並在相位對比顯微鏡下記錄它們的照片。
分子標記
用Trizol提取總RNA®(Sigma Aldrich, USA)方法。2 μ g RNA在Applied Biosystems上轉錄成cDNA®高容量cDNA試劑盒。我們選擇了各種標記來表征這個細胞係。BCR/ABL, cd105, cd13, cd73, cd34, cd45, OCT 4, NANOG, SOX 2, LIF, Keratin 18, TNFα, IL 6, Dap Kinase, EGFR和housekeeping gene β Actin的引物序列和PCR條件我們實驗室之前已經報道過[15,16]。此外,我們還分析了CML細胞的3個新標記,即Bcl-2、cMyc和Notch2,這3個基因的PCR條件都是相同的,從95°C 5分鍾的初始變性開始,然後在94°C 30秒、60°C 30秒和72°C 1分鍾的35個循環。這些基因的引物序列描述如下(表1)。
結果
CML患者外周血貼壁細胞的分離
我們先前在這篇手稿中描述了癌症患者來源幹細胞的培養。從CML患者外周血中分離出的部分Ficoll懸浮液細胞在培養2-3天內粘附在培養皿底部,如圖1a所示。這些細胞迅速增殖,並在培養20-30天內達到融合,如圖1b所示。合並後,這些細胞用0.25% PBS- Trypsin進行胰蛋白酶化,並懸浮在新鮮的生長培養基中,最初鍍在Nunc上®用於進一步生長的35mm培養皿。在達到合流後,這些細胞被分裂,通過重複胰蛋白酶化過程創造更多的傳代,如上所述。培養物中的一些細胞在隨後的傳代中觀察到形成多能性克隆,如圖1c所示。因此,一個穩定的細胞係被開發和生長在許多傳代。然後對這些細胞進行表型和基因型表征,以更好地了解它們的細胞和分子特征。
染色染色
用吉姆薩染色法觀察細胞表型特征。細胞核周圍可見纖維樣結構的網狀結構,將細胞核與細胞質連接起來。大多數細胞非常細長,細胞核中有2 ~ 3個核仁。有些細胞細長,體積小,而有些細胞非常大,分布廣泛。在高倍鏡下仔細觀察染色細胞,可發現部分細胞存在大量細小的絲狀足。圖1d顯示了這些細胞的Giemsa染色圖。
BCR/ABL基因在CML患者分離幹細胞中的表達
分子標記譜分析是為了找出某些相關基因的存在或缺失,這些基因有助於揭示這些細胞的遺傳特征。BCR/ABL是由[9:22]易位產生的融合基因。因此,對來自CML患者的細胞來說,識別該基因的存在是極其重要的。圖2顯示BCR/ABL基因在患者稱為“在活的有機體內細胞和在培養物中衍生的細胞稱為在體外第3代和第4代的細胞。可以看出,BCR/ABL基因存在於血漿細胞(體內細胞)中,但在兩種細胞係中均不存在(體外)表明這些細胞在沒有BCR/ABL融合蛋白的情況下生長。因此,我們將這些細胞命名為BCR/ ABL負細胞並進行了進一步的表征。
錨固獨立生長試驗
主要采用非錨定法或軟瓊脂法進行研究在體外細胞轉化培養中生長的細胞的轉化圖3顯示了BCR/ABL的單個檢測負細胞。我們可以清楚地看到,在第二周結束時,這些細胞形成了很少的錨定獨立菌落,說明這些細胞大部分具有正常的表型,這也被我們通過RT/ PCR和免疫熒光顯微鏡對癌症分子標記的研究進一步證實。
BCR/ABL中間充質和造血標誌物的表達負細胞係
幹細胞的間充質和造血表型可以通過特定的分子標記進行鑒定。圖4顯示BCR/ABL中間充質和造血標記物的表達負早期傳代P4細胞。的BCR / ABL負細胞顯示CD105, CD13和CD73基因的存在,表明其間充質表型,而CML患者的在活的有機體內細胞中僅cd105基因存在,CD13和CD73基因缺失。缺席的原因尚不清楚。我們還看到BCR/ABL負細胞在傳代早期表達輕度CD34基因,多次傳代後表達減弱。這些細胞不表達CD45基因,而CD45基因是造血細胞的另一個重要基因標記。因此,BCR/ABL中cd45基因缺失負細胞證實了其間充質表型。因此,我們可以確定BCR/ABL負細胞是來自CML患者外周血的間充質幹細胞,早期傳代時CD34基因表達較輕,一般在培養中傳代幾代後消失。
圖2:CML患者BCR-ABL基因在“體內”細胞中表達,而在“體外”細胞中無表達。
圖3:結果顯示BCR/ABL-ve細胞的錨定獨立生長試驗(軟瓊脂試驗)。在軟瓊脂試驗中未發現適當的菌落,即使在2周後也未發現。
圖4:BCR/ABL-ve細胞和CML患者血漿細胞(即體內細胞)的間充質(CD105, CD13和CD73)和造血(CD34和CD45)標記。
BCR/ABL中多能性標記的表達負細胞係
多能性是幹細胞的特性之一。在圖5中,我們顯示了BCR/ABL中Oct4、Nanog和Sox 2基因的表達負細胞和慢性粒細胞白血病患者的血細胞(在活的有機體內).這裏顯示了兩者在活的有機體內CML患者細胞和BCR/ABL細胞負細胞係顯示OCT4和Nanog基因的存在,證實了它們的多能性。
BCR/ABL中分化標誌物的表達負細胞係
分化是幹細胞決定自己成為一種特定表型的階段。圖6顯示了分化標記,顯示在體內CML細胞和BCR/ABL中都存在LIF和角蛋白負這些細胞表明BCR/ABL負細胞在培養過程中保持未分化和表皮狀態在活的有機體內.LIF主要有助於保持無差別的地位,而;角蛋白的表達反映了這些細胞的表皮特征。
細胞因子標記物在BCR/ABL中的表達負細胞係
細胞因子是許多疾病的預後標誌物。圖7顯示了兩種細胞中TNFα和IL6的表達在活的有機體內和BCR / ABL負細胞。結果表明,TNFα在兩種細胞類型中均表達,而IL6僅在BCR/ABL中表達負在CML患者的體內細胞中沒有。
BCR/ABL中各種致癌標記物的表達負細胞係
由於我們的目標是將這些細胞與BMT一起用於移植,所以我們需要檢查BCR/ABL負任何致癌異常的細胞係都存在於先前的疾病細胞中。為了證實這一點,我們選擇了特定的致癌標記,如Dap激酶,Bcl2, Notch, cMyc和EGFR基因用於本研究。圖8顯示了用於分析BCR/ABL的各種致癌標記物的結果負傳代3 (P3)和傳代4 (P4)的細胞。觀察到Dap激酶、Bcl2和Notch2基因在體內和BCR/ABL中均存在負然而,cMyc和EGFR在體內和BCR/ABL中均被發現缺失負顯示其正常表型的細胞,沒有任何致癌異常。因此這BCR / ABL負細胞可用於移植計劃和BMT過程,以更好地治療這種疾病。
免疫熒光顯微鏡定位BCR/ABL中的致癌標記物負細胞係
免疫熒光是一種用於識別蛋白質在特定細胞中的存在和定位的工具。我們研究了BCR/ABL中特異性致癌蛋白、抑癌蛋白、核仁蛋白和表麵受體蛋白的定位負細胞通過免疫熒光顯微鏡確認其正常表型
圖9A顯示了大部分BCR/ABL中存在H-Rasoncoprotein的表達負細胞胞漿。同樣,所有的抑癌蛋白如p53、Rb、p16和p21幾乎都存在於這些細胞中。在整個細胞結構中觀察到p53,並出現在細胞核和細胞質區,如圖9C所示。視網膜母細胞瘤蛋白(Rb)和p16基因僅存在於核區,分別見圖9B和圖9E。p16染色時核仁未染色,其餘部分染色明顯。然而,p21蛋白被發現存在於細胞核下方的一些細胞器樣結構中(圖9d)。
圖5:在BCR/ABL-ve細胞和CML患者的血細胞中顯示多能性製造者OCT4、NANAOG和SOX2
圖6:在BCR/ ABL-ve細胞和CML患者的血細胞中顯示分化標誌物LIF和Keratin
圖7:在BCR/ABL-ve細胞和CML患者的血細胞中顯示細胞因子標記il - 6、tnf - α和角蛋白
一小部分細胞顯示Ki- 67和EGFR抗原熒光。Ki-67被發現隻存在於核仁中,如圖10A所示,而EGFR在BCR/ ABL中不存在負單元格如圖10B所示。
因此,總體免疫熒光研究證實了BCR/ABL的正常表型負因此,在不久的將來,這些細胞可與BMT聯合用於移植研究,以治療本病。
討論
慢性髓係白血病是一種幹細胞的進行性疾病,其在爆發危機階段的唯一治療方法是骨髓移植,這需要HLA匹配的異體供體進行造血幹細胞移植。在這種情況下,它的可用性和移植相關的並發症使其成為一個棘手的過程。因此,這種疾病和許多其他疾病一樣,仍在等待一種副作用最小的理想治療方法。骨髓間充質幹細胞正被視為治療包括血液惡性腫瘤在內的許多疾病的新藥物[12-14]。骨髓間充質幹細胞與臍帶幹細胞或造血幹細胞共移植均有陽性結果。選擇骨髓間充質幹細胞用於自體或異體移植的最大好處是減少或完全避免移植物對宿主的反應。它們還能提高造血移植的效率。因此,我們將我們的研究導向從CML患者的外周血中培養MSCs,並使用RT/PCT和免疫熒光顯微鏡的各種生物標誌物對其進行正常表型的表征。
我們在Jaslok醫院的實驗室和研究中心一直致力於從許多癌症、腫瘤和血液惡性腫瘤中分離、表征和培養幹細胞。我們考慮從CML患者中分離幹細胞,並研究其表型特征和分子機製,以確定這些幹細胞是否足夠安全,可用於自體幹細胞移植聯合BMT。我們進一步評估了這些幹細胞是否存在BCR/ABL轉錄本,我們發現從CML患者中分離和生長的細胞是BCR/ABL負因此我們將這些細胞命名為BCR/ABL負細胞係。Carrara et al.[17]進行了類似的研究,我們的結果與他們一致。在BCR/ABL建立之時負通過相襯顯微鏡和Giemsa染色徹底觀察表型特征,我們可以逐步縮小到間充質幹細胞存在的想法。為了重申這一觀點,我們對細胞進行了特定的幹細胞標記,這證實了我們的猜想。表達CD105、CD13和CD73的這些細胞的分子分析證實了這些細胞的間充質特征。OCT4和NANOG活性表明這些細胞[15]具有多能性。LIF的表達表明這些細胞處於未分化狀態,而角蛋白的明確表達則用於識別細胞[15]的上皮性質。然而,在這些細胞中也發現了CD34的表達,這些細胞的存在通常被認為是間充質幹細胞的陰性標記。在我們的研究中,我們檢測了CD34在早期傳代細胞中的表達,因此我們得到了CD34在這些細胞中的弱表達。然而,造血細胞的另一標誌CD45在這些細胞中完全缺失,表明BCR/ABL負細胞隻是間充質幹細胞。CD34在BCR/ABL中的表達負細胞再傳代幾次就會消失。Lin等報道了CD34基因的減少。[18]。這可以用以前的一些發現來解釋,外周血來源的細胞可能顯示cd34的存在,也表明它們是血管係統的一部分。CD34+MSCs也有報道顯示大量的絲狀偽足,CD34存在於這些絲狀偽足的尖端,促進血管生成。上麵的結果報道了在一些細胞中觀察到大量的絲狀偽足,這可能支持CD34的存在+在我們的文化中。此外,據報道,CD34在外周血來源的間充質幹細胞的早期傳代中存在較弱,在隨後的傳代中迅速減少。由於我們隻評估了早期傳代,因此有可能觀察到CD34的輕度存在[19-21]。因此,如果考慮將其用於自體移植聯合BMT治療CML,則具有額外的優勢。然而,TNFα和Bcl-2表達正常,表明BCR/ABL表型正常負細胞。
圖8:在BCR/ABL-ve細胞和CML患者的血細胞中顯示了致癌標誌物DAPK、BCL2、cMYC、EGFR和NOTCH2。
圖9:免疫熒光顯微鏡顯示BCR-ABL-ve細胞中A) HRas、B) Rb、C) P53、D) p21和E) p16癌蛋白
圖10:免疫熒光顯微鏡顯示BCR-ABL-ve細胞中A) Ki67和B) EGFR癌蛋白
我們進一步使用了幾種致癌標記物和在活的有機體內移植試驗以再次確認這些細胞的正常表型。我們選擇Dap激酶、Bcl-2、cMyc、EFGR和NOTCH2 5個致癌標記,通過RT/PCR分析確定它們在這些細胞中的存在或不存在。Dap激酶是一種潛在的腫瘤抑製基因,該基因的缺失有助於細胞生長形成腫瘤[22]。我們的細胞顯示Dap激酶基因的存在,明確表明BCR/ ABL的正常表型負細胞。據報道,cMyc的高表達導致癌基因[23]的表達加重。我們的細胞顯示癌基因cMyc缺失,再次提示正常類型。Notch2信號通路的失調可能是許多類型血液疾病[24]的一個重要事件。調控失調往往導致該基因的表達減少。我們的BCR / ABL負細胞顯示Notch2的存在,這也是正常細胞的特征。表皮生長因子受體是一種細胞表麵受體,屬於表皮生長因子家族。也有報道稱,在某些情況下,EGFR的表達增加,促進癌細胞轉移的能力,因此許多藥物專注於下調EGFR來控製癌症[25]。的BCR / ABL負這些細胞未表達EGFR,證實BCR/ABL表型正常負細胞。我們知道EGFR在CML的病因中沒有作用,但我們檢測了CML患者外周血中分離出的MSCs中EGFR的表達,隻是為了檢查這些細胞中這個重要的致癌基因。最近我們發現許多培養的間充質幹細胞係都分泌Il-6細胞因子[11]。在我們的研究中,BCR/ABL負間充質幹細胞分泌大量的IL-6,因此,如果考慮將其用於自體移植與BMT聯合治療CML,則有額外的優勢。然而,TNFα和Bcl-2表達正常,表明BCR/ABL表型正常負細胞。
我們還通過免疫熒光檢測某些致癌蛋白的存在和缺失,以確認BCR/ABL的正常表型負細胞。在本研究中,我們觀察到很少BCR/ABL負細胞顯示EGFR蛋白,表明表型正常。類似的,H-Ras是一種致癌標記,幾乎存在於所有BCR/ABL中負細胞。H-Ras基因伴Waf1高表達可抑製K562細胞增殖在體外.BCR / ABL負細胞已顯示出這兩種基因的存在,有助於支持這些細胞的正常表型[26,27]。P53是一種著名的腫瘤抑製基因,常被BCR/ABL活性[28]下調。由於在這些細胞中沒有檢測到BCR/ABL,因此我們希望在細胞中觀察到該蛋白的存在。正如我們預期的那樣,幾乎所有這些細胞在整個細胞及其細胞核中都顯示出p53的明顯存在。也有報道在白血病細胞中p53基因的恢複可引起細胞凋亡,並增加正常類型細胞的增殖。我們還研究了Rb蛋白在BCR/ABL-ve細胞中的表達。Rb基因是另一種參與腫瘤發展的抑癌基因。據報道,血液係統惡性腫瘤可能是Rb基因功能障礙的結果,在少數病例中也有其缺失的報道。我們的研究顯示Rb基因在BCR/ABL中有表達負細胞。另一種抑癌基因p16則受到p53基因的嚴格控製。它促進細胞衰老,因此對許多類型的腫瘤細胞是致命的。p16在我們細胞中的存在表明正常的凋亡信號,這是正常細胞的另一個特征。我們還研究了由p53控製的waf1基因的表達。它參與了抗凋亡通路[31]。它明顯地定位在細胞核下方細胞質的細胞器樣結構中。因此,總的來說,這些免疫熒光研究清楚地表明BCR/ABL是正常的負從CML患者外周血中培養出的細胞係可作為BMT治療過程中的附加治療手段。
通過這些實驗收集的數據表明,這些細胞可能是正常的,在任何方麵似乎都不令人討厭,盡管來自CML的爆發危機患者。這些獲得正常骨髓間充質幹細胞的結果與先前報道的從CML患者[17]中分離出正常骨髓間充質幹細胞的研究一致。許多研究已經指出使用間充質幹細胞治療CML。據Zhao Z[31]的一項研究報道,它們支持造血。它們也被證明可以緩解GHVD, GHVD是HSCT中的一個普遍問題。骨髓間充質幹細胞用於聯合移植時,在支持其臨床使用[20]的患者中顯示出更好的緩解。MSCs在CML患者[32]中具有免疫調節作用。Koc和Lazarus[12]解釋了骨髓間充質幹細胞移植在許多疾病中的強大潛力。最近在美國舉行的國際血液學和血液疾病會議上,Farid[14]讚同MSCs可與造血幹細胞聯合移植治療CML的想法。骨髓間充質幹細胞聯合移植在患者和造血再生中表現出更好和更快的緩解[12-14]。 Hence, MSCs whether allogeneic or autologous, do have strong therapeutic potentials for treating this disorder in addition to BMT. There is a need to generate rigorous amount of data with large sample size and a robust biological marker profile in this area of work to come to final conclusion in using MSCs derived from CML patient’s peripheral blood can be used in combination with BMT to cure this disease without much side effect. We hope that this success will give great relief to CML suffering patients in near future.
確認
作者謹此感謝賈斯洛克醫院管理部門對491號幹細胞研究項目的資助以及Jacob Texy先生在研究過程中的技術幫助。
參考文獻
- 費城染色體的遺產。J臨床投資117:2030-2032。[Ref。]
- sawyer CL(1999)慢性髓係白血病。中華醫學雜誌341:1330-1340。[Ref。]
- 羅利·JD(1973)信:阿那平熒光和吉姆薩染色發現慢性骨髓性白血病中新的一致性染色體異常。性質1:290 - 293。[Ref。]
- drker BJ, Talpaz M, Resta DJ, Peng B, Buchdunger E,等。(2001)Rowley JD患者BCR/ABL酪氨酸激酶特異性抑製劑的有效性和安全性。一種新的一致性染色體異常慢性髓係白血病。中華醫學雜誌344:1031-1037。[Ref。]
- Kantarjian H, Giles F, Wunderle L, Bhalla K, O 'Brien S等(2006)nilotinb在伊馬替尼耐藥CML和費城染色體陽性ALL中的作用。中華醫學雜誌354:2542-2551。[Ref。]
- Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, Branford S, Radich J,等(2006)監測酪氨酸激酶抑製劑治療對CML患者的反應:綜述和建議協調當前檢測BCR/ABL轉錄物和激酶結構域突變的方法和表達結果。血108:28-37。[Ref。]
- 柯爾泰J,賈伯爾E, Kantarjian H,尹cc,單傑,等。(2007)多種酪氨酸激酶抑製劑連續治療慢性髓係白血病後BCR/ABL激酶結構域突變的動態。血110:4005 - 4011。
- 王曉燕,王曉燕,王曉燕,等。(2001)慢性髓係白血病患者中持續未檢測到分子殘留病變的白血病幹細胞持久性。血118:3657 - 3660。[Ref。]
- Goldman JM, Apperley JF, Jones L, Marcus R, goden AWG,等(1986)慢性髓係白血病患者骨髓移植。中華醫學雜誌314:202-207。[Ref。]
- Potdar PD, Subedi RP(2011)定義來自急性淋巴細胞白血病患者外周血的間充質和造血幹細胞用於再生幹細胞治療的分子表型。幹細胞再生醫學雜誌7:29-40。[Ref。]
- Koç ON, Lazarus HM(2001)間充質幹細胞:進入臨床。骨髓移植27:235-239。[Ref。]
- Kim EJ, Kim N, Cho SG(2013)間充質幹細胞在造血幹細胞移植中的潛在應用。Exp Mol Med 45: e2。[Ref。]
- Farid RJ(2013)慢性髓係白血病患者骨髓間充質幹細胞的分子和功能特征。國際血液學和血液疾病會議論文集,美國。[Ref。]
- 王曉東,王曉東,王曉東(2010)人內髒和皮下脂肪組織間充質幹細胞係的建立和分子特性研究。幹細胞再生醫學雜誌6:26-35。[Ref。]
- 王曉東,王曉東,王曉東(2010)人內髒和皮下脂肪組織間充質幹細胞係的建立和分子特性研究。幹細胞再生醫學雜誌6:26-35。[Ref。]
- Potdar PD, Deshpande S, Chagule S(2013)囊性水瘤細胞係的發育和分子特征在體外研究幼兒水腫進展的模型係統。PRIJ 2013: 1-13。[Ref。]
- Carrara RCV, Orellana MD, Fontes AM, Palma PVB, Kashima S等(2007)來自慢性髓係白血病患者的間充質幹細胞不表達BCR-ABL,異體骨髓移植後無嵌合。巴西醫學生物學雜誌2007:57-67。[Ref。]
- 林春春,寧浩,林剛,盧特芬(2012)CD34真的是間充質間質細胞的陰性標記物嗎?Cytotherapy 14: 1159 - 1163。[Ref。]
- 張豔,柴超,蔣秀生,Teoh shsh,梁誌強(2012)臍血CD34+細胞與人間充質幹細胞的共培養。組織工程12:2161-2170。[Ref。]
- 吳濤,白華,王長青,張強,坦太萊夫等(2009)自體骨髓間充質幹細胞與外周血幹細胞共移植治療血液惡性疾病。《中華內科雜誌》48:392-395。[Ref。]
- 熊媛媛,範強,黃芳,張瑩,王瑩等。(2014)間充質幹細胞與間充質幹細胞聯合臍帶血治療自體造血幹細胞移植後移植失敗的對照研究:一項前瞻性、開放標簽、隨機試驗。骨髓移植20:236-242。[Ref。]
- 死亡相關蛋白激酶:從調節細胞凋亡到腫瘤抑製功能和B細胞惡性腫瘤。細胞凋亡7:261 - 270。[Ref。]
- Nakamura S, Yokota D, Tan L, Nagata Y, Takemura T,等(2011)BCR ABL下調thanatos相關蛋白11通過c-Myc表達促進CML細胞增殖。國際癌症雜誌130:1046-1059。[Ref。]
- Rice KN, Jamieson CH (2005) CML幹細胞的分子途徑。國際血液學雜誌91:748-752。[Ref。]
- 孫建忠,陸燕,徐燕,劉峰,李發青,等。(2012)精實粒細胞性白血病中表皮生長因子受體表達與臨床預後相關。血液學檢查:89-97。[Ref。]
- Delgado MD, Vaqué JP, Arozarena I, López-Ilasaca MA, Martínez C等(2000)H-, K-和N-Ras通過p21waf1依賴機製抑製髓係白血病細胞增殖。致癌基因19:783 - 790。[Ref。]
- Steinman RA, Huang J, Yaroslavskiy B, Goff JP, Bvall ED,等。(1998)正常髓樣分化過程中p21 (WAF1)表達的調控。血91:4531 - 4542。[Ref。]
- 李麗,王麗,李麗,王智,何燕等。(2012)抑製SIRT1激活p53增強伊馬替尼對CML白血病幹細胞的清除作用。癌細胞21:266-281。[Ref。]
- Towatari M, Adachi K, Kato H, Saito H(1991)人視網膜母細胞瘤基因產物在慢性粒細胞白血病巨核細胞危象中的缺失。血7:2178 - 2181。[Ref。]
- Hernandez-Boluda JC, Cervantes F, Colomer D, Vela MC, Costa D, et al.(2003)慢性髓樣白血病進展到爆發危機的基因組p16異常:對42例患者的順序研究。血壓計31:204-210。[Ref。]
- 趙錚,唐鑫,尤勇,李偉,劉芳,等(2006)慢性髓係白血病患者骨髓間充質幹細胞生物學特性及支持造血功能的評估。Leuk Res 30: 993-1003。[Ref。]
- 鄒錫山,阿光宇,蘇玉光,鄒紅梅(2011)慢性髓係白血病患者間充質幹細胞免疫調節缺陷的研究。臨床癌症雜誌30:47。[Ref。]
在此下載臨時PDF
條信息
文章類型:研究文章
引用:Potdar PD, Lotey NK(2015)來自慢性髓係白血病(CML)外周血的BCR-ABL-ve間充質幹細胞的分離、表征和在增強CML患者骨髓移植潛力中的應用。Int J Stem Cell Res 1(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2472-6990.101
版權:©2015波達爾PD等。這是一篇開放獲取的文章,根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布,該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製,前提是注明原作者和來源。
出版的曆史: