圖1:大鼠脛骨鑽孔模型的建立及其術後愈合狀態。
答:操作圖;
B. x線顯示大鼠脛骨鑽孔模型;
氟。HE染色顯示骨折修複情況;
C、E 7th幾天後操作;
D, f . 14th幾天後操作。HE染色顯示,術後第7天骨折修複處於重建重建早期,術後第14天骨折修複處於重建重建中期。
全文
黃俊欽李吳皓帥帥張Huijie江冀萌當初王易高彭鄭程東升鍋Donglin李劉洋*Guoxian裴*
中國陝西西安,空軍醫科大學西京醫院骨科*通訊作者:空軍醫科大學西京醫院骨科裴國先,陝西西安710032電子郵件:nfperry@163.com
空軍醫科大學西京醫院骨科,陝西西安710032電子郵件:yangliu@fmmu.edu.cn
研究骨缺損愈合機製,對有針對性地采取措施促進骨缺損愈合具有重要意義。巨噬細胞是骨缺損愈合過程中必不可少的因子之一,可通過誘導骨形成促進骨修複,影響骨吸收。然而,調控巨噬細胞促進骨修複的上遊因子尚不清楚。巨噬細胞遷移抑製因子(MIF)可調節巨噬細胞的遷移和吞噬,與骨修複密切相關。本文旨在研究MIF是否能調節巨噬細胞對骨缺損的修複。本研究采用大鼠鑽孔模型檢測骨修複過程中MIF的表達和分布。我們發現MIF大量分布在巨噬細胞的溶酶體中,並且MIF+F4/80+巨噬細胞分布在骨修複活躍的區域,如骨小梁;此外,還發現初生愈傷組織期雙陽性細胞明顯多於成熟愈傷組織期。這些結果表明MIF參與了巨噬細胞促進骨缺損愈合的過程,MIF對巨噬細胞的調控可能是通過溶酶體進行的。
骨缺損是由創傷、骨腫瘤切除、骨髓炎、先天性骨缺損等引起的,給患者的身心帶來極大的痛苦。研究骨缺損愈合的具體機製,以采取有針對性的措施促進骨折愈合具有重要意義。巨噬細胞是骨修複過程中不可或缺的因素。Raggatt等人[1]發現,巨噬細胞被清除後,小鼠骨無法修複。巨噬細胞通過誘導骨形成和調節骨吸收促進骨修複。然而,巨噬細胞在骨修複中的調控因子仍不清楚。MIF是一種重要的促炎因子,可抑製巨噬細胞[3]的遷移,促進炎症巨噬細胞[4]的浸潤、聚集、增殖[5]和活化[6],增強其粘附和吞噬[7],促進多種炎症細胞因子[8]的產生。考慮到MIF對巨噬細胞的魯棒性作用,本研究旨在觀察MIF是否通過調節巨噬細胞促進骨修複。
材料雌雄SD大鼠12隻
第四軍醫大學實驗動物中心提供;金合歡蔗糖溶液:30g蔗糖,1g金合歡溶於100ml ddH2O;OCT冷凍切片包埋劑(Tissue-Tek 4583);多聚甲醛(西安赫特生物科技有限公司IS014);含DAPI的抗熒光貼裝培養基(HNFD-02,廣州皓馳生物科技有限公司);抗mif抗體(ab7207, abcam,稀釋因子500X);Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) - MIF對應二抗體(711-545-152,Jackson immune Research Inc,稀釋因子1000X);F4 / 80 (A-19)抗體(sc26642, Santa Cruz, 300X);Alexa Fluor 594 AffiniPure驢抗山羊IgG (H + L) - F4 / 80對應的二抗(705- 585-003,Jackson immune Research Inc,稀釋因子1000X)。
大鼠脛骨鑽孔模型
將12隻大鼠隨機分為A組和B組,每組6隻。每組隨機分為實驗組和假手術組,每組3隻。A組為術後7 d材料,B組為術後14 d材料。實驗組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(45mg / kg體重)。在仰臥位切開脛骨,刮除消毒,用無菌孔巾覆蓋。用尖皮切除脛骨斷裂的皮膚,用眼剪切除附著在脛骨中壁的肌肉,顯示脛骨斷裂。使用直徑2mm的鑽頭在脛骨脊平麵鑽一個孔,穿過單側皮質骨。在鑽井過程中,鑽頭受到了流水的衝刷。這個洞又被鹽水洗了一遍。皮膚用縫合線縫合,碘伏消毒。 The surgery ended there. The operation procedure of the sham operation group was the same as that of the experimental group, but without drilling.
Immunofluorescent染色
神經組織冷凍切片的獲取:巨鼠的無腱神經和坐骨神經獲得後立即放入4%多聚甲醛中固定24小時以上。之後,它們在霍爾特的相思蔗糖溶液中脫水72小時。將神經在-20℃冷凍切片機(LEIKACM1850)中用OCT冷凍包埋介質包埋,切成8um厚,-20℃保存在長端冰箱中。
大鼠脛骨鑽孔模型冰凍切片的獲取:手術製作鑽孔模型大鼠經血管灌注40°C鹽水清血,再灌注4%多聚甲醛。之後,將大鼠固定進行解剖。取脛骨鑽孔區域,用4%多聚甲醛固定一周。然後放入脫鈣液中,每3天更換一次脫鈣液。用刀片切割試樣的額外末端以測試脫鈣狀態。完全脫鈣後,在霍爾特皂莢蔗糖溶液中脫水72小時,在-20°C冷凍切片機(LEIKA CM1850)中用OCT冷凍包埋培養基包埋,切成8um厚,-20°C冰箱長期保存)。
Immunofluorescent染色:冷凍切片37℃孵育1h重新武裝;PBS衝洗3min × 3次;0.25% Triton X-100鑽孔30min;PBS衝洗3min × 3次;1%牛血清白蛋白阻斷孵育37°C 30min;一抗4℃孵育過夜;PBS衝洗3分鍾× 5次;與相應的孵化。
第二抗體在37°C下加入1h;PBS衝洗3min × 5次;加入含DAPI的抗熒光安裝介質後安裝。用尼康Eclipse 80顯微鏡自帶的NISElement F軟件對結果進行觀察,並保存圖像。
大鼠脛骨鑽孔模型的建立及術後愈合情況
采用大鼠脛骨鑽孔模型研究骨修複過程。HE染色顯示術後7 d形成大量新骨小梁,但均較短。術後14 d,骨小梁開始沿應力方向連接,骨髓腔內骨小梁數量開始減少,骨髓腔開始逐漸滲透。如圖1所示,骨修複在7d後處於重建早期,14d處於重建中期。
MIF是巨噬細胞的吞噬作用,定位於骨修複活性活躍的區域
免疫熒光染色顯示F4/80能標記巨噬細胞。MIF+F4/80+雙陽性細胞分布於骨修複活性區,如新生骨小梁周圍。在陽性細胞中,溶酶體結構可以清晰顯示,MIF也定位在溶酶體囊泡中(圖2)。
圖2:脛骨鑽孔骨修複中MIF和巨噬細胞的分布。
A-F4/80,紅
B-MIF,綠色
B, C- DAPI -核,藍色
在陽性細胞(A)中,溶酶體結構可以清晰顯示,MIF也定位於溶酶體囊泡中(黃色箭頭)。MIF + F4 / 80 +雙陽性細胞位於重構小梁周圍(紫色箭頭)。
MIF+F4/80+雙陽性細胞在骨修複早期發揮更大作用
免疫熒光染色顯示,骨缺損中MIF+F4/80+雙陽性細胞數量較多th一天比14th術後第一天(圖3)。
圖3:脛骨鑽孔骨修複中MIF和巨噬細胞的分布。
A-F4/80,紅
B-MIF,綠色
B, C- DAPI -核,藍色陽性細胞(A),溶酶體結構清晰可見,MIF也定位於溶酶體囊泡中(黃色箭頭)。MIF + F4 / 80 +雙陽性細胞位於重構小梁周圍(紫色箭頭)。
巨噬細胞參與骨修複的每個階段,這需要清除壞死組織[9]和伸長新骨結構恢複正常的骨結構和功能[10]。固有免疫細胞,特別是巨噬細胞,可在骨損傷早期立即檢測到[11]。這些巨噬細胞誘導一連串反應,首先清除受傷後形成的血塊,導致m被肉芽組織[12]所取代;隨後肉芽組織開始合成代謝,誘導其逐漸演化為骨膜愈傷組織或骨橋可用的結構;這些臨時的骨骼結構逐漸重塑為正常的骨骼結構和強度[13]。巨噬細胞在骨修複中非常重要,但在這一過程中調控巨噬細胞的關鍵因素尚不清楚。
MIF在骨修複中起著重要作用。mif -敲除小鼠骨缺損修複嚴重延遲,配對過程中礦物沉積率明顯低於正常小鼠[14]。Onodera[15]等在小鼠股骨骨折模型中檢測了MIF的表達和分布。半定量PCR結果顯示,MIF在骨折愈合過程中呈高表達,在骨折後第4天達到峰值。免疫組化結果顯示MIF的表達增加位於骨修複活性區。骨折後4d肉芽組織中出現MIF;7 ~ 10d後出現骨膜增厚、其下的膜內成骨細胞及軟骨愈合組織的軟骨;並於14-28天後出現在軟骨愈合組織的軟骨中。在這一階段之後,MIF的量逐漸減少。本研究顯示MIF+F4/80+巨噬細胞位於骨重塑活躍區,如新骨小梁形成區。 Further, we found the double positive cells on the 7th術後天數遠多於14例th幾天後操作。這些結果表明MIF+ F4/80+巨噬細胞參與骨修複。其中大部分在骨修複的早期階段起作用。此外,MIF更局限於巨噬細胞溶酶體中,提示MIF對巨噬細胞的調控可能通過溶酶體。但具體機製仍需進一步研究。
MIF參與巨噬細胞的骨修複過程。其對巨噬細胞的調節可能是通過溶酶體進行的。
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Aritcle類型:研究文章
引用:李靜,吳紅,張珊珊,薑紅,王靜等(2018)MIF通過調節巨噬細胞促進骨缺損修複。細胞幹細胞再生醫學3(2):dx.doi.org/10.16966/2472-6990.119
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