幹細胞研究科學Forschen

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研究文章
骨組織工程細胞療法與脈衝電磁場治療骨質疏鬆症的最佳療效時間

克裏斯蒂娜·L·羅斯

再生醫學係,維克森林再生醫學研究所,維克森林中西醫結合中心,醫學中心大道。溫斯頓-塞勒姆,美國北卡羅來納州

*通訊作者:Christina L Ross,維克森林醫學院再生醫學研究所,美國卡羅萊納州溫斯頓-塞勒姆391技術路,電話:+ 1-336-713 - 7274;傳真:+ 1-336-713-7290;電子郵件:chrross@wakehealth.edu


摘要

在發達國家,60歲以上的人口中有一半患有骨質疏鬆症。各種合成代謝,抗吸收,激素替代療法和骨移植已被用於保持健康的骨量和強度;然而,它們會產生嚴重的副作用。為了測試藥物替代療法,我們評估了FDA批準的三維生物降解聚l -乳酸支架的效果,該支架植入成骨細胞和間充質間質/祖細胞,暴露於15 Hz, 2.4毫特斯拉脈衝電磁場中,通過刺激成骨促進成骨骨再生。一旦粘附,細胞支架評估活性成骨骨蛋白,以提供證據,PEMF加速成骨細胞和MSC增殖、分化和礦化。對活性成骨標誌物的評估顯示,脈衝電磁場使細胞治療中骨鈣素、骨橋蛋白和堿性磷酸酶的水平提高了30%。在7-14天內觀察到成骨率的增加,為脈衝電磁場治療和細胞種子組織工程支架結合提供了一個有效的窗口。PEMF與生物工程細胞療法的結合可以為目前組織可用性有限、供體位點發病率、免疫排斥和自體移植物引起的病原體轉移等問題提供替代療法。

關鍵字

脈衝電磁場;間充質基質細胞;骨組織工程;骨質疏鬆症;骨生成

縮寫

脈衝電磁場;間充質間充質細胞;骨組織工程;激素替代療法:激素替代療法;甲狀旁腺素:甲狀旁腺激素

簡介

骨質疏鬆症是一種骨骼疾病,其特征是骨骼強度下降,增加骨折的風險。除了生活質量受損外,骨質疏鬆症[1]患者的死亡率也會增加。目前的估計預測,在發達國家,60歲以上的人口中有一半將患有骨質疏鬆症[2],2005年美國有170億美元直接花在骨質疏鬆性骨折的護理上,預計到2025年骨質疏鬆症相關的直接成本將增加到250億美元[3]。目前正在使用激素替代療法[HRT]、合成代謝和抗再吸收藥物等藥物治療骨質疏鬆症,但激素替代療法[HRT]等不同治療方法的不良反應可能會導致乳腺癌的高發,這取決於治療時間的長短和患者的年齡。據報道,用於治療骨質疏鬆症的生物磷酸鹽會導致頜骨結構[5]的骨壞死,而長期使用甲狀旁腺激素(PTH)已收到美國食品和藥物管理局關於骨源性肉瘤[6]的“黑箱”警告。異體骨移植和自體骨移植也被使用;然而,自體移植物[7]引起的病原體轉移和同種異體移植物[8]引起的免疫排斥導致這些手術的並發症。

不使用藥物或骨移植治療骨質疏鬆症的替代方法包括成體幹細胞。成體幹細胞已在臨床上應用了十多年,主要用於治療組織損傷和免疫紊亂。特別是,來源於成人骨髓的間充質間質/祖細胞[MSCs -有時被稱為間充質幹細胞],由於其免疫抑製和免疫回避的特性,為骨骼疾病的骨修複提供了有前途的幹細胞群[9];然而,它們在骨組織再生方麵的一致性仍在研究中。越來越多的數據表明,幹細胞功能受到來自細胞外微環境的外源信號的重要影響[10,11]。

脈衝電磁場[PEMF]治療骨質疏鬆症的最新進展表明,小梁和皮質骨微結構[12]的惡化有所減少,骨力學性能如最大載荷、剛度和彈性模量[13]也有所改善。這一效應涉及到成骨細胞及其祖細胞的一係列反應。另一種治療骨質疏鬆症的非藥物療法是骨組織工程[BTE],它涉及到通過生物材料、細胞和生長因子[7]的協同組合誘導新的功能性骨再生。在本研究中,我們將MSCs植入BTE支架,並暴露於PEMF中,以確定這三種聯合療法如何提供更有效的刺激骨再生的方法。使用間充質幹細胞是因為它們很容易在組織培養中粘附在聚合物[14]上,而且它們的高增殖率,加上它們耐受冰凍溫度的能力,允許它們在臨床相關數字[15]中膨脹。它們也傾向於找到表達炎症分子的受損組織位點,這表明在炎症組織中植入具有更高的療效。用分化培養基(DM)可以刺激培養的MSCs影響[16]組織類型。有報道稱,在培養中對MSCs應用適當的物理刺激(如PEMF)可以克服與標準培養係統相關的挑戰,即擴散受限、細胞基質分布不均勻、細胞增殖和分化減少[17]。有報道稱,添加3d生物可降解聚合物支架可增強骨的形成,支持MSCs的積累,並直接增加損傷組織部位[18]的劑量。雖然聚l -乳酸[PLLA]基的BTEs[19]和MSCs[20]對成骨分化的作用已經被證實,但本研究的目的是研究PEMF是否可以使用這些BTE和MSC方法加速成骨過程。

材料和方法
細胞培養

成骨細胞:作為對照,ATCC [Manassas, VA]胎兒成骨細胞[FOB]在Ham 's F12培養基和2.5 mM l -穀氨酰胺(不含酚紅)的混合物中培養。在基礎培養基中加入0.3 mg/ml的G418和10%的胎牛血清[FBS],製成完整的培養基。細胞培養在34°C, 5% CO2,根據製造商的說明。細胞數量增長到80%。模擬原位環境下,促進成骨分化的生長因子包括:20 mg/ml轉化生長因子-β [TGF-β];血管內皮生長因子[VEGF] 20 mg/ml;骨形態發生蛋白[BMP-2] 20 mg/ml。

人類BM-MSCs:間充質幹細胞生長培養基和補劑[MSC-GM, Lonza, Walkersville, MD]用於培養先前鑒定的hBM-MSCs[21]。細胞在T-75燒瓶中培養,每個燒瓶使用36 ml培養基,37°C, 5% CO孵育2,在誘導成骨前生長到100%融合。為了刺激成骨,分化[誘導]培養基[DM]聯合使用DMEM低糖[Invitrogen, Carlsbad, CA], 10%胎牛血清,100 nM地塞米鬆[Sigma, St. Louis, MO] 10 nM β-甘油磷酸[Sigma]和0.05 mm 2-磷酸- l抗壞血酸[Sigma]。在3周內,每3-4天更換一次培養基,用新鮮的成骨誘導培養基完全替代培養基。

BTE支架和細胞播種:Poly-D, l -乳酸[PLLA] Bio Mesh [Biomedical Structures, Pinebluff, NC],孔隙率為83.5%,平均尺寸為12.1µ作為支架基底。選擇這種特殊的聚合物是因為它的強度和靈活性,類似於天然骨[22]。為了避免降解,生物網格保持在-80°C直到準備使用。用無菌鑷子和剪刀剪出適合1cm的網孔2方形的矽膠三明治框。滅菌用環氧乙烷[EtO]。使用5 ml移液管,將支架浸泡在磷酸鹽緩衝鹽水[PBS]和20 mg/ml纖維連接蛋白[Thermo Fisher Sci, Waltham, MA]中,直到充分吸收。支架材料有點疏水,所以需要軟壓力來徹底浸泡它,而不破壞纖維。飽和後,支架孵育至少1小時,然後抽走PBS。然後將細胞培養基移到非組織處理的150 mm板中,細胞以10 × 10的速度播種到支架上6細胞/厘米2.矽膠夾芯模具中心加料,確保支架和框架不漂浮。細胞支架分為4組:1]隻有分化培養基[DM]的成骨細胞[FOB + DM];2] DM的成骨細胞暴露於PEMF [FOB + DM + PEMF];3]隻含DM的MSCs [MSC + DM];與DM暴露於PEMF [MSCs + DM + PEMF]的MSCs。

PEMF治療:細胞種子支架,在框架中,直接從培養皿(包括培養基)中取出,放置在34°C[成骨細胞]或37°C [MSCs]水浴中,暴露在由Helmholtz線圈產生的15 Hz, 2.4 mT均勻PEMF中(圖1),持續20分鍾,3次/周,持續3周。選擇這個時間點是因為之前報道過它在刺激成骨分化[23]上的成功效果。我們的目的是利用先前鑒定的BM-MSC係[21],證明PEMF可以加速MSCs在FDA批準的生物可降解PLLA支架上的分化能力。細胞DM含有甘油磷酸酯、抗壞血酸和地塞米鬆,這些已被用於在CO外保存的細胞中保存高達90%的細胞活力2恒溫箱可持續24小時[24]。成骨細胞和間充質幹細胞的對照均來自培養箱中保存的同一細胞批次。所有的PEMF處理均在培養基更換後立即進行。在第0天[24小時]、第7天、第14天和第21天取上清樣品。

圖1:PEMF發電設備。
MSCs暴露在15 Hz, 2.4 mT的均勻PEMF下20分鍾/天,3次/周,持續21天。由亥姆霍茲線圈產生的場。示波器測頻,高斯計測場強。

形態學評價:檢測細胞附著在支架上的形態學評估包括使用共聚焦顯微鏡(Olympus Fluo view FV 10i)拍攝的圖像,通過Dapi(濃度為1:1000比Dapi與PBS)染色細胞核來評估細胞附著。細胞活力測定使用活的[綠色]/死的[紅色]鈣黃蛋白試劑盒[分子探針,Eugene, OR],按製造商說明。所有照片都是用10倍物鏡拍攝的。掃描電子顯微鏡]was used to detect bone formation and tissue matrix. All images were taken at day 0 [24 h], 7 days, 14 days, and 21 days.

骨蛋白評價:酶聯免疫吸附試驗[ELISA]試劑盒:骨鈣素試劑盒[Invitrogen, Carlsbad, CA];骨橋蛋白試劑盒[Ray Bio Norcross, GA]和堿性磷酸酶試劑盒[Ray Bio]是根據製造商的說明使用細胞上清樣本,在-80°C冷凍直到可用。一旦測試,樣品在450nm的微量滴定板上讀取。

統計分析:實驗共進行了四個試驗。結果用均數±均數標準誤差表示。ELISA組間比較采用單因素方差分析(單因素方差分析),以p < 0.05為差異顯著。

結果

骨重塑是破骨細胞吸收和成骨細胞形成骨組織的高度綜合過程,其結果是精確平衡的骨量與礦化基質的更新。生物礦化是羥基磷灰石沉積在細胞外基質[ECM][25]中的過程。骨再生的理想參數包括生物相容性支架,該支架與天然骨ECM、間充質幹細胞或骨組織基質所需的成骨細胞密切相似。形態發生信號也有助於將細胞導向表型所需的類型[7]。

在這項研究中,與對照組相比,暴露於PEMF處理超過21天的細胞表現出了更好的聚集和附著。FOB vs FOB + PEMF和MSCvsMSC + PEMF在7-14天之間的附著效果最佳(表1)。21天內的活/死評估似乎在7-14天內也是最可行的(表2)]used to assess bone formation and tissue matrix after exposure to PEMF, show more effective differentiation of both FOB and MSC to bone-like structure between 7-14 days when exposed to PEMF for 20 min/day 3d/wk for 21 days, compared with controls (Table 3). After 21 days cells became osteoclasts [bone resorption], which is defined as the process by which osteoclasts break down bone and release the minerals, resulting in a transfer of calcium from bone fluid to the blood.

表1:細胞連接:用DAPI染色細胞核評估PLLA支架上的細胞粘附。圖像采用共聚焦顯微鏡Olympus fluview FV 10i成像係統,使用100 μ m刻度條在10倍顯微鏡下拍攝。當暴露於PEMF時,最佳的細胞聚集和附著出現在細胞播種後的7-14天之間。

表2:細胞活力:用活/死染色技術(活綠、死紅)評估細胞活力,並使用共聚焦顯微鏡Olympus Fluoview FV 10i成像係統,刻度條設置在100µm。細胞在PLLA支架上播種並暴露於PEMF後的7-14天內表現出最具活力。

表3:細胞成骨:S.E.M.圖像(100 - 200 μ m)顯示,在PLLA支架上播種細胞7-14天後,骨樣結構發生了更大的成骨形成。綠色箭頭為膠原纖維,紅色箭頭為鈣化,黃色箭頭為囊泡基質。

評估成骨活性標誌物,並與骨髓來源的成骨細胞進行比較,以確定骨形成過程。這些標誌包括骨基質的合成和致密礦化的形成。對成骨細胞和MSC支架樣本進行了骨鈣素[OCN -形成骨組織的標記物]、骨橋蛋白[OPN -將骨細胞固定在礦化骨表麵]和堿性磷酸酶[ALP -使磷酸鹽可用於鈣化]的檢測。在7-14天的時間內通過暴露於PEMF,所有這些蛋白水平似乎都增加了(圖2)。在21天的研究中,暴露於PEMF治療後,成骨細胞中OCN(圖2a)、OPN(圖2b)和ALP(圖2c)的蛋白水平最高增加了3倍,在MSCs中增加了1.5倍。數據(圖2d)顯示了不同骨蛋白和時間點的平均值±SD。

圖2:骨蛋白OCN, ALP和OPN的產生。對成骨細胞和間充質幹細胞支架樣本進行了檢測
OCN。
OPN b)。
c)高山
ELISA檢測所有蛋白水平。這三種骨骼標記物的水平在第7天到14天之間增加最多。
d) ELISA檢測OCN、OPN、ALP水平。
這三種骨骼標記物的水平在第7天到14天之間增加最多。

討論

成骨是一係列複雜的事件,通過骨髓[BM]來源的間充質幹細胞分化產生新骨。骨蛋白表達的時間和功能模式是成骨細胞成熟過程的特征,可分為增殖、分化和礦化三個階段。OCN,即骨Gla蛋白], is the major non-collagenous protein of the bone matrix. It is synthesized in the bone by the osteoblasts, whereby OCN levels reflect the rate of bone formation [26]. OPN has been shown to improve bone toughness, suggesting its importance in preventing crack propagation, thereby affecting bone mass, structure, and matrix porosity [27]. As an active marker of osteoblasts and hard tissue formation, alkaline phosphatase [ALP] is crucial to the mineralization process [28]. In osteogenesis, success is measured by robust expansion of ALP, leading to mineralization of the neotissue [29,30].

BM-MSCs具有特征性鈣[Ca2 +參與細胞內信號傳遞的波。Ca2 +振蕩在pemf誘導的細胞向各種組織類型[31]分化中起著關鍵作用。PEMF刺激成骨的能力取決於成骨細胞的成熟階段,在分化和礦化過程中通過增加骨標記基因的表達可以增強鈣化基質的生成[32,33]。質膜通常被認為是PEMF信號的主要目標,大多數結果表明,由於受體位點作為信號級聯[16]的調節器,離子或配體結合的速率受到影響。特低頻PEMF[34]對膜表麵電荷和電位等電學特性的影響尤為顯著。例如,PEMF可以誘導細胞膜的去極化,隨之而來的是細胞內鈣的增加或減少2 +我[34]。作為第二個信使,Ca2 +離子參與細胞生長和發育的所有階段的調控,包括增殖和分化,以及細胞骨架元素[34]的組裝和拆卸。

在理解生長因子對骨祖細胞的調控方麵取得的重大進展表明,它們激活的信號通路[35]之間存在廣泛的交叉信號。這也適用於PEMF與信息傳輸的相互作用。質膜是細胞外環境和細胞內部之間的重要屏障,在電阻和信息傳遞方麵都是如此。據報道,暴露於外源性刺激,如PEMF,可通過離子動力學和小信號分子[16]促進骨髓間充質幹細胞的增殖和分化。質膜通常被認為是PEMF信號的主要靶點,因為它影響作用於受體位點的離子或配體結合的速率,從而調節信號級聯[16,36,37]。在幹細胞向特定方向移動和生長以形成組織的過程中,離子通量與分化的控製密切相關。據報道,PEMF影響許多生物學功能,如基因表達、細胞命運和細胞分化;然而,一定範圍的低頻振幅會產生特定的效應[16,37]。一個合理的解釋是,PEMF可能與已經存在的膜信號轉導機製相互作用,該機製具有極高的敏感性和特異性,可以檢測和轉導細胞外環境[38]中的低水平信號。

在本研究中,已知的成骨增強方法PLLA支架與間充質幹細胞聯合使用,以確定PEMF是否可以加速骨的分化,以治療骨質疏鬆症。先前的研究報道了骨髓間充質幹細胞用於骨移植的有益用途,因為它們可以很容易地從成人骨髓中分離出來,並在創傷後自然分化[15]。PEMF刺激多年來一直用於治療骨折愈合,具有臨床療效[16,39],多項研究證實其能夠促進骨組織再生而不產生不良反應[13,40-42]。特別有趣的是,治療參數在15 Hz ([0.4 mT - 3.2 mT])範圍[16]中最有效,因此效果似乎是頻率特異性的。多年來,PEMF一直被認為是一種很有前途的替代骨質疏鬆藥物治療方法,它可以增加骨密度和防止骨質流失[43,44]。PEMF也可以外源應用,以獲得術後[45]的持續效果。本研究中使用的PEMF [15 Hz, 2.4 mT]的頻率和強度與之前關於MSC分化[16]和骨生長[46]的報道一致。需要進一步的研究來確定PEMF是否刺激了其他的成骨信號,以及是否產生了足夠的血管化以滿足不斷增長的組織營養供應。

結論

PEMF聯合MSCs和BTE支架可以為目前骨質疏鬆的藥物治療、自體移植物引起的病原體轉移和同種異體移植物引起的免疫排斥提供替代治療方法。據報道,低頻PEMF可有效增強成骨,而在藥物治療和移植中無負麵影響的報道。這裏我們展示了15赫茲,2.4 mT,每天20分鍾,每周3次,持續3周的增強效果。PEMF能夠刺激成骨細胞和間充質幹細胞的骨生長,形成骨的速度比以前使用的方法快30%。給藥的藥效窗口期似乎在7-14天之間。綜上所述,這些結果表明,PEMF比單獨的分化培養基更有效地增強MSC種子支架形成成骨細胞的承諾。

致謝

這項研究得到了維克森林綜合醫學中心的支持,批準號為。120-330-740196和維克森林再生醫學研究所轉化資助號。730-120000-00000-110494。作者感謝Graça Almeida-Porada, MD, PhD慷慨捐贈本研究中使用的stro1間充質間質細胞[MSCs]。

的利益衝突

作者沒有利益衝突需要報道。


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Aritcle類型:研究文章

引用:Ross CL(2017)骨組織工程細胞療法和脈衝電磁場[PEMF]治療骨質疏鬆症的最佳療效時間。細胞幹細胞再生醫學3(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2472-6990.116

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出版的曆史:

  • 收到日期:2017年12月03

  • 接受日期:2017年12月22日

  • 發表日期:2017年12月29日