摘要

摘要目的:糖尿病足綜合征(DFS)是糖尿病最嚴重的並發症之一，顯著降低患者的生活質量。細胞療法是治療DFS最有前途的領域之一。

研究設計與方法:在提出的原始研究中，52例接受自體骨髓單個核細胞治療的患者與對照組46例接受保守抗糖尿病治療的患者相比，生活質量有顯著改善。所選方法的主要特點是重複使用約3 × 10的相對小劑量⁸在骨髓單個核細胞中，交替加入更小劑量的冷凍在液氮中的相同細胞。

結果:最佳的方法是交替進行1個主要程序，然後從冷凍中補充兩次細胞，周期為2個月。采用這種方法，在開始治療8-9個月後進行下一個基本手術，完全避免了患者潰瘍的形成。在整個觀察期間，沒有患者報告有任何副作用，表明該方法是安全的。

結論:由於采用局麻下單點穿刺活檢，細胞材料的標準工作方法和患者自體血清的使用，所開發的方法是非常有效的，負擔得起和安全的患者方式的DFS治療。

關鍵字

糖尿病足綜合征;骨髓;單核細胞;汽車移植;低溫貯藏。

簡介

糖尿病足綜合征(DFS)是糖尿病最嚴重的並發症之一。DFS導致生活質量顯著下降，整體發病率和死亡率增加，造成巨大的衛生資源消耗[1,2]。DFS的出現有多種原因，如下肢缺血、神經病變、創傷和感染效應。糖尿病血管紊亂導致長期無法愈合的潰瘍，通常唯一的治療方法是截肢。

DFS流行病學似乎相當複雜，因為沒有單一的標準來評估病情和診斷試驗。值得注意的是，不同人群中DFS的患病率有顯著差異。據信，在西方國家，大約2%的糖尿病患者患有長期無法愈合的潰瘍。據其他估計，此類患者[3]一生中發生DFS的風險達到25%。

由於糖尿病對外周動脈影響的具體表現，早期通過評估血供的有效性來診斷DFS是相當困難的。通常，隻有在現代的多分支中心，在血管外科醫生、介入放射科醫生、微生物學家和其他一些方向的專家的參與下，才能通過手術血管重建方法進行及時診斷、預防和有效治療。

由於對該綜合征性質的新數據發現，DFS的分類正在不斷變化。考慮到肢體損傷發展的各種病理生理機製的影響，根據世界衛生組織的標準，自1991年以來已接受分離神經性、缺血性和神經缺血性形式的DFS。後來，根據病變的組織定位，並考慮到周圍神經係統的實際專屬病變，開始分離出無骨關節病的神經病變型、伴骨關節病的神經病變型、神經缺血型和神經萎縮型DFS。根據潰瘍損害的程度和深度，一般接受的分類有三種:根據Wagner[6]，英國作者提出的S(AD) SAD的分類[7]和德克薩斯大學[8]的分類。盡管存在一些差異，但這些分類通常根據病變的深度和寬度、深部組織的受累程度、有無缺血、膿腫、敗血症、畸形以及多種因素的組合對不同階段的DFS進行劃分。

DFS的保守治療方法包括:首先，穩定血糖水平和血壓是綜合征發展的主要發病因素。下一步是改善神經元營養，刺激脂質和碳水化合物代謝，加強外周血流量，藥物血管擴張作用。此外，也可以使用重建血管手術，在不利的情況下，擴大手術幹預以防止敗血症[5]。

由於DFS患者的引導複雜，保守治療方法缺乏療效，近年來DFS治療的新途徑不斷被探索。最有前途的趨勢之一是使用細胞療法。近年來，使用自體骨髓細胞[9-11]、外周血流前體細胞[12,13]、活化淋巴細胞[14]、自體間充質骨髓幹細胞[15]治療DFS的有效性已被反複證實。當使用含有血管內皮生長因子(VEGF)基因[16]的自由質粒構建細胞治療和局部基因治療的聯合方法時，已顯示出顯著效果。盡管異體間充質幹細胞的應用前景明朗，但在治療DFS的臨床實踐中仍不能接受，因為有許多尚未解決的問題[17,18]。主要問題是與受體免疫係統的潛在衝突。胚胎多能臍帶血細胞在實驗動物模型上的應用可能性的大量研究也沒有進入臨床實踐[19,20]。

本研究證明了使用相對簡單和安全的方法自體骨髓單個核細胞移植治療DFS的優勢，即使是在後期。長期結果顯示所選方法在改善患者生活質量方麵的優勢是毋庸置疑的，總體上與早期的闡述一致[21]。所述的直接手術操作、細胞生物學技術和低溫生物庫技術的結合顯著改善了所獲得的臨床結果，使方法本身創傷更小，對患者更方便。

研究設計與方法

病人

研究參與者是俄羅斯西北部地區的居民，他們在2008-2017年在聖彼得堡國立大學大學醫院(俄羅斯衛生部聯邦國家預算機構聖彼得堡多側中心)接受治療。實驗樣本包括52例嚴重DFS患者，其中男性36例，女性16例。平均年齡為63.5歲(55 ~ 84歲)。對照組46例，包括因各種原因不同意使用細胞生物學技術治療而隻接受保守治療的DFS患者。這種保守治療包括穩定血糖水平，根據適應症進行胰島素治療，降糖藥物，心肌藥物，穩定血壓，例如-受體阻滯劑，利尿劑，血壓，例如-受體阻滯劑，利尿劑。

倫理協議包括三個階段

所有患者均填寫了知情同意書，同意參與研究，提供研究所需的生物材料，以及用於統計處理的個人數據。這項研究本身得到了聖彼得堡國立大學大學醫院倫理委員會的批準。此外，該程序本身獲得了俄羅斯衛生部批準的方法的地位。

納入試驗組患者的參數

無精神病反應，無ESR和c反應蛋白控製的急性感染過程，無中性粒細胞增多，白細胞中毒指數受控，無貧血，血紅蛋白水平低於90 g/l，無血小板減少小於100 × 109/l。

在實驗樣本中，患者被分為三組

1) WHO骨髓細胞自體移植1次(25人)，2)骨髓細胞自體移植2 - 5次(10人)，3)骨髓細胞自體移植後使用低溫保存和液氮保存的細胞作為自體移植材料(17人)。

獲取骨髓細胞

采用骨盆回腸骨脊單點穿刺活檢法獲取骨髓細胞。手術是在無菌條件下進行的操作(手術室)在局部麻醉下。穿刺針采用miello - can 15G (Sterylab, Italy)。將骨髓置於預先準備好的無菌50 ml試管中，試管中含有20 ml添加50 IU/ml肝素的NaCl溶液。填滿後，管子立即關閉並整齊混合以稀釋骨髓。

為製備自體血清，采用標準靜脈穿刺，使用Lind-Vac真空係統(Corway，愛沙尼亞)。

單個核細胞組分的分離

患者骨髓穿刺活檢的單個核片段細胞采用原有方法，以[22]為基礎。通過操作獲得稀釋骨髓的試管被轉移到細胞生物學實驗室。所有使用生物材料的程序都在無菌室中II級保護的層流箱中進行。稀釋後的骨髓分層於等量密度梯度Histopack 1077 (Sigma-Aldrich, Germany)上。在400G下離心35分鍾進行分餾。包含單個核細胞組分的間期被轉移到一個幹淨的試管中，在RPMI 1640培養基中進行兩級洗滌(俄羅斯Biolot)。在第一次清洗過程中，在培養基中加入25 IU/ml的肝素，以防止殘餘血小板凝固。將純化的單個核細胞置於培養皿中(Thermo Scientific Nunc，丹麥)，在添加5%患者自體血清的RPMI 1640培養基中進行細胞培養，並在5%的氣氛中СО培養1小時₂．隨後將與底物細胞不粘附的培養基離心，將細胞置於5- 8ml NaCl溶液中製成懸浮液，並分成若幹等份:立即給患者服用，2-3份冷凍保存，用於計數。計數在Goryaev腔或使用Sysmex XT 2000i血液分析儀(Sysmex，德國)進行。在使用分析儀的情況下，按分化和成熟度將細胞分離成部分進行計數

低溫貯藏

2 ~ 3個分離骨髓單個核細胞的等分體，懸於20 ~ 30 × 10⁶每個細胞置於2ml低溫瓶(Thermo Scientific Nunc，丹麥)中，置於以下培養基中:80% RPMI 1640, 10% DMSO (Sigma-Aldrich)， 10%患者自體血清。冷凍保存使用可編程冷凍設備Cryologic CL 8800i (Cryologic Pty。Ltd，奧地利)使用Cytogenesis軟件(CryoLogic)。冷卻速度為1^°С/分鍾，在0處暫停20分鍾^°C.隨後將帶細胞的低溫容器轉移到液氮中。

為了解凍，從液氮中取出冷凍瓶，在37°С的水浴中加熱20分鍾。此外，在純PRMI培養基中進行離心洗滌，計數細胞數量和活力評估，準備3-5 ml NaCl溶液中的細胞懸液給患者服用。

將細胞引入病人體內

從細胞生物學實驗室獲得的細胞懸液被轉移到操作(操作)中，徹底而整齊地混合，並放入幾個1ml的胰島素注射器中。在相對健康的組織中，沿潰瘍邊緣盡可能靠近患肢區域，進行3-8毫米的肌肉注射。根據潰瘍的大小和獲得的細胞數量，總注射點為15-20個。根據潰瘍的定位，注射嚐試考慮供應血管的解剖結構。在注射部位和患肢處用無菌繃帶包紮。3天後監測患者的病情，然後在1-2個月內每周監測一次，如果可能的話，每月監測一次。

每隔1-2個月將冷凍保存後的細胞重新導入。在這種情況下，注射點為5-10，這取決於麥芽釀造後存活的細胞數量。

使用標準Microsoft EXCEL XP工具包進行統計分析。

結果

病人的狀況

圖1所示為這種治療DFS的研究方法的結果

圖1:DFS治療的原理圖。

大多數患者(33人)申請使用細胞技術的醫療援助，有嚴重的潰瘍表現。根據德克薩斯大學的分類，它們對應於3-6類。19例壞疽組織患者已經進行了截肢。6例患者在2-3類DFS存在的情況下直接申請了該手術。

由於采用自體骨髓細胞單個核片段移植治療，在大多數病例中，DFS的嚴重程度有所下降，可以注意到保留了3類，但這隻是由於存在累贅的記憶。在所有觀察到的患者中，生活質量的顯著改善表現為潰瘍的愈合，缺血和神經病變水平的減少。根據Karnofsky性能狀態，患者的生活質量從最初的40-50分上升到90[23]分。如果患者在治療前需要特殊護理和醫療護理，那麼在治療過程結束後，他們表現出持續的日常活動，並表現出中度的疾病表現。然而，考慮到經過一個月的初步手術和觀察後，部分患者(12人)從視野中消失，在評估這些結果時應謹慎。另一部分患者(19人)在觀察至少一年後從視野中消失，在此期間有明顯的改善。其餘21例進行定期觀察，並在冷凍保存後進行二次細胞移植。這些患者沒有出現繼發性潰瘍風險的跡象。潰瘍愈合的一個最顯著的例子如圖2所示。

圖2:患者Т，男性，63歲。(a)在細胞治療前截肢後潰瘍未愈合，(b) 2個月後3.28 × 10⁸潰瘍周圍注射自體骨髓單個核細胞。

相反，對照組患者對保守治療的反應呈經典分布。46例患者中31例病情穩定，但仍存在潰瘍、血管病變和缺血的風險。在對15人進行1-2年的觀察中，記錄了情況的惡化，表現為涉及足部深層組織的潰瘍的發展。其中11人後來需要進行廣泛的手術治療。

實驗組患者在觀察過程中均未出現任何副作用，包括自身免疫過程、腫瘤疾病、心髒和血管疾病。由此得出了該方法安全性的結論。

骨髓取樣最佳條件的選擇

骨髓取樣選擇骨盆回腸骨頂單點穿刺技術。這種方法有許多優點，例如有可能獲得足夠有效的骨髓量，使用局部麻醉，因此對患者的創傷較小，顯著降低了手術費用，因為隻使用手術室而不是手術室，不需要麻醉團隊的服務。

其中一個主要的骨髓采樣參數是預防凝血。在研究的最初階段，即使使用了抗凝血藥物，也經常形成凝塊。骨髓采集於50 ml試管中，1 / 3試管中加入肝素50 IU/ml的NaCl溶液。這個劑量被選擇為最接近於防止立即凝固的任務。一個重要的條件是足夠快的抽吸，以便凝固過程不會在活檢針中開始。

給藥細胞數量和冷凍保存

每組患者的手術次數和實際細胞數見表1。

病人組	病人的數量	主要程序數量	每一程序中單個核細胞的平均數量	冷凍保存後的處理次數	超低溫保存後單個核細胞的平均數目
1.誰接受過一次細胞自體移植	25	1	2、88×108±1,13 × 108
2.誰做了2到5次手術	4	2	3、16×108±0,74 × 108
	3.	3.	3、2×108±1,25 × 108
	3.	5	2, 44×108±0,59 × 108
3.誰接受了冷凍保存的細胞的後續使用	5	1	3、5×108±0,66 × 108	1	3, 3×107
	4	1	2、96×108±0,18 × 108	2	95×107±0,45 × 108
	1	1	98×108	3.	2×107±0,52 × 108
	3.	2	2、88×108±0,51 × 108	3.	1、9×107±0,4 × 108
	2	2	2、9×108±0,7 × 108	5	1, 5×107±0,35 × 108
	1	3.	2, 42×108±0,81 × 108	6	0, 95×107±0,72 × 108
	1	4	3, 00×108±0,85 × 108	4	1, 18×107±0,33 × 108

表1:給藥細胞數量和冷凍保存

從表中可以看出，在主要過程中引入的細胞的平均數量約為3 × 10⁸，變化範圍為1,98 × 10⁸到3,5 × 10⁸細胞。由於分離細胞的單個核分數的程序實際上不隨時間而改變，提取的骨髓體積實際上是相同的，差異是由於患者的個人特征。細胞數量對潰瘍愈合所需時間的影響也未被檢測到。最重要的參數是過程的數量。觀察患者病情的長期穩定進展，通過交替補充少量冷凍保存的細胞，反複重複主要程序。用於冷凍保存的細胞數量有限，首先是由於在主要過程中希望插入盡可能多的新鮮細胞材料，其次是由於標準冷凍容器的容量有限，冷凍細胞懸浮液的最佳濃度可使其存活。冷凍後再植的選擇劑量約為2 × 10⁷細胞。最優的方法是用液氮細胞交替1個主程序和2個主程序，周期為2個月。采用這種方法，在開始治療8-9個月後進行以下基本程序，完全避免了這些患者潰瘍的形成。

討論

自2002年[11]以來，已有文獻報道成功使用細胞生物學技術治療下肢缺血和潰瘍。值得注意的是，在後來的工作中，我們注意到這種方法尚未在臨床實踐中大量使用[17]。可以假定，造成這一現象的可能原因是若幹社會、醫學和生物學因素的綜合作用。目前尚不清楚的問題有:1)引入細胞材料的最佳劑量和方法，2)降低缺血程度並導致潰瘍愈合的特定分子機製，3)結合細胞和基因治療以提高效率的可能性，4)可能的並發症首先是致癌的風險。

在本研究中，給予患者的細胞數量相對較少。與類似研究相比，當骨髓單個核細胞的注射數量約為1-2 × 10時，[9]和[16]⁹0.3 × 10⁹似乎小得多。然而，臨床效果相當。顯然，所選擇的方法的優勢正是多次應用和更少的創傷為患者。局部麻醉下單點穿刺活檢似乎比全麻下多點穿刺更方便。以較少的細胞數量維持治療效果的一種可能的機製是在進行性缺血的組織中維持多能細胞的濃度。這些細胞可能是CD34+， CD133+和KDR+。值得注意的是，在大容量(大於500ml)的骨髓采樣中，CD34+細胞的濃度可以隨著外周血流量的稀釋而顯著降低。這不會發生相對較小的(100-150毫升)從一個點。

多能細胞在易感肢體缺血血管生成中的不同作用也是一個有爭議的問題。在分泌生長因子VEGF、FGF-2、GM-CSF等的內皮祖細胞存在下，血管生長是可能的。CD34+細胞很適合發揮這一作用，這在各種研究中已被反複證實[24-26]。另一方麵，[9]研究表明，潰瘍肢體的修複隻與KDR+ AMBMFC亞群的引入有關，而CD34+和CD133+亞群則沒有類似的效果。從我們的觀點來看，在給藥前將AMBMFC分離成亞種群很難有效。除了內皮祖細胞和刺激血管生成的造血細胞外，骨髓中還含有在其表麵表達CD54/CD102、CD166、CD49、CD73和CD90的間充質幹細胞[27,28]。盡管這些細胞的分化潛力明顯低於胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞和許多其他類型的幹細胞，但它們能夠遷移，並在受損組織中顯示歸家效應，促進再生過程，分泌營養因子和細胞間接觸的旁分泌介質[29-32]。由於上述特性，間充質幹細胞可以補償伴隨DFS的糖尿病神經病變。

因此，骨髓單個核細胞的全部部分的自體移植可以為糖尿病潰瘍的愈合提供所有成分的運送到患肢。

在將細胞生物學技術引入醫療實踐後，研究人員和臨床醫生都在詢問這些方法的安全性和可能的並發症。大多數報道表明細胞自體移植具有良好的耐受性，且完全無副作用。隻有一項研究描述了自體單核外周血療法的副作用，特別是導致心肌梗死的心血管並發症[33]。患者年齡為76.7±9.7歲。血細胞接受G-CSF誘導在體外．

鑒於對應用自體幹細胞移植後可能產生致癌等副作用的特別關注，正在接受細胞治療的患者的所有腫瘤疾病病例都受到密切監測。值得注意的是，AMBMFC的使用是絕對安全的，即使在老年組，患者的癌症發病率也沒有超過平均統計值。使用實驗動物模型可以擴大實驗範圍。一項最初的研究是為了測試刺激[34]致癌的可能性。結果表明，小鼠骨髓細胞自體移植後腫瘤發生。然而，在體外處理時，細胞受到誘變效應。還需要注意的是，在實驗過程中，小鼠的糖尿病和心肌梗死是人工刺激的。根據這項研究的結果，作者建議在處理意味著突變可能性增加的細胞時，控製染色體異常的可能性。然而，在現實中，細胞治療作為致癌原因的觀點似乎相當有爭議。

更多的研究報告了細胞治療對癌症的保護作用，而事實恰恰相反。

這樣的數據表明，自體骨髓移植尤其適合於治療DFS。異體製劑的使用盡管受到從健康人身上提取的細胞材料的本質和HLA係統精確選擇的可能性的影響，但並不具有致癌安全[36]。

結論

作為這項研究的結果，一種相當新穎的治療DFS的方法已經開發出來。它是基於結合之前文獻中描述的細胞治療方法，使用自體單核骨髓片段細胞(AMBMFC)，使用低溫保存和生物銀行方法。所選擇的方法的優點包括:首先，與采用保守方法治療的對照組相比，良好結果的百分比提高了，減少了潰瘍的愈合時間，最大限度地減少複發的可能性。另一個重要因素是在冷凍保存後預防性應用AMBMFC治療以防止潰瘍複發的可能性。多項研究表明，多細胞給藥對患者的療效顯著提高[9,10]。低溫技術的使用可以減少伴隨骨髓取樣過程的創傷影響。另一個重要的優勢是由於手術的總體成本較低，對患者的可用性更大。

該試驗在俄羅斯已獲得批準。盡管在這個初始階段相對完整，但它無疑需要繼續工作，可以導致:1)進行多中心隨機雙盲試驗，2)在生理水平上評估結果，例如血管造影研究，3)描述和搜索活性分子水平機製，包括細胞表麵標記的描述。特別應注意的是，本工作中提出的細胞治療和冷凍技術的潛力可能與基因治療結合的可能性，可能是通過某些生長因子的基因。

在本研究中，在處理細胞和低溫保存過程中使用自體血清提供了額外的安全水平。考慮到上述事實，所述技術允許更有效和安全的治療DFS。

鳴謝

作者感謝研究參與者和試驗工作人員。A.V.I.特別感謝Marina Uvarova(西北循證醫學中心)，她是手稿的第一讀者，並給出了她的批評意見。

資金

沒有特別基金;該研究得到了聖彼得堡國立大學附屬醫院的支持。

作者的貢獻

• A.V.I.對研究設計有貢獻;與細胞和冷凍技術的工作，進行研究，數據分析，並撰寫稿件。
• A.V.K.參與了研究設計，醫療監督，所有與患者有關的工作。
• Y.N.F.為招募患者、開展研究、全球監督做出了貢獻。
• 所有作者都認真審閱了手稿，並批準了出版的最終版本。A.V.I.是這項工作的擔保人，因此，可以充分訪問研究中的所有數據，並對數據的完整性和數據分析的準確性負責。
• 之前的報告。這項研究的部分內容已在聖彼得堡國立大學附屬醫院的內部會議上提出。

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Aritcle類型:研究文章

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出版的曆史:

收到日期:2017年6月13日

接受日期:2017年7月3日

發表日期:07年7月2017年