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摘要

目的:心肌梗死(MI)後，WNT/β-catenin通路在心髒中被暫時激活。盡管來自遺傳模型的數據表明WNT通路的正向和負向作用取決於所使用的模型，但治療性抑製WNT通路對損傷後結果的影響以及所涉及的細胞介質尚不完全清楚。使用一種新獲得的小分子GNF-6231，它通過阻斷所有WNT配體的分泌來避免WNT通路的激活，我們試圖研究梗死後對WNT通路的暫時治療性抑製是否可以緩解損傷後心功能障礙和纖維化，以及導致這種效果的細胞機製。

方法和結果:C57Bl/6小鼠心肌梗死後靜脈注射GNF-6231對WNT通路的藥物抑製顯著降低了心功能的下降(第30天分數縮短:治療組為38.71±4.13%，對照組為34.89±4.86%)，防止了不良心髒重構，減小了梗死麵積(9.07±3.98%:17.18±4.97%)。抑製WNT可增強心肌間質細胞的增殖，尤其是遠端心肌，抑製心肌細胞凋亡，減少梗死周圍肌成纖維細胞的增殖。在體外研究表明，抑製WNT會增加Sca1的增殖⁺改善心肌細胞的存活，並抑製心肌成纖維細胞合成I型膠原。

結論:在心肌梗死後立即使用口服生物可用性藥物對WNT通路進行全身、暫時性的藥物抑製，可改善小鼠的功能，減少不良重塑和縮小梗死麵積。治療性WNT抑製影響梗死修複的多個方麵:促進心髒祖細胞和其他間質細胞增殖，抑製肌成纖維細胞增殖，提高心肌細胞存活率，降低肌成纖維細胞I型膠原基因表達。我們的數據表明，WNT抑製療法作為一類新的藥物，在推動mi後修複和預防心力衰竭方麵具有很好的作用。

關鍵字

WNT /β連環蛋白通路;再生心髒修複;心肌梗死

簡介

在美國，心血管疾病是導致死亡的主要原因，而導致心肌缺血損傷的冠心病是最常見的心血管疾病，在美國每年有37萬人死亡。梗死引起的心肌細胞凋亡和纖維化導致心肌持續的不良重構，最終導致心力衰竭[2,3]。目前心肌梗死的治療主要集中在疾病管理和預防心肌梗死複發。因此，有必要開發有效的治療方法，以解決核心病理生理學，特別是心肌細胞持續死亡和纖維化發生在梗死後。

WNT/β-catenin通路在各種心肌細胞中被激活，以應對缺血損傷[4,5]，在心肌梗死修複的背景下，許多小組已經對其進行了研究。在心肌細胞中通過β-catenin穩定或消耗WNT通路調節的遺傳模型中，WNT激活導致缺血損傷後的不良重構，而WNT抑製則改善功能[6,7]。使用分泌性WNT抑製劑(分泌卷曲相關蛋白1和2;sFRP1和sFRP2[8,9])表明WNT抑製可刺激心肌梗死後心功能恢複並減少瘢痕形成，盡管這些研究提出的細胞機製不同。配體依賴和獨立的WNT信號[10]的明顯和不完全阻斷，或者在pyrvinium[11,12]的情況下，由於毒性和對其他信號通路的影響而不完全治療，可能解釋了這些研究中觀察到的WNT抑製療法在細胞效應上的差異。

此外，有相互矛盾的報道表明WNT激活也可以增強心肌梗死後的心髒修複。Paik等人[13]表明，心肌細胞中典型WNT配體WNT 10b的獲得功能可以通過增強新生血管來協調恢複。據報道，通過β-catenin缺失而中斷心外膜內的WNT 1/β-catenin信號會阻礙適應性促纖維化反應[14,15]，而梗死後注射具有組成性活性β-catenin的腺病毒載體可通過促進心肌細胞存活和肌成纖維細胞[16]形成肉芽組織來減少梗死麵積。觀察到的一些差異可能是由WNT信號對愈合的配體[15]和細胞類型依賴的[16]效應解釋的。此外，使用細胞特異性啟動子來調節WNT信號的遺傳模型有一些需要注意的地方，比如微環境的不完全靶向性，不能瞬時抑製信號，以及對靶向細胞類型的非預期的生理影響(例如，心外膜細胞[14]中的完全β-catenin突變可能導致發育中的心髒缺陷，正如之前的研究報道的那樣，[17]使其對梗死心髒的影響的研究複雜化)。

我們假設，在左心室冠狀動脈降支永久結紮的小鼠模型中，通過影響多個心肌細胞介導修複，一種綜合靶向所有WNT配體依賴信號的藥物對WNT進行短期抑製，可改善心肌梗死後的心髒恢複。由於缺乏適合臨床使用的安全有效的WNT抑製劑，耽誤了評估心髒損傷中治療性WNT通路抑製的工作[18,19]。最近，隨著新型WNT配體分泌抑製劑(作用於膜結合o -酰基轉移酶，Porcupine[20])的出現，我們能夠研究全身WNT抑製在mi後心髒損傷修複中的潛力。豪豬酶棕櫚酰化WNT配體-一種修飾對於WNT蛋白[21]的分泌和受體結合是必不可少的。研究表明，箭豬的活性是特定於WNT配體的，不影響其他類似的脂質修飾信號蛋白，如Hedgehog[22]，因此使其成為WNT通路靶向的合適候選人。在我們的研究中，我們使用了GNF-6231，一種由諾華研究基金會基因組學研究所合成的豪豬抑製劑。該化合物的類似物LGK974[21]已經推進到wnt驅動的癌症[23]的臨床研究中。在這裏，我們報道了實驗性心肌梗死後短期藥物抑製WNT可增強心髒修複，其特點是改善功能和重塑參數，減少膠原疤痕。我們的數據表明，這是通過對心髒病理的多個方麵的影響發生的，包括心髒間質(可能是祖細胞)細胞的增殖反應，通過減少心肌細胞凋亡，通過減緩肌成纖維細胞增殖和膠原合成。

材料和方法

抗體

使用了以下抗體:β-連環蛋白(1:200;BD Pharmingen, 610153);β-牛乳糖(1:10 0;AbCam Ab616);平滑肌肌動蛋白(α-SMA) (1:1000;σA2547);Ki67 (1:400;AbCam Ab15580);phospho-Histone-H3 (1:200;微孔,06 - 570); cTnI (1:1000; AbCam, Ab6556); Alpha Sarcomeric Actin (1:200; Sigma, A2172); GATA4 (1:200; Santa Cruz, SC25310); Periostin (1:100; Santa Cruz, SC67233); PCNA (1:100; Santa Cruz Biotech, SC-56); FSP1 (1:100; Millipore, 07-2274); Vimentin (1:200; Sigma, V2258); vWF (1:200; Takara, M116).

WNT調節器

小分子豪豬抑製劑GNF-6231是諾華研究基金會基因組研究所的慷慨禮物。小分子WNT抑製劑(CK1α激活劑)VU-WS113 (C-113)是美國範德比爾特大學細胞與發育生物學係Ethan Lee博士贈送的大禮。重組小鼠WNT3A購自AbCam (ab81484)或Vanderbilt Antibody and Protein Resource (VAPR)。體外實驗中，GNF-6231在DMSO中作為載藥，濃度為100 nM;C-113(載藥:DMSO)在1 μ M時使用;重組小鼠WNT3A(載體:PBS中的01% BSA)在測試濃度範圍在25 ng/mL - 100 ng/mL之間並顯示出類似的增殖反應(數據未顯示)後，以50 ng/mL的濃度使用。

動物

所有程序都按照範德比爾特機構動物護理和使用委員會(IACUC)和NIH的指導方針進行。C57Bl/6J小鼠購自Jackson實驗室(Bar Harbor, ME)，由PPY維護。TOPGAL[5]小鼠是來自Antonis Hatzopoulos博士(範德比爾特大學細胞與發育生物學係)的慷慨禮物。

細胞係

Sca1⁺CD31^-如前所述[25]分離CD45-細胞。簡單地說,H-2K^b- C57Bl/6背景的tsa58轉基因小鼠在無所不在的mosue主要組織相容性複合體(H-2K)下表達溫度敏感的熱敏猴病毒(SV40)大腫瘤(T)抗原^b) 6- 8周的啟動子，使用過量異氟醚進行安樂死，隨後頸椎脫位。5隻小鼠心髒被解剖分離心室組織，然後切碎，與10 ml消化液(10 mg/ml膠原酶II, 2.5 U/ml disase II, 1µg/ml, DNase I, 2.5 mM CaCl)孵育₂)在37°C加熱20分鍾。采用Percoll梯度法收集非肌細胞。在含有0.5% BSA和2mm EDTA的PBS (PBS/BSA/EDTA)中過濾的無肌細胞單細胞懸液，用小鼠BD Fc Block(克隆2.4G;BD Biosciences，聖何塞，加州)和免疫細胞被CD45微珠磁性去除(Miltenyi Biotec Inc.，奧本，加州)。用藻氰菊酯(PE)標記的CD31孵育後(克隆390;eBioscience, San Diego, CA)和異硫氰酸熒光素(FITC)-共軛Sca1(克隆E13-161.7;BD Biosciences)抗體、CD31陽性細胞用抗pe微珠(Miltenyi Biotec)去除。Sca1⁺CD31^-用抗fitc微珠(Miltenyi Biotec)磁分離細胞。分離的有條件永生的Sca-1⁺CD31^-CD45^-細胞以10的密度被鍍⁴cell /厘米²在添加10%胎牛血清、1%青黴素/鏈黴素、2 mM穀氨酰胺和10 ng/ml IFN-γ的DMEM中1%明膠包被組織培養培養皿中，在空氣/CO的潮濕氣氛中培養₂(19:1) 33°C。實驗前6天，細胞在37°C無IFN-γ條件下重複培養。

從小鼠心房心肌細胞中提取的HL1細胞係是William C. Claycomb博士(路易斯安那州立大學醫學中心，新奧爾良，洛杉磯)好心送的禮物。這些細胞在明膠/纖維連接蛋白(25µg纖維連接蛋白，2 ml 0.02%明膠水溶液)包被板(纖維連接蛋白和明膠來自Sigma-Aldrich)上培養。HL1細胞係在37°C的Claycomb培養基(SAFC Biosciences, Lenexa, KS)中保持，添加10%的胎牛血清(SAFC Biosciences)， 100 μ M去甲腎上腺素(Sigma)在30 mM抗壞血酸(Sigma)， 2 mM l -穀氨酰胺(Sigma)，青黴素和鏈黴素(Life Technologies, Grand Island, NY)。

iCell Plus心肌細胞，主要是從人類誘導多能幹細胞(iPS)細胞中提取的心室心肌細胞，從細胞動力學國際公司購買，並在製造商專有的維護介質中0.1%明膠塗覆的塑料板中進行維護。

原代小鼠心髒成纖維細胞是從C57Bl/6小鼠心髒中分離出來的，C57Bl/6小鼠至少12周大，按照先前描述的[26]方案。簡單地說，小鼠被過量異氟醚安樂死，隨後頸椎脫位。將心髒組織切碎，放入Kreba-Henseleit (Sigma;K3753a)緩衝帶2.9 mM CaCl2和24 mM NaHCO_3.包含0.25 mg/mL Liberase Blendzyme 3 (Roche Applied Science)， 20 U/mL DNase I (Sigma Aldrich)， 10 mmol/L HEPES (Invitrogen)和0.1%疊氮化鈉在HBSS的雞尾酒，37°C搖動20分鍾。消化後收集的細胞通過40 μ m尼龍網，離心(15分鍾，200 g, 4°C)。最後，用含有10%胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的DMEM-F12培養基重組細胞，並將細胞接種到塑料板(康寧)上，在37°C下選擇性粘附4小時分離成纖維細胞。細胞在高糖(4.5 g/L) DMEM + 10%胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的濕潤空氣/CO氣氛中培養₂(19:1) 37°C。

擴散分析

通過5-溴-2 ' -脫氧尿苷(BrdU)細胞增殖試驗(Calbiochem, Gibbstown, NJ)評估細胞增殖。簡單地說，CPCs、HL-1細胞或原代成纖維細胞被播種在96孔板上(HL-1細胞被明膠/纖維連蛋白包被)，在需要的地方使用重組WNT3A。附著在平板上後，加入WNT調製劑並培養24小時。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)評估BrdU的納入，並在450/595 nm雙波長下使用SOFTMax Version 2.35軟件(Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA)按照製造商的建議進行讀取。

細胞生存能力分析

HL-1心肌細胞在2% FBS中血清饑餓過夜，並在密度為10的(明膠/纖維連蛋白包被HL-1) 96孔板上播種⁴細胞/。細胞貼壁超過24小時後，加入WNT調節劑(50 ng/mL重組小鼠WNT3A，含或不含1µM C-113)，細胞孵育48小時。用0.5 mg/mL的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]2,5，-二苯基溴化四唑(MTT) (Sigma)在PBS中孵育4小時，在37℃下評估細胞活力，並測定存活細胞的MTT還原為福馬讚。在37℃下，用75 μ L/孔DMSO溶解福瑪讚晶體10分鍾。光度測量在540 nm處進行。細胞存活率計算公式如下:%細胞存活率=(OD_控製od_樣本/ OD)×100%_控製．未處理的細胞作為對照。結果代表三個獨立的實驗，每個實驗進行三次重複。

手術LAD結紮(心肌梗死)模型，藥物治療，超聲心動圖和梗死麵積計算

雄性C57Bl6J小鼠(至少3月齡)用噴噴妥鈉(50 mg/kg)麻醉，在直接喉鏡下氣管插管。小鼠使用小動物呼吸器(潮氣量為1.0 ml，呼吸速率為110次/分鍾)進行通氣。在手術顯微鏡下進行左側開胸手術。用剪刀和鈍性解剖進入第四肋間隙。7-0絲線穿過心肌進入左室前外側壁，結紮左前降支動脈。在整個過程中，心髒都被持續的心電圖監測，以確保成功的梗死。胸部用6-0絲分層封閉(6-0尼龍封閉皮膚)，並逐漸脫離呼吸機，以避免並發氣胸。術後立即腹腔注射0.1 mg/kg丁丙諾啡，術後72小時內每8-12小時使用一次丁丙諾啡鎮痛。在整個研究期間，研究人員密切監測了動物的痛苦和體重減輕的跡象。嚴重的呼吸窘迫，缺乏下床活動，或體重嚴重下降(體重的20- 30%)被認為是對動物實施安樂死的原因。 Following study completion, or upon distress, animals were euthanized by overdose of isoflurane followed by cervical dislocation.

從術後6小時內開始到梗死後第6天，小鼠每24小時靜脈(尾靜脈)注射5 mg/kg(100µL容積)GNF-6231或載藥(3% D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯或20%聚乙二醇中的維生素E)。

對於心髒恢複研究，心髒尺寸從二維引導m模式圖像(100幀/秒)中獲得，並使用短軸和胸骨旁長軸視圖進行盲讀。所有的測量都是在mi後第7天和第30天在未注射鎮靜劑的小鼠身上進行的。測量從左室後壁(LVPW)、室間隔(IVS)和左室內徑(LVID)連續跳動3次平均。超聲心動圖第30天後，以盲法切除心髒、浸泡固定和石蠟包埋獲得連續切片，以測量梗死麵積(H&E染色切片中膠原蛋白染色藍色組織麵積的%)。

在縱向研究中，心髒在心肌梗死後的第3天、第7天和第15天分別切除，並加工成石蠟切片用於免疫染色研究。

組織學和形態測量學

心髒在10%緩衝福爾馬林中固定24小時，包在石蠟中，切片成5微米厚的橫切麵。H&E和Masson三色染色由Vanderbilt翻譯病理學共享資源進行。使用Olympus DP71顯微鏡相機(Olympus America, Center Valley, PA)對H&E和Masson的三色染色切片進行成像。

免疫熒光染色時，載玻片通過二甲苯和乙醇步驟進行脫蠟和水合。熱介導抗原提取通過檸檬酸緩衝液(pH值為6)中沸騰進行。將細胞接種到覆蓋玻片上，在室溫下1%多聚甲醛中固定1小時，0.1% Triton-X在0.1%檸檬酸鈉中滲透2分鍾，並用PBS洗滌幾次。用10%山羊血清在1% BSA溶液中室溫封閉1小時後，切片與一抗在4℃下孵育過夜，Alexa Fluor 488或Cy3偶聯二抗體在室溫下孵育1小時。然後用Hoechst 33342 (H21492 Invitrogen, Carlsbad, CA)反染色，並用Slowfade Gold (S36936 Life Technologies, Grand Island, NY)裱片。TUNEL染色用1:10的混合酶:用TUNEL稀釋緩衝液(原位細胞死亡檢測試劑盒TMR Red, Roche 12 156 792 910)與二抗一起加入樣品，37°C孵育60分鍾。然後用Hoeschst反染色並安裝樣品。使用Axio Imager2顯微鏡(Carl Zeiss, Thornwood, NY)和CoolSNAP HQ CCD相機(Photometrics, AZ)在10倍、20倍或40倍放大倍率下拍攝圖像，並使用ImageJ量化。共聚焦顯微鏡使用LSM510(蔡司)顯微鏡捕獲1 μ m光學切片。所有圖像均以50 μ m的比例尺呈現。

PK / PD研究

根據生產商的指導，在C57Bl/6小鼠靜脈注射5mg /kg後，研究GNF-6231的單劑量PK/PD圖譜。用20%聚乙二醇(PEG) 300和3% D-α-生育酚聚乙二醇100琥珀酸酯(ETPGS)溶解₂O.簡單地說，使用QIAGEN珠粒均質器對GNF-6231進行至少10分鍾的均質，同時有25%的車輛最終體積用於形成漿液。再加入25%的溶劑，並在高聲速下浸泡10分鍾。對車輛的剩餘體積進行添加和渦旋。另外進行了10分鍾的浴超聲處理。此外，在冰浴中以50%振幅進行3倍30秒的探頭超聲。用0.45 μ m注射器過濾器過濾重構藥物。在沒有GNF-6231的情況下，運載器單獨進行了類似的準備工作。在靜脈給藥後的特定時間點，從隱靜脈采集血液。采用LC/MC/MS法測定血漿中GNF-6231的濃度。簡單地說，將血漿樣品的等分加入內標和乙腈/甲醇(3/1)中，將樣品渦旋，在4℃下以4000轉/分離心5分鍾，以沉澱血漿蛋白。 Supernatant was transferred to a clean 96-well plate, and diluted with distilled water. The extracted samples were injected (10 µL) onto a Zorbax SB-C8 analytical column (2.1 × 30 mm, 3.5 µm).

安捷倫技術公司，帕洛阿爾托，加利福尼亞州，美國)。流動相為0.05%甲酸溶於水(溶劑A)和0.05%甲酸溶於乙腈(溶劑B)，采用流速為700µL/min的梯度洗脫法進行複合洗脫分離。質譜分析采用常壓化學電離(APCI)正離子模式，采用GNF-6231(449.2>221.0)多重反應監測(MRM)。血漿定量下限(LLOQ)為1.0 ng/mL。采用室內擬合程序，通過非室室回歸分析計算藥代動力學參數。

PD研究如前所述[21]進行。簡單地說，在GNF-6231或異氟醚過量和頸椎脫位的安樂死後注射載體的特定時間點收集小鼠的肝髒。采用Qiagen RNeasy試劑盒分離總RNA;TaqMan分析使用Axin2而且Gapdh探頭(應用生物係統)按照製造商的說明。目標基因的mRNA表達水平，Axin2，歸一化到Gapdh mRNA水平，使用SDS 2.0軟件(Applied Biosystems)分析數據，計算相對RNA數量。

RNA分離和qRT-PCR

使用Trizol試劑(Invitrogen, 15596026)按照製造商的協議從細胞中分離RNA。用iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad 170-8890)用1µg RNA進行第一鏈DNA合成。采用iCycler (BioRad)和熒光檢測(SsoFast EvaGreen;172 - 5200;BioRad)。每個反應以18S為對照進行歸一化處理。引物序列見補充表S1。

統計分析

多組比較時，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，經Bonferroni校正多次比較，確定實驗組與對照組之間的差異是否有統計學意義。采用D 'Augustino和Pearson綜合檢驗或Shapiro-Wilk檢驗來確定數據集是否正態分布。對於非正態分布或N<7的數據集，采用Kruskal-Wallis h檢驗代替單因素方差分析。兩組數據比較時，正態分布數據集采用非配對t檢驗，非正態分布數據集采用Mann-Whitney檢驗。GraphPad Prism (San Diego, CA)軟件用於所有統計分析。P<0.05認為雙尾假設檢驗有統計學意義。

結果

豪豬抑製劑GNF-6231下調WNT靶基因表達，在體內具有生物有效性，對WNT依賴的組織具有良好的耐受性

為了研究WNT抑製對mi後心髒再生的生理和細胞影響，我們使用了一種箭豬酰基轉移酶的小分子抑製劑GNF-6231。豪豬酶是負責WNT蛋白翻譯後棕櫚酰化的酶，這是WNT分泌以及WNT與其受體[21]結合所必需的(圖1A)。該化合物的類似物目前正處於I期臨床試驗中，作為WNT抑製療法治療癌症[23]。GNF-6231抑製豪豬酶活性的細胞IC50為0.8 nM，在20 μ M[27]時不表現出細胞毒性。在Wnt3a過表達的心肌細胞，它能有效抑製WNT通路的激活Axin2mRNA水平(圖1B)。在活的有機體內在C57BL/6J小鼠靜脈給藥5 mg/kg或對照劑後，研究了GNF-6231的藥代動力學(PK)和藥效動力學(PD)關係。GNF-6231血漿水平較高，遊離血漿濃度(小鼠血漿蛋白結合GNF-6231為88%)高於其水平在體外GNF-6231的血漿半衰期估計為2.3小時(圖1C)。檢測WNT靶基因Axin2在肝組織中的表達。雖然減少Axin2GNF-6231在單次靜脈注射後3小時開始治療，在治療後7小時出現統計學上顯著的降低。24小時後，減少了37%Axin2表達與車輛相比，表明在該時間點WNT抑製成功(圖1D)。由於GNF-6231抑製豪豬的酶活性，阻礙WNT的分泌，在GNF-6231血漿濃度峰值(5分鍾)和PD反應之間觀察到預期的時間延遲Axin2抑製(圖1 d)。

圖1:GNF-6231在體外抑製典型WNT通路的活性。(一)WNT途徑和WNT抑製劑GNF-6231和C-113的作用點示意圖。(B)褶皺的變化Axin2WNT3a過表達心肌細胞的基因表達顯示GNF-6231處理降低了WNT靶基因的表達(N=3個獨立實驗重複;* * * p≤0.0001;重複測量方差分析與Bonferroni校正多次比較)。(C)單次靜脈注射5 mg/kg後血漿遊離GNF-6231水平。藥物的血漿半衰期約為2.3小時;GNF-6231遊離血藥濃度高於在體外豪豬IC50 >12小時。(D)qRT-PCR顯示抑製Axin2GNF-6231靜脈注射5 mg/kg(每個時間點2隻)後不同時間點肝髒基因表達。柱形代表均值±標準差。

由於典型的WNT通路在某些組織(如結腸和皮膚)中具有組成性活性，我們評估了在這些組織中抑製WNT信號的潛在毒性。連續6天靜脈注射5 mg/kg GNF-6231(我們研究中使用的劑量和方案;如圖2A所示)，對結腸組織學無影響(補充圖1A)，對免疫染色檢測到的β-catenin表達和定位無影響(補充圖1B)，表明該藥物無胃腸道毒性。同樣，與對照組相比，GNF-6231處理的動物對皮膚組織學沒有影響(補充圖1C)。

圖2:豪豬抑製劑治療可抑製梗死心髒WNT通路活性。(一)概述動物研究時間表的示意圖。小鼠心肌梗死後每日靜脈注射5 mg/kg藥物或對照劑，持續至第6天。在心髒恢複研究中，小鼠在第7天和30天接受超聲心動圖檢查。為了進行組織學檢查，在第3、7和15天分別處死另一組小鼠。(B)第7天心室梗死周圍區β-catenin免疫染色顯示GNF-6231治療後β-catenin水平降低。(B)載體處理組織的高倍圖像顯示β-catenin的核定位，提示WNT通路激活。(C)通過對WNT報告者的心室切片進行β-半乳糖苷酶免疫染色，TOPGAL小鼠在接受GNF-6231治療後梗死後第7天顯示WNT活性受到抑製。比例尺等於50 μ m。圖像代表N≥3隻小鼠的切片;每隻老鼠至少有4個區域被成像。

用GNF-6231證實我們的發現在體外我們使用了一種小分子酪蛋白激酶1- α (CK1α)激活劑VU-WS113[24]，本文簡稱為C-113。它以β-連環蛋白降解複合體為靶點[24,28]，因此通過一種與GNF-6231不同的作用機製抑製WNT途徑(圖1A)。實時熒光定量PCR檢測WNT靶基因，Axin2顯示C-113抑製了重組WNT3A誘導的WNT通路激活(補充圖2)。由於C-113靶向WNT配體分泌下遊的WNT通路，因此我們無需過表達就可以研究WNT抑製的效果Wnt3a．

使用GNF-6231治療可抑製心肌梗死後WNT/β-catenin通路激活，改善心肌梗死後恢複/修複

先前的研究表明，典型的WNT通路在實驗性心肌梗死後72小時左右開始激活[4,5]。據報道，WNT通路激活在損傷後7 - 14天達到峰值，之後它開始回落到基線水平[5]。為了避免這種早期、短暫的損傷後WNT激活，我們對小鼠(C57Bl6和WNT報告者，表達TCF/LEF啟動子[5]驅動的β-半乳糖苷酶的TOPGAL小鼠;年齡≥12周)，每24小時靜脈注射5 mg/kg GNF-6231或對照劑(3%維生素E和20% PEG 300)，直至損傷後第6天(圖2A)。劑量和治療方案是根據我們的PD/PK研究和以往研究描述的梗死後WNT激活時間線確定的。β-catenin(在C57Bl/6J中)和β-半乳糖苷酶(在TOPGAL小鼠中)免疫染色顯示，與載藥治療相比，GNF-6231治療降低了梗死周圍區域核和細胞質β-catenin水平(圖2B和2B’)，以及β-半乳糖苷酶總蛋白水平(圖2C)。此外，用GNF- 6231治療可以減少心肌細胞自身核β-連環蛋白的激活(補充圖3)。

圖3:豪豬抑製改善心功能，減少心肌梗死後的不良重塑。左心室重塑以變化百分比測量(一)LVIDd和(B)LVIDs。左室功能測定為變化%(C)FS和(D) EF。數據顯示，與對照相比，GNF-6231治療組左心室內徑(A和B)沒有增加，心功能(C和D)改善。(E)第30天，馬鬆三色染色的左心室代表性切片顯示，與gnf -6231處理的左心室相比，灌胃劑處理的左心室膠原蛋白染色(藍色)區域更多。(F)梗死麵積的定量。圖上的每個數據點代表單個老鼠;*p≤0.05，**p≤0.01或***p≤0.005;未配對t檢驗。

為了確定短暫的心肌梗死後WNT抑製的生理效應，在心肌梗死後第7天和第30天使用超聲心動圖評估了心功能和重構(表1)。在心肌梗死後(剛給藥或給藥後)和第7天，也用超聲心動圖測量了心率，藥物組和對照組之間沒有統計學差異(數據未顯示)。采用舒張期和收縮期左心室內徑(LVIDd和LVIDs)作為心髒重構的指標。第7天的測量可以在任何顯著修複之前進行隊列間的比較。在第7天，各組之間沒有任何統計學差異，支持實驗組之間心肌梗死的程度沒有統計學差異(表1)。在心肌梗死後第30天，GNF-6231處理的心髒的LVIDd和LVIDd較對照處理的小鼠低(LVIDd: 3.83±0.45 mm vs. 4.32±0.68 mm, p=0.0377;lvid: 2.35±0.38 mm vs. 2.84±0.64 mm, p=0.0446;為了進一步控製實驗組內小鼠梗死麵積的變化，我們計算了每隻小鼠從第7天到第30天各參數的變化百分比。實驗組的心室重塑參數(∆LVIDd%和∆LVIDs %)的變化百分比明顯低於對照組(∆LVIDd%: -2.287±12.36 vs. 16.109±8.53,p=0.0024;∆LVIDs%: -3.011±12.65 vs. 17.198±8.91,p=0.0015;圖3A和3B，表1)，表明抑製WNT可防止不利的心室重構。射血分數(EF)和縮短分數(FS)是衡量心功能的指標。 At day 30 post-MI, GNF-6231 treated mice had higher EF (0.75 ± 0.05 vs. 0.71 ± 0.06, p=0.0421), and higher FS (38.71 ± 4.13% vs. 34.89 ± 4.86%, p=0.0325; Table 1) compared to vehicle-treated controls. The percent change from day 7 to 30 in both parameters of cardiac function (∆EF% and ∆FS%) were on average, significantly higher for each mouse in GNF- 6231 treated group compared to vehicle-treated group (∆EF%: 0.83 ± 1.25 in GNF-6231 treated vs. -1.723 ± 2.36 in vehicle-treated, p=0.0138; and ∆FS%: 1.4 ± 2.312 in GNF-6231 treated vs. -1.713 ± 3.59 in vehicle treated, p=0.0265; Figures 3C and 3D, Table 1), suggesting that WNT inhibition prevented worsening of cardiac function in the injured heart.

表1:前八行表示各參數和第7天和第30天治療的平均值±SD值。每隻老鼠在第7天和第30天之間的平均±SD百分比差異(Δ)列在最下麵的四行。采用非配對t檢驗確定兩列參數間的統計學差異。

病理學家在第30天通過馬鬆三色染色左心室切片的盲法組織形態測定法(圖3E和3F)確定的梗死麵積百分比，與對照相比，GNF-6231處理過的心髒梗死麵積百分比顯著降低(GNF-6231處理過的心髒梗死麵積百分比為9.07±3.99%，對照為17.18±4.97%;p=0.0152)，表明抑製WNT後心肌瘢痕減少。因此，GNF-6231增強了左室梗死後的整體心髒修複和恢複。

WNT抑製引起梗死心髒間質細胞增殖。

基於之前報道的骨骼肌[29]和心髒損傷[30]模型中WNT通路的抗增殖作用的研究，我們詢問GNF-6231治療的修複作用是否部分由特定心肌細胞的增殖介導。增殖標記Ki67和pHisH3 (phospho-Histone-H3)免疫染色顯示，在梗死周圍區域(如圖4A所示)，pHisH3顯著增加⁺在GNF-6231和載體處理的心髒的第3天細胞(圖4D)。第7天，增殖反應明顯減弱，但pHisH3增加2.3倍⁺雖然差異無統計學意義(圖4D)。到第15天，兩個治療組的增殖反應基本消退。然而，在遠端心肌中，經GNF-6231處理的心髒明顯有更多的pHisH3⁺細胞在第3天和第7天與對照處理相比(高5.67倍;***p≤0.001，*p≤0.05分別是對照組的2.65倍;圖4 b-4d)。

圖4:WNT抑製可促進梗死心髒間質αSMA陰性細胞增殖。(一)H&E染色的心髒橫切麵劃分了研究中定義的左心室梗死周圍和遠端區域。心室的代表性pHisH3染色切片(B)第三天,(C)第7天顯示GNF-6231處理心髒遠端心肌增殖細胞增多。(D) pHisH3+細胞百分比的定量。柱狀圖表示平均值±標準差;每組N≥3隻小鼠切片N≥4張;*p≤0.05，***p≤0.005;用於多次比較的單向方差分析與Bonferroni校正。心肌梗死後第3天的遠端心肌代表性切片(E)α肉瘤肌動蛋白和pHisH3共染色(F)心室高倍共聚焦顯微鏡圖像，cTnI和Ki67共染色，顯示gnf -6231處理的組織中大部分增殖細胞定位於肌纖維間質。(G)α肌動蛋白/pHisH3共染LV顯示罕見的增殖心肌細胞(白色箭頭)。(H)增殖的肌成纖維細胞由αSMA/Ki67聯合染色確定，如第7天梗死周圍區域的代表性切片所示。(我)αSMA/Ki67共染細胞的定量顯示，在第3天，gnf -6231處理的梗死周圍組織中增殖肌成纖維細胞的百分比(條的灰色陰影部分)明顯低於對照組(**p=0.0013)，第7天則明顯低於對照組(# p=0.0587)。相反，增殖的非肌成纖維細胞(αSMA-細胞;圖中較低的白色部分)在第7天處理過的GNF-6231心室中顯著高於對照組(*p=0.0135)。柱形代表平均值±標準差。N≥12:每組至少3隻小鼠至少3個切片。假定值兩組數據之間的個體比較采用Mann-Whitney檢驗計算。比例尺等於50 μ m。

心肌細胞標誌物α Sarcomeric Actin (αSA)與pHisH3聯合免疫染色顯示，在治療組和對照組中，大多數在遠端心肌增殖的細胞(在GNF- 6231處理的心室中比例較高)是間質細胞(圖4E)。通過心髒肌鈣蛋白I (cTnI)和Ki67的聯合染色證實了這一點;典型的高倍共聚焦顯微鏡圖像如圖4F所示。我們在GNF-6231處理動物和對照組動物中都觀察到罕見的細胞核pHisH3染色的心肌細胞(一個代表性的例子如圖4G所示)，但不清楚這些心肌細胞隻是在進行核分裂還是真正在分裂心肌細胞。同樣的,在體外BrdU(溴脫氧尿苷)摻入HL-1心肌細胞係表明重組WNT3A和/或WNT抑製劑C-113對心肌細胞增殖無影響(補充圖4C)。由於增殖心肌細胞是如此罕見，我們的研究集中在識別間質增殖細胞。

抑製WNT可選擇性地減少遠端心肌成纖維細胞的增殖

在梗死心髒中，α sma陽性肌成纖維細胞是主要的基質生成細胞，負責肉芽組織形成和纖維化[16]。因此，我們對αSMA和Ki67進行了聯合免疫染色(圖4H)。並不出乎意料的是，增殖的肌成纖維細胞(αSMA和Ki67雙陽性細胞)出現在GNF-6231和載體處理的組織中，因為一定水平的促纖維化信號是啟動肉芽組織形成和防止梗死破裂[14]所必需的。有趣的是，在梗死周圍區域，增殖肌成纖維細胞的比例(Ki67⁺αSMA⁺細胞;圖4I中上方深色部分)在經過GNF-6231處理的心髒中顯著降低(在經過GNF-6231處理的心髒中降低了2.21倍;**p=0.0013)在第3天(圖4I)。然而，αSMA陰性增殖細胞比例(Ki67⁺αSMA^-在梗死後第3天和第7天，GNF-6231處理的心髒在梗死周圍區域的梗死率高於灌胃劑處理的心髒(2.7倍;P =*0.0135和2.2倍;#分別p = 0.0587;圖4)。同樣，在遠端心肌中，αSMA陰性增殖細胞(Ki67⁺αSMA^-在梗死後第3天(*p=0.012)，在GNF-6231處理的心髒中，細胞率比灌胃劑處理的心髒高3.3倍(補充圖5A)。同時，增殖細胞核抗原(PCNA)或Ki67與其他成纖維細胞群的標記物共免疫染色，成纖維細胞特異性蛋白-1 (FSP-1;補充圖5B和5C)、Periostin(補充圖5D)和Vimentin[31](補充圖5E)顯示，GNF-6231處理對這些細胞的增殖沒有影響。基於這些觀察，我們認為GNF-6231治療選擇性地減少了梗死心髒的肌成纖維細胞增殖，同時促進了其他間質細胞的增殖，其中不包括FSP-1⁺, Periostin⁺或波形蛋白⁺成纖維細胞。

圖5:WNT抑製增加了可能有助於肌生成的祖細胞增殖。(A和B)相對BrdU由Sca1合並⁺穩定表達LZRS(空載體)或Wnt3a-LZRS的祖細胞表明，Wnt3a過表達降低了增殖，(A) GNF-6231處理和(B) C-113處理逆轉了這一作用。數據以均數±標準差表示。(A) N=5， (B) N=3;*p≤0.05，**p≤0.01;多次比較的Kruskal-Wallis檢驗與Dunns校正。(C和D)心肌梗死後第3天(左圖)和第7天(右圖)有代表性的GATA4免疫染色梗死邊界切片(C)載體處理的心髒和(D) GNF- 6231處理的心髒。白色箭頭指向GATA4染色的細胞核。比例尺為50 μ m;每組N≥3隻小鼠的圖像至少代表4個切片。

WNT抑製增加心源性Sca1的增殖⁺祖細胞

我們接下來試圖確定在接受GNF-6231治療的心髒中數量較高的增殖間質細胞的身份。為了評估這些增生性間質細胞是否是冠狀動脈血管內壁的內皮細胞，對血管性血友病因子(vWF)和PCNA進行聯合免疫染色。盡管在GNF-6231和載具處理的心髒中都觀察到少量增殖內皮細胞，但藥物和載具處理組的雙陽性細胞無顯著差異(補充圖6A和6B)。

圖6:抑製WNT可減少心肌細胞死亡。(A、B)梗死邊界區cTnI和TUNEL聯合染色的代表性切片(一)vehicle-treated心,(B)gnf - 6231治療的心。(C)TUNEL陽性心肌細胞百分數的定量顯示，在經GNF-6231處理的心髒中，凋亡心肌細胞明顯減少。N=每組5隻小鼠，每隻小鼠至少4個切片，*p=0.022，未配對t檢驗。(D)通過代謝吸收(MTT)法測定HL-1大鼠心肌細胞存活率，結果顯示重組WNT3A處理後細胞存活率顯著降低，而添加C-113可挽救細胞存活率。柱狀圖表示平均值±標準差;獨立實驗N=3個重複;* P≤0.05;多次比較的Kruskal- Wallis檢驗和Dunns校正。(E)重組WNT3A或WNT3A和C-113處理的人ipsc衍生iCell心肌細胞的代表性圖像，存在250 μ M H₂O₂表明在應激下，重組WNT3A處理增加了細胞死亡，而C-113抑製WNT挽救了細胞死亡。(F)每20x場定量%TUNEL陽性的iCell心肌細胞。N≥12 /組，3個獨立運行的實驗，每個重複至少4個區域成像;**p≤0.01，***p≤0.001;多次比較的單向方差分析與Bonferroni校正。A-B和E的比例尺代表50 μ m。

我們和其他人已經證明，WNT抑製會導致成體幹細胞/祖細胞(骨髓來源的間充質幹細胞[32])和心髒組織駐留側群體祖細胞[30]的增殖。此外，在遠端心肌免疫染色切片中，一些增殖間質細胞呈球形，核大，定位於文獻[33]中描述的組織駐留祖細胞的“幹細胞龕”(圖4F)。這些增殖αSMA陰性間質細胞在GNF-6231處理的遠端心肌組織中的比例明顯高於對照處理的心肌，如前一節所述(補充圖5A)。我們假設，損傷後使用GNF-6231治療可誘導心髒祖細胞增殖。

我們評估了WNT對Sca1的抑製作用⁺CD31^-CD45^-CD117^-熒光激活細胞分選法(FACS;補充圖7 a)。表達可熱性猴病毒sv40t抗原的小鼠(H-2Kb-tsA58轉基因小鼠或Immorto小鼠)用於此目的[25]。從這些小鼠中分離出的有條件永生化細胞，在非允許條件下不表達t抗原並表現為原代細胞(25)。根據這些細胞分化為心髒中所有三種主要細胞類型的能力，對其多能性進行了測試:心肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞(補充圖7B和7C)。

圖7:抑製WNT降低體外膠原合成活性。(一)αSMA(綠色)和骨膜素(紅色)染色證實培養的原代肌成纖維細胞;比例尺等於50 μ m。(B)在原代心肌成纖維細胞中Col1α1基因的相對表達在WNT抑製劑處理和未處理時顯示Col1α1基因的表達在WNT抑製劑處理後顯著降低。柱形代表平均值±標準差。獨立實驗N=4個重複;* p = 0.0265;Mann-Whitney測試。

Sca1⁺細胞穩定overexpressingWNT3a目的是評估細胞對WNT激活的增殖反應以及隨後對GNF-6231或C-113的抑製。Wnt3a與僅載體(LZRS)對照相比，過表達減少了增殖，通過BrdU合並測量(圖5A和5B)。用GNF- 6231(圖5A)或C-113(圖5B)抑製WNT 24小時會降低WNT3a過表達的抗增殖作用。在Sca1中也觀察到類似的效應⁺細胞穩定表達Axin2，一種WNT通路負調控因子(數據未顯示)。由於識別Sca1或Sca1的技術挑戰，我們無法確認WNT通路對原位Sca1+細胞增殖的影響c - kit通過免疫染色在心髒表達祖細胞。有趣的是，與對照組相比，通過早期分化心肌細胞[34]表達的GATA4轉錄因子在GNF-6231處理的心髒梗死邊界區更多心肌細胞的細胞核中定位(圖5C和5D)。綜上所述，這些觀察結果表明GNF-6231處理心肌的增殖細胞可能包括肌源性祖細胞。

抑製WNT增強心肌細胞存活

我們接下來的問題是，在接受GNF-6231治療的動物中，心肌功能的保留和較小的梗死麵積是否可以至少部分地通過對心肌細胞死亡或存活的影響來解釋。先前的研究表明，sFRP2抑製WNT可以提高心肌細胞在MI模型[35]和培養中的存活率，特別是通過與WNT3A結合並阻斷其促凋亡信號[36]。末端脫氧核苷基轉移酶(TdT) dUTP鎳端標記(TUNEL)檢測細胞死亡原位．TUNEL與心肌細胞標記物cTnI共免疫染色顯示，在梗死邊界區TUNEL百分率明顯降低⁺在GNF-6231處理的心髒中(凋亡或壞死)心肌細胞與對照相比(在GNF-6231處理的心室中低2.03倍;* p = 0.022;圖6 a-6c)。為了進一步驗證WNT抑製對心肌細胞存活的積極作用在體外在分離的心肌細胞上進行細胞存活和細胞死亡測定。在小鼠心肌細胞HL-1細胞係中，通過測定代謝活性，使3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑- MTT -還原為不溶性福馬讚(MTT法)，來評估細胞活力。50ng /mL小鼠重組WNT3A處理48小時後，這些細胞的存活率顯著降低(比對照組降低16.4%;* p≤0.05;圖6D)，可通過WNT抑製劑C-113治療逆轉(較WNT3A治療增加18.78%;* p≤0.05;圖6 d)。通過實時RT-PCR檢測WNT靶基因C-113對WNT通路的抑製作用Axin2表達式(補充圖4B)。由於BrdU摻入試驗表明WNT通路調節對這些細胞的增殖沒有影響(補充圖4C)，我們得出結論，對細胞活力的影響完全是由於減少了細胞死亡。為了進一步證實這些發現，我們使用了人類ipsc來源的心肌細胞(iCell®心肌細胞2;國際細胞動力學公司，麥迪遜，WI)。這種高度純的心肌細胞表達心肌細胞標誌物cTnI(補充圖4A)和Sarcomeric Alpha actiin(參考[37]和製造商數據表)，並在培養中跳動。TUNEL實驗表明，在這些細胞存在氧化應激誘導的250µM H₂O₂在美國，重組WNT3A治療顯著增加了細胞死亡(TUNEL百分比)⁺細胞比對照組高1.8倍;**p≤0.01)，而WNT抑製劑處理減少細胞死亡(比WNT3A處理減少3.6倍;* * * p≤0.001;圖6E和6F)，進一步表明增強的肌細胞存活和減少的肌細胞死亡有助於觀察到損傷後WNT抑製的前修複作用。

WNT抑製降低心肌成纖維細胞I型膠原mRNA的表達

如前所述，與載體治療相比，GNF-6231治療減少了肌成纖維細胞增殖(圖4I)。由於心肌成纖維細胞是負責瘢痕形成的主要基質合成細胞，我們測試了WNT抑製是否也影響心肌成纖維細胞的I型膠原合成。主要αSMA⁺肌成纖維細胞(圖7A)從成年小鼠心髒中產生，如前所述[26]。用WNT抑製劑(1 μ M C-113)處理這些細胞48小時，降低了膠原蛋白1α1基因表達(比對照組降低了39.16%;*p=0.0251)，由qRT-PCR測定(圖7B)。這些數據表明，WNT抑製通過調節心肌成纖維細胞的增殖和基質合成活性來降低梗死心髒的促纖維化作用。

討論

多項研究報道心肌梗死後典型WNT信號會暫時性增加[4,5,38]。在這項研究中，我們發現在mi後的幾天內，通過阻斷WNT配體的分泌來暫時抑製WNT/β-catenin信號通路，可以阻止mi後組織WNT的激活。此外，梗死後治療性抑製WNT可減輕不良心髒重構，改善心室功能，並減小梗死麵積。這些發現證實了已發表的關於小分子吡啶短期抑製WNT對損傷後修複有積極作用的報道[11,12]。雖然我們的研究反映了WNT抑製劑治療後細胞增殖[11]增加和心肌成纖維細胞增殖[12]減少的報道，但我們發現，與這些研究相反，GNF-6231不影響內皮細胞(vWF⁺)增殖，增加心肌細胞存活是改善梗死後恢複的潛在中介。這些差異可能是由於吡黃毒性對[11]的治療有限和後遺症，對配體依賴和非配體依賴的WNT信號通路的阻斷，或吡黃[39]靶向的酪蛋白激酶1α對Hedgehog信號通路的側支抑製的混雜作用。

我們的結果也與另一項研究不同，在該研究中，MI[10]後，WNT3A/5A拮抗劑肽通過小滲透泵輸送超過5周。雖然我們觀察到在心功能、重構和梗死麵積上有相似的前修複作用，但對特定細胞群的影響明顯不同。與肌成纖維細胞數量和I型膠原合成增加相反，我們觀察到αSMA減少⁺肌成纖維細胞增殖及I型膠原表達。鑒於心肌成纖維細胞在心髒和其他器官瘢痕形成中的作用，減少而不是增加心肌成纖維細胞的數量和活性將有助於減少梗死後瘢痕形成。[10]對心肌細胞、祖細胞和其他成纖維細胞群的影響未被研究。WNT抑製在細胞效應上的這些差異可能是由於通過WNT配體的子集(例如限製於WNT3A和WNT5A的抑製)[10]對WNT通路的不完全靶向，或在整個MI修複過程中延長治療。

我們研究的一個重要優勢是利用了一種治療相關的小分子，其對所有配體依賴的WNT信號的完全抑製活性在靜脈注射後至少持續24小時，允許每日注射方案(無需通過微滲透泵輸送生物製劑)。這不會對其他依賴WNT的組織產生毒性作用。進一步調整藥物的化學成分和劑量或給藥方案可以進一步提高豪豬抑製的愈合效果。我們發現，短期藥物性WNT抑製可以改善心功能，減少不良重構，通過對這種作用的細胞介質的擴大調查。短暫的WNT抑製梗死後增加細胞增殖和心肌細胞存活，減少心肌成纖維細胞增殖及其基質合成活性。檢查以FSP1或Vimentin和vWF表達為標誌的其他成纖維細胞⁺與對照相比，GNF-6231處理對內皮細胞增殖無影響。之前關於WNT抑製的藥理學研究集中於梗死病理的特定細胞介質(例如:肌成纖維細胞增殖和活性，以及新血管化[10])，而我們的研究包括對改善修複的細胞介質的更全麵的檢查。

梗死後早期，WNT抑製引起間質細胞增殖增加，尤其是在遠端心肌。對GNF-6231處理產生增殖反應的心肌細胞大多排除心肌細胞、內皮細胞和各種基質細胞群，包括αSMA⁺myofibroblasts,波形蛋白⁺/ Periostin⁺/ FSP1⁺成纖維細胞。有趣的是，我們發現WNT通路激活下調了分離Sca1的增殖⁺CD31^-CD45^-CD117^-心髒祖細胞，是一種組織駐留幹細胞據報道駐留在間質龕。通過使用兩種機製不同的WNT抑製劑來抑製WNT，或通過過表達Axin2來逆轉這些細胞中WNT激活的抗增殖作用。這與已發表的重組WNT3A對側群體祖細胞的抗增殖作用的報道一致，在體外而且在活的有機體內在梗塞的心髒[30]。我們自己的工作，以及其他人在心髒損傷和其他損傷模型中的工作[11,32,40]都報告了WNT通路是細胞增殖的負調控因子，特別是幹細胞/祖細胞的增殖。盡管這些數據可能與其他成人器官中WNT對幹細胞穩態和自我更新必不可少的報道不一致[41-43]，以及在發育過程中[44,45]，但我們的數據支持一個模型，即WNT對幹細胞產生多相的、環境依賴性的影響。例如，在心髒發育[46]期間，就像骨骼肌再生[29]一樣，WNT的時間調節有助於幹細胞增殖和分化之間的平衡。此外，在目前優化良好和商業化使用的從iPSCs分化心肌細胞的方法中，為了實現最佳的心肌細胞生成[47]，尋求WNT活性的雙期調節。觀察到的GATA4的膨脹⁺(即新分化的)心肌細胞在梗死邊界區提供在活的有機體內支持WNT抑製在促進新生肌生成中的作用。

我們的數據還表明，WNT抑製在心肌梗死後具有抗纖維化作用。我們發現，WNT抑製減少了增殖肌成纖維細胞的數量在活的有機體內，並下調培養心肌成纖維細胞中I型膠原蛋白的表達。在大量研究報告WNT激活是心髒[48]和許多其他形式組織損傷纖維化的驅動因素的背景下，這些結果並不令人驚訝[49,50]。

除了影響細胞增殖和肌成纖維細胞活性外，WNT抑製還減少心肌細胞死亡，這是隨後進展為心力衰竭[51]的主要原因。這一觀察結果與已發表的WNT[30]的促凋亡作用以及WNT抑製對心肌細胞的促存活作用[35,36]一致。

在本研究中，基於大量文獻，我們專門關注豪豬抑製通過WNT通路的β-連環蛋白依賴臂所產生的影響，這些文獻表明豪豬抑製在梗死病理中的這一信號級聯中具有重要而複雜的作用——既包括不良適應[6,7,30]，也包括某些情況下的前修複作用[13,14,16]。然而，由於GNF-6231以豪豬為靶點，其獨立於典型WNT通路的作用可能也很重要。豪豬酰基轉移酶的活性是專門針對WNT配體的[20,22]，因此其他途徑不太可能受到影響。然而，豪豬抑製也可以影響WNT通路的非典型臂。

有報道稱Ca^{2 +}WNT非典型信號通路的/CAM激酶和JNK臂[34,52]在梗死病理和修複中起著重要作用。因此，未來研究抑製WNT配體分泌對WNT信號通路非典型臂的影響，可能會為豪豬抑製劑治療介導心髒恢複的機製提供更完整的圖景。此外，WNT/β-catenin通路可通過與TGFβ等其他通路的交叉作用在配體結合下遊被激活[53,54]。不依賴配體的WNT通路激活在梗死病理中的作用尚不清楚。開發一種WNT/β-連環蛋白降解複合物的生物相容激動劑(類似於吡啶，但沒有毒性)將有助於回答這些問題。

也就是說，我們的數據顯示短期WNT抑製在抵消梗死後左室功能障礙和最終衰竭(心肌細胞死亡和纖維化)的關鍵驅動因素方麵的潛力是具有臨床意義的，因為目前心肌梗死的護理標準主要集中在溶栓和姑息性幹預，而沒有解決由初始梗死驅動的持續疾病進展。此外，在現有文獻中WNT通路在梗死修複中的複雜[5,9,13,16,32]和多方麵作用的背景下，我們的數據可能表明，基於WNT調製的遺傳模型[6,7,14]的不一致觀察結果中，有可能存在時間調節的可擴展藥物性WNT抑製。隨著進一步的研究和正在進行的臨床試驗，[23]、GNF-6231和新一類豪豬抑製劑作為心髒再生的有效療法具有巨大的潛力。

資金

這項工作得到了退伍軍人事務成就獎的支持，NIH為PPY撥款r21eb019505 - 01a1和1R01GM118300，範德比爾特大學臨床和轉化科學獎[撥款編號UL1 RR024975-01]來自國家研究資源中心(NCRR)/國家衛生研究院(NIH)，並為PPY提供了慈善基金;和美國心髒協會博士預科獎學金[3PRE16080004]授予DB。

致謝

我們感謝Antonis K. Hatzopoulos博士提供TOPGAL小鼠，感謝Ethan Lee博士提供C-113，感謝諾華研究基金會基因組學研究所提供GNF-6231，感謝Vanderbilt大學醫學中心的轉化病理學共享資源(TPSR)為組織學標本準備提供幫助，感謝Bin Li博士和Caressa Lietman博士的建設性批評。

作者的貢獻

DB和PPY設計了這項研究。DB, SS, PJ, JA, JL和JLH進行了實驗並收集了實驗數據。DB, SS, JL和PPY分析數據，IF, JL和JLH提供試劑並幫助數據分析和概念建議。DB, JL, JLH和PPY撰寫了手稿。

利益衝突

JL和JLH是諾華研究基金會的員工。PPY被列為WNT抑製局部治療的發明者。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Bastakoty D, Saraswati S, Joshi P, Atkinson J, Feoktistov I等。(2016)WNT/β-Catenin通路的暫時性、係統性抑製促進心肌梗死後再生心髒修複。細胞幹細胞再生醫學2(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2472-6990.111

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出版的曆史:

收到日期:2016年5月12日

接受日期:2016年5月24日

發表日期:2016年5月30日