摘要

慢性肺部疾病和感染是囊性纖維化(CF)患者發病和死亡的主要原因。雖然銅綠假單胞菌，在CF患者的氣道中最常見，因此越來越多的人認識到CF菌群的多樣性，包括其他類群如博代氏杆菌屬．這裏我們描述的識別和影響博代氏杆菌屬pseudohinziiCF小鼠感染，以前沒有被認為會發生自發氣道感染。我們確定CF小鼠更容易受到b . pseudohinzii感染，並且比非cf小鼠更不能解決感染。此外，在CF和非CF小鼠中，b . pseudohinzii感染導致呼吸頻率顯著降低和cf特異性免疫反應。這些結果建立了CF小鼠模型作為研究CF相關感染的重要工具，並強調了潛在的貢獻博代氏杆菌屬到CF臨床病理。

簡介

囊性纖維化(CF)患者表現出複雜的肺部表型，其特征為氣道感染、炎症和阻塞。肺部疾病主要是不同菌群的氣道感染的結果，占CF死亡率的90%。

在慢性纖維化患者肺部定植的最常見的細菌種類是銅綠假單胞菌這是一種在其他患者群體中不常觀察到的病原體[1]。CF患者感染銅綠假單胞菌與正常情況下的CF患者相比，報告明顯較差的身體功能和體重增加，呼吸道症狀和治療負擔增加假單胞菌感染[2]。由於這種臨床負擔，大量的研究集中在流行和治療P.aeruginosa在CF患者。最近的研究表明，CF氣道微生物群實際上更加複雜和多樣化，通常由許多其他細菌種類組成[3,4]。鑒別氣道中的細菌種類曆來涉及培養痰液或氣管拭子並分析培養物中存在的細菌。然而，基於所選擇的培養條件(時間、培養基、溫度)和生物在混合培養中存在的競爭能力，這種方法是有偏見的，因為混合培養通常包含許多不同的物種。下一代測序技術通過消除培養的需要，提供了一種偏見較小的微生物區係檢測和鑒定方法。通過這種方法，很明顯，CF氣道中的微生物群落是多樣化的，包括細菌種類如博代氏杆菌屬以前通常不與CF肺感染[5]相關。博代氏杆菌屬感染可能具有特別高的致病性，因為它們是已知的少數幾種可以逃避中性粒細胞胞外陷阱的病原體之一，而中性粒細胞胞外陷阱是呼吸道感染的一個關鍵免疫機製[6]。

CF小鼠模型的一個公認的局限性是缺乏自發氣道感染P.aeruginosa在這些動物。我們之前的工作描述了未感染CF小鼠的呼吸頻率增加和肺力學的改變，這表明存在一種肺部表型，它不僅僅是感染的結果[7,8]。然而，在這些研究過程中，是自發的博代氏杆菌屬我們的CF小鼠模型通過常規監測發現呼吸道感染。與非CF小鼠相比，CF動物感染更為常見，可見支氣管肺泡灌洗液(BAL)中中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞增多博代氏杆菌屬通過16S rRNA基因測序確定[5,9]。初步測序結果表明，從我們的小鼠菌落分離出的細菌是博代氏杆菌屬hinzii；然而，更徹底的序列分析顯示，這實際上是一種最近被描述的新物種博代氏杆菌屬被稱為博代氏杆菌屬pseudohinzii(9、10)。b . pseudohinzii已被確定為其他肺疾病小鼠模型[11]的混雜種。偶然的鑒定B.pseudohinzii在CF和非CF小鼠的感染和影響B.pseudohinzii本文介紹了CF和非CF小鼠的呼吸速率和感染反應。

材料和方法

小鼠模型

在這些研究中使用了一個描述良好的CF小鼠模型:F508del (Cftr^tm1kth)是人類最常見的CF突變[12]的小鼠版本。這些CF小鼠模型在C57BL/6J背景上同源，因此以野生型C57BL/6J作為對照。每隔五代，每隻小鼠係回交到C57BL/6J背景，以盡量減少株係之間可能的遺傳漂變。凱斯西儲大學動物保護和使用機構委員會批準了實驗方案。研究中使用的所有小鼠都是成年小鼠(至少6周大)。所有小鼠都被允許不受限製地獲得飼料(Harlan Teklad 7960;Harlan Teklad Global diet, Madison, WI)和含有滲透性瀉藥的無菌水Colyte (Schwarz Pharma, Milwaukee, WI)，並在平均環境溫度22℃的條件下保持12小時光照，12小時暗循環。

全身體積描記法

在經過如上[13]所述的適應期後，用溫度平衡全身容積描記器(采樣率=200 Hz)記錄自發呼吸小鼠的呼吸模式。腔室中的壓力變化被轉換為代表通氣模式的信號，通過前置放大器(Max II, Buxco Electronics)，獲取(Power1401, CED, Cambridge, UK)，並與呼吸采集軟件(Spike 2, CED)存儲，用於進一步分析呼吸模式動力學。對60年代的通氣模式進行量化。報告了三個時代的平均值。增加的呼吸、歎息、吞咽、明顯的動作和喘息被排除在分析之外，動物被記錄在類似的條件下。

博代氏杆菌屬感染

生長曲線分析b . pseudohinzii建立了病原的對數期以增強接種體的活力。小鼠鼻內接種10⁶b . pseudohinzii菌落形成單位(cfu)，基於細菌的培養和生長模式。的壓力B pseudohinzii使用的是最初從我們的CF小鼠群體中分離出來的[5,9]。每日隨訪小鼠達2周，此後每周隨訪體重和臨床評分，並在不同時間點進行容積描記術和支氣管肺泡灌洗(BAL)。利用BAL液來確定細胞招募到肺和細菌定植。

其餘肺也均質進行細菌負荷評估。細菌負荷的定量是用瓊脂板進行標準稀釋分析，這也可以證明任何汙染問題。

支氣管肺泡灌洗液分析

從小鼠全身容積描記術後獲得的BAL液，用血細胞計用四象限評估總細胞計數，用細胞旋轉和賴特吉姆薩染色評估差異。在37°C培養72小時的血瓊脂板上鍍BAL液，獲得細菌培養。

博代氏杆菌屬ELISA

小鼠血清稀釋1:50，一式兩份塗於預塗膜上B.hinzii陽性和陰性抗原孔(XpressBio)，並根據製造商的說明在37°C孵育30分鍾。然後在提供的洗滌液(含表麵活性劑的三脂緩衝液)中清洗孔，吸幹，在37°C下與過氧化物酶結合孵育45分鍾。孵育後，最後一次清洗孔，吸幹，室溫下與ABTS基質孵育30分鍾。在吸光度板閱讀器上，在405nm處立即讀取板的比色變化。從陽性抗原孔中減去陰性抗原孔作為背景，重複平均，如果abs>0.300在405nm處，則認為結果為陽性，根據製造商的建議。

結果

博代氏杆菌屬感染最初是通過每月例行的隨機小鼠篩選在小鼠群體中發現的。一旦檢測到，我們使用BAL液體培養對CF和非CF小鼠進行了全麵的廣泛監測。與非CF小鼠(14.9%)相比，在我們的菌落中CF小鼠更有可能檢測出感染陽性(66.6%的檢測小鼠)，盡管由於居住在一起而共同暴露。博代氏杆菌屬BAL液體探測到文化,表明呼吸道感染時犧牲,並表明CF小鼠感染易感性更大,或明確的能力下降(表1),確定CF老鼠更容易受到感染,我們收集了縱向ELISA數據(測量免疫球蛋白和IgM水平)的CF鼠標殖民地的百分比計算CF和non-CF老鼠,或者曾經被感染了博代氏杆菌屬．在大約2年的時間裏，我們篩選了180隻CF小鼠和137隻非CF小鼠。29%的CF小鼠陽性博代氏杆菌屬相比之下，非cf小鼠的感染率僅為2%(表2)。

博代氏杆菌屬感染	Non-CF老鼠n = 67	CF老鼠n = 33
	10/67 (14.9%)	22/33 (66.6%)

表1:通過BAL培養確定暴發初期自發性博德氏菌感染的發生率。

博氏杆菌ELISA陽性	Non-CF老鼠N = 137	CF老鼠N = 180
	3/137 (2%)	53/180 (29%)

表2:老鼠陽性博代氏杆菌屬ELISA。

在最初爆發博代氏杆菌屬我們發現CF和非CF小鼠電流呈陽性博代氏杆菌屬感染(由BAL培養確定)也明顯降低呼吸頻率(112±32次/分鍾)vs．每分鍾216±64次呼吸;p<0.001)(圖1)。作為一項正在進行的研究的一部分，我們對一組最初被發現為陽性的小鼠進行了呼吸頻率的測量博代氏杆菌屬．這些結果如圖1所示。

圖1:非CF和CF小鼠的呼吸頻率降低博代氏杆菌屬感染(每分鍾112±32次呼吸)vs．每分鍾216±64次呼吸;p < 0.001)。

評估…的效果博代氏杆菌屬我們在未感染的CF小鼠鼻內接種b . pseudohinzii培養並使用容積描記術監測呼吸頻率。接種48小時後，CF小鼠的呼吸頻率比非CF小鼠下降更快vs．接種1周後)和非CF小鼠能夠在3個月的研究期間從感染中恢複，但CF小鼠不能(圖2A)。感染3個月後，與非CF小鼠相比，CF小鼠仍有明顯的呼吸頻率降低(每分鍾88±15次呼吸)vs．155±11次呼吸/分鍾;P <0.01)，說明感染對呼吸頻率的影響仍然存在。在接種後3個月最後一次測量呼吸頻率後，收集BAL液，7/9 (78%)CF小鼠培養博代氏杆菌屬相比之下，非cf小鼠隻有1/11(9%)(表3)。

圖2:非CF小鼠(n=12)和CF小鼠(n=10)均表現出呼吸頻率降低博代氏杆菌屬在CF小鼠中接種3個月後仍然有效(A)。CF顯示出明顯增加的中性粒細胞反應博代氏杆菌屬與非cf小鼠相比(B)。

博代氏杆菌屬感染	Non-CF老鼠n = 11	CF老鼠n = 9
	1/11 (9%)	7/9 (78%)

表3:接種3個月後博德氏菌感染發生率。

最後，我們研究了CF小鼠與非CF小鼠的免疫反應是否存在差異。CF小鼠在接種後48小時、2周和3個月BAL液中中性粒細胞百分比顯著增加，表明對感染有強烈和持久的免疫反應(圖2B)。

討論和結論

我們已經描述了慢性自發性肺感染的CF小鼠模型，由於博代氏杆菌屬．博代氏杆菌屬CF小鼠比非CF小鼠更容易被檢測到感染，兩組小鼠的呼吸頻率顯著降低，其中CF小鼠在故意感染後更早的時間點顯示呼吸頻率降低。雖然呼吸頻率降低的機製仍有待闡明，但值得注意的是，CF小鼠和非CF小鼠都沒有表現出其他疾病或痛苦的外在跡象。然而，78%的CF小鼠仍然存在博代氏杆菌屬在感染後3個月從他們的BAL液中培養，而非cf小鼠隻有9%。綜上所述，這些數據表明CF小鼠對博代氏杆菌屬感染，清除能力下降。

在感染後48小時、2周和3個月，CF小鼠BAL液中中性粒細胞比例較高。這些數據表明他們無法清除博代氏杆菌屬肺部感染並不反映在獲得感染後無法產生免疫反應。這與我們之前使用條件句的研究是一致的雌性生殖道並發現這些小鼠的分解能力降低了假單胞菌這表明CFTR的缺失會導致免疫功能[14]受損。

最後，大多數CF小鼠仍呈陽性反應博代氏杆菌屬在感染3個月後從他們的BAL液中培養，而隻有一隻非cf小鼠。這表明細菌可能在CF氣道定植，這與人類CF氣道疾病一致。

所有種類的博代氏杆菌屬產生腺苷環化酶毒素(ACT)、皮壞死毒素和氣管細胞毒素[15]。ACT的表達被認為有助於呼吸道定植[16]，皮壞死毒素導致組織損傷[17]，氣管細胞毒素導致睫狀體麻痹[18]。這三者一起是博代氏杆菌屬感染，雖然有種類特異性毒素，如百日咳毒素，可存在於這些。ACT由B.hinzii不同於其他博代氏杆菌屬物種(如博代氏杆菌屬百日咳)，因為它對鈣調素的親和力降低。因此，它不會引起在b .百日咳這被認為是導致兩個物種之間毒力差異的原因。B.hinzii雖然還沒有得到很好的研究，但與其他得到充分研究的博氏菌屬(如b .百日咳而且博代氏杆菌屬bronchospetica)感染B.hinzii可能會有類似的效果，盡管效果比較溫和。

雖然博代氏杆菌屬已在CF患者的氣道中發現，但尚不清楚它在CF肺部疾病的病理生理中起什麼作用[19-24]。博代氏杆菌屬據估計，感染發生在5-7%的CF患者中，盡管認為存在博代氏杆菌屬用標準方法培養時，由於來自其他物種的競爭，可能被廣泛低估[24]。對CF患者的痰液進行直接測序發現了新物種的存在博代氏杆菌屬[25]除了檢測以前識別的菌株。因此,雖然博代氏杆菌屬在CF患者中已發現[25-27]，但其對CF肺病理生理的作用尚未闡明。

為控製肺部感染，慢性肺纖維化患者通常會接受多種抗生素療程的治療。具體的抗生素治療通常是根據從痰中培養出的東西來選擇的，要特別注意存在的抗生素Pseudomonas和葡萄球菌[28]。博代氏杆菌屬很難培養，因為它經常在培養水平上被其他微生物物種競爭。的博代氏杆菌屬從CF小鼠群中分離出的一種對四環素和強力黴素最敏感。有趣的是，這些藥物通常隻在CF治療過程的晚期(平均在最初診斷後20年)使用，一旦患者被診斷為複合冠狀芽孢杆菌感染[28,29]。因此，如果CF患者有感染博代氏杆菌屬在美國，他們不太可能接受對根除疾病最有效的抗生素治療。B.hinzii最親近的親戚b . pseudohinzii，也被發現對慶大黴素敏感，但對妥布黴素[30]不敏感。然而，慶大黴素不像妥布黴素那樣被廣泛使用，因為在CF患者中腎毒性的發生率增加。因此，目前對CF的臨床幹預措施很可能不足以預防或治療所有的CF博代氏杆菌屬感染。

總之，我們描述了增加的易感性博代氏杆菌屬CF小鼠模型的感染。這種感染導致CF和非CF小鼠呼吸頻率降低。有趣的是，CF小鼠一旦感染，就會變成慢性感染，因為它們似乎無法清除感染，盡管它們的中性粒細胞反應增加。是否博代氏杆菌屬在人類肺纖維化感染的致病性中起著重要作用的因素還有待確定，但小鼠模型為這些研究提供了令人興奮的新途徑。

致謝

這項工作得到了美國國立衛生研究院和NHLBI的撥款1R21HL130839-01A1 (Darrah/Flask MPI)的支持。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Darrah R, Bonfield T, LiPuma JJ, Litman P, Hodges CA，等(2017)囊性纖維化小鼠發生自發性慢性博德特拉氣道感染。J感染Pulm Dis 3(2): doi http://dx.doi。org/10.16966/2470 - 3176.128

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出版的曆史:

收到日期:2017年10月11日

接受日期:2017年10月28日

發表日期:2017年11月02