結核病:意見-科學Forschen

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研究文章
基於微陣列的與呼吸道感染相關的病毒病原體分子檢測

Muhammet Guzel Kurtoglu1 *歐雅Akkaya1Ayse Ruveyda Ugur1Edibe Nurzen Bozkurt2Nurettin岩石3.

1科尼亞培訓和研究醫院，醫學微生物科，科尼亞，土耳其
 2土耳其共和國衛生部，土耳其安卡拉
 3.土耳其統計研究所，安卡拉地區理事會，安卡拉，土耳其

*通訊作者:土耳其科尼亞醫學微生物科，科尼亞培訓和研究醫院，穆罕默德·古澤爾·庫爾特奧盧，電話:00903323236709;電子郵件:kurtoglumg@gmail.com


摘要

病毒是全世界急性呼吸道感染(ARI)的主要原因，估計發病率為20-60%。本研究的目的是利用微陣列多重PCR技術對有呼吸道感染症狀的兒童和成人患者的呼吸道病毒病原體進行快速識別，並調查病原體隨年齡和季節的發生頻率。

在2013年1月至2015年12月期間，1290名確診為ARI的患者(年齡1 -75歲)納入了該研究。采用微陣列逆轉錄酶聚合酶鏈反應(M-PCR)方法對呼吸道標本中的人呼吸道病毒(RSV)、人鼻病毒(HRV)、流感病毒(IV)、人波卡病毒(HBoV)、副流感病毒(PIV)、人偏肺病毒(HMPV)、腺病毒(ADV)和人冠狀病毒- 229e (HCoV-229E)進行檢測。

在1290例患者中，1110例(86%)為兒童，180例(14%)為成人。750個(58%)樣本中至少發現了一種病原體。750份陽性樣本中，單病毒感染率為76%，合並感染率為24%。在165個標本中檢測到雙重病毒製劑，在15個標本中檢測到三重病毒製劑。2013年、2014年、2015年樣本總陽性率分別為41%、33%、26%。大多數陽性標本來自兒科診所(94%)，64.4%的病毒性ARI患者≤2歲。冬季(40%)和春季(39%)陽性率增加。檢測到的最常見病毒如下:RSV (47%)， HRV (15%)， IV (10%)， HBoC和PIV (8%)， HMPV和ADV (%5)， EV和HCoV-229E(%1)。

關鍵字

呼吸道感染，病毒，病原體，微陣列，多重PCR

簡介

病毒是全世界急性呼吸道感染(ARI)的主要原因，估計占所有病例的20-60%[1-3]。引起急性呼吸道感染的最常見病毒有:甲型和乙型流感病毒(IAV和IBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、腺病毒(ADV)和人鼻病毒(HRV)。近年來，新出現的病毒如人偏肺病毒(HMPV)和人冠狀病毒(HCoV)與ARI[4]有關。

據報告，全球肺炎的年發病率在0.28%至1.16%之間。急性呼吸道感染(ARI)的發病率和死亡率在生命早期和老年均呈上升趨勢，一直是三大致死原因之一。世界衛生組織(世衛組織)報告了2014年中等收入國家5歲以下兒童ARI的死亡率13-15%，指出其總體死亡率高於艾滋病、瘧疾和麻疹等大多數傳染病，甚至高於它們的總和。

目前的疫苗不能有效預防病毒引起的呼吸道感染。因此，應對病毒性呼吸道感染采取有效的控製和治療措施。由於地理、氣候和社會經濟因素的不同，避免不同病毒感染的方法也不同[7-10]。

副粘病毒科RSV是一種具有單鏈RNA基因組的包膜病毒。RSV菌株分為兩大類;RSV- a和RSV- b因其抗原和遺傳多樣性不同，是嬰幼兒毛細支氣管炎和肺炎的重要病因。RSV也是成年人發病和死亡的一個重要原因。HRV和屬於小核糖核酸病毒科的腸道病毒(EV)也可引起兒童上呼吸道和下呼吸道感染。它們是具有單鏈RNA基因組的非包膜病毒。HRV有超過100種血清型。在腸道病毒屬中已鑒定出12種和100多個亞型。流感病毒(正粘病毒科)是具有單鏈和分段RNA基因組的包膜病毒。副流感病毒是副粘病毒科的成員，具有一個包膜和單鏈RNA。 They cause upper and lower airway infections such as rhinitis, otitis, laryngotracheobronchitis, and pneumonia. Human bocavirus (HBoV), which causes acute respiratory infections, was identified in 2005 as a new parvovirus of the Parvoviridae family. It is an non-enveloped and single-stranded DNA virus. An enveloped RNA virus, HMPV can cause acute respiratory tract infections in children and in adults. ADV is a non-enveloped double-stranded DNA and can cause respiratory tract infections in addition to gastroenteritis, cystitis and meningoencephalitis. Up to now, over 50 serotypes of ADV have been identified. HCoV is a single stranded RNA virus and implicated in respiratory tract infections, enteritis, cardiovascular infections and neurological defects [11].

RSV、IAV、IBV、ADV、piv 1-3和HMPV可通過直接熒光抗體和細胞培養法鑒定。除了上述病毒外，HRV、HCoV、HBoV、PIV 4和RSV血清型A和B都可以通過分子方法檢測到。近年來，同時檢測多種呼吸道病毒的多重聚合酶鏈反應(M-PCR)方法也被廣泛應用於ARI的早期診斷[12,13]。

很少有流行病學研究調查不同年齡組，特別是土耳其兒童中引起急性呼吸道感染的病毒病原體的頻率。本研究的目的是利用微陣列多重PCR技術對有呼吸道感染症狀的兒童和成人患者的呼吸道病毒病原體進行快速識別，並調查病原體隨年齡和季節的發生頻率。

材料和方法
取樣和逆轉錄酶PCR檢測

從各診所(主要是兒科診所和胸科疾病診所)谘詢的患者身上采集的鼻咽刷樣，放在適當的病毒傳輸介質(hivirusTMTransport Medium, HIMEDIA，印度)在2013-2015年期間約36個月。樣品保存在-20℃，直到RNA/DNA提取。對每個樣本，采用CLART進行基於微陣列的逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測®提取RNA/DNA後的Pneumo Vir (genome, Spain)。最常見的19種呼吸道病毒，RSV A型(RSV-A)， RSV B型(RSV-B)， HRV，甲型流感病毒(亞型H3N2, H1N1, B, C和H1N1/2009)， HBoV, PIV 1, 2, 3和4(亞型A, B)， ADV, HCoV-229E，腸道病毒(埃可病毒)，HMPV(亞型A和B)通過病毒基因組的特定片段擴增被檢測和表征。放大內部控製被用於確保過程的適當執行。擴增過程完成後，利用低密度微陣列平台:CLART(臨床陣列技術)檢測擴增產物。CLART平台以8孔條狀(圖1)[14]的形式，使得產物沉澱的雜交和可視化非常容易。

計算男女患者的發病率和年齡。根據患者年齡、季節、診所等因素測定致病病毒病原體的分布。利用Z檢驗估計了病毒在不同季節發生的頻率。

圖1:CLART-StripR -CS平台采用8井條形結構。

結果

2013年1月至2015年12月，在科尼亞教育研究醫院各門診就診，有發熱、咽痛、咳嗽、呼吸困難的患者(年齡1個月-75歲)。1290例患者體檢後，因有ARI體征、症狀、聽診異常、胸片異常等診斷為ARI。最常見的症狀是發熱(≥38o C)、咳嗽和喉嚨痛。采集了1290例患者的呼吸道標本。其中男性684例(53.1%)，女性606例(46.9%)。大多數患者為兒童(86%對14%)。平均年齡5.66歲(SD=12.81116)。年齡組範圍見(表1)。

年齡 ≤2 3 - 5 6 - 18 19-59 ≥60 總計
n (%) 328 (25.4) 475 (36.8) 307 (23.8) 79 (6.2) 101 (7.8) 1290 (100)

表1:ARI確診患者年齡分布[n (%)]

呼吸道標本采用多重RT-PCR檢測(圖2-4)。在540份(42%)樣本中未檢測到病毒因子，而在750份(58%)樣本中至少檢測到一種致病因子。在750例樣本呈陽性的患者中，686例為兒童，64例為成人(表2)。病毒因子在冬季(40%)和春季(39%)更易檢測到。570例(76%)陽性標本中發現單一病毒病原體，180例(24%)標本中同時檢測到多種病毒病原體(表3和表4)。大多數陽性標本(96%)來自兒科診所。在165個樣本中檢測到雙重病原體，在15個樣本中檢測到三種病原體。在19種病毒中，RSV是最常見的病原體(47%)，其次是HRV(15%)和流感A-B(10%)。多種病毒因子的發生率為24%(表4)。RSV、其次是流感病毒和腺病毒是合並感染中最常見的病毒。

圖2:微陣列井。

圖3:患者結果陰性。

圖4:患者結果陽性。

年齡 ≤2 3 - 5 6 - 18 19-59 ≥60 總n
RSV 150例(31%) 90例(53%) 15 (44%) 8 (24) 5 (17%) 268
HRV 53 (11%) 17 (10%) 5 (15%) 8 (24) 3 (10%) 86
4 24 (5%) 14 (8%) 8 (23%) 5 (14) 6 (20%) 57
HBoV 28 (6%) 8 (5%) - 8 (24) 3 (10%) 47
此外 38 (7.8%) 5 (3%) - - - 43
HMPV 25 (5%) 3 (2%) 3 (9%) - - 31
阿德 19 (4%) 2 (1%) 3 (9%) - 2 (7%) 26
電動汽車 5 (1%) - - - 1 (3%) 6
hcov - 229 e 1 (0.2%) - - 2 (5) 3 (10%) 6
合並感染 140例(29%) 30 (18%) - 3 (9) 7 (23%) 180
總n (%) 483例(64.4%) 169例(22.6%) 34 (4.5%) 34 (4.5%) 30 (4%) 750

表2:根據年齡範圍檢測到的病毒率[n (%)]

病毒 冬天
n (n / 216 = %)		 春天
n (n / 227 = %)		 夏天
n (n / 40 = %)

秋天n (n / 87 = %)

總n
RSV 126 (58) 130 (58) 2 (5)

10 (12)

 268
HRV 12 (6) 30 (13) 8 (20)

36 (41)

 86
4 23日(11) 30 (13) 3 (7) 1 (1) 57
HBoV 11 (5) 9 (4) 13 (32)

14 (16)

 47
此外 14日(6) 0 7 (18)

22 (25)

 43
HMPV 20 (9) 10 (4) 1 (3) 0 31
阿德 6 (3) 12日(5) 4 (10) 4 (5) 26
電動汽車 0 4 (2) 2 (5) 0 6

hcov - 229 e

 4 (2) 2 (1) 0 0 6

單一病毒感染

 216 (38) 227 (40) 40 (7)

87 (15)

 570

交叉感染

 88 (49) 65 (%) 12 (7) 15 (8) 180

總n (%)

 304 (40) 292 (39) 52 (7)

102 (14)

 750

表3:根據季節檢測到的病毒分布率[n (%)]

病毒 2013
n (n / 235 = %)		 2014
n (n / 180 = %)		 2015
n (n / 155 = %)		 總n
RSV 97 (41) 98 (54) 73 (47) 268
HRV 47 (20) 20 (11) 19 (12) 86
4 24 (10) 15 (8) 18 (12) 57
HBoV 18日(8) 18 (10) 11 (7) 47
此外 16日(7) 12 (7) 15 (10) 43
HMPV 15 (6) 8 (4) 八(5) 31
阿德 12日(5) 6 (3) 八(5) 26
電動汽車 2 (1) 1 (1) 3 (2) 6
hcov - 229 e 4 (2) 2 (2) 0 6
單一感染 235 (41) 180 (32) 155 (27) 570
合並感染 70 (39) 70 (39) 40 (22) 180
總n (%) 305 (41) 250 (33) 195 (26) 750 (100)

表4:按年份檢測到的病毒分布率[n (%)]

冬季(40%)和春季(39%)陽性率增加。呼吸道合胞病毒檢出頻次以冬季和春季為主，HRV檢出頻次以秋季為主，IV檢出頻次以春季為主(表3)。2013年、2014年、2015年樣本總陽性率分別為41%、33%、26%(表4)。Z檢驗統計結果差異有統計學意義(Z值>Z(0.05)表值)。

討論

呼吸道感染是世界上最常見的傳染病中的主要疾病。因此，急性呼吸道感染的高發作率導致的治療費用、住院費用、勞動力損失等因素，以及高發病率和死亡率，造成了巨大的經濟負擔。此外，它仍然是一個巨大的問題，因為它是5歲以下兒童死亡的主要原因之一。下呼吸道感染(LRTI)比上呼吸道感染(URTI)少見。然而，LRTI的經濟影響高於URTI。確診為下呼吸道感染的患者中有1-13%住院。據估計，兒童病毒性下呼吸道感染的治療費用約為每年24億美元。

我們在5歲以下兒童中檢測到的最常見的病毒病原體是RSV、HRV、PIV、IV和HBoV，其次是HMPV、ADV、EV和HCoV。成人(≥19歲)最流行的病毒是RSV、HRV、IV和HBoV，其次是HCoV、ADV和EV。值得注意的是，PIV和HMPV在成人中未檢出。

與我們的研究一致，Akkaya et al.[16]報道，HRV是兒童ARI的第二大常見原因，而RSV和IV是成人ARI最常見的兩種病毒。廣泛的流感疫苗接種計劃可能是RSV相關ARIs相對增加的原因[16,17]。

Hak等人[18]報道了在荷蘭引起呼吸道感染最常見的病毒病原體如下:IV、PIV、RSV和adv。在不同的研究中也有報道稱PIV是主要的病毒病原體，特別是在免疫力不完全的幼兒中引起再感染[19,20]。在中國，最常見的病原病毒是IV(30%)、PIV(18%)、RSV(16%)、ADV(15%)、HRV(11%)和HMPV(1.5%)。

在我們的研究中，2013年HRV和HMPV的檢出率略有上升，2014年RSV和HBoV的檢出率上升，2013- 2015年IV和PIV的檢出率上升。與文獻一致，我們發現RSV和IV在冬季和春季比秋季和夏季更頻繁。相比之下，HRV在秋季和夏季最常見，在冬季和春季頻率下降。HBoV、ADV和腸病毒檢出率在夏季有所上升，PIV檢出率在秋季最高，在春季無檢出率。此外，盡管2013-2015年它們的總體頻率很低，但秋季和冬季沒有檢測到腸道病毒，夏秋季沒有檢測到HCoV。

與我們的研究一致的是，不同的研究者報告了北半球冬季呼吸道病毒更為頻繁，RSV和IV是最常見的病毒病原體[16,21-26]。各種研究報道HCoV、HMPV和HBoV的檢出率分別低至10-15%、2-12%和1-5%[3,18,23,24,27]。有趣的是，在這項研究中，所有31種HMPV都隻在兒童中檢測到。在其他研究中也在兒童中檢測到HMPV。在我們的研究中，ADV在兒童中比在成人中更常見，這與文獻中的各種研究一致[9,28,29]。ADV在全年各年齡組均有流行，特別是在免疫抑製患者中[30-32]。

HCoV是成人重要的呼吸道病原體[33]。我們隻在1例2歲以下的兒童患者和5例成人病例中檢測到HCoV。許多研究報告稱HCoV在成人中比在兒童中更常見[21,34,35]。也有研究報道HCoV更常在免疫抑製患者中導致ARI[32,36,37]。

在本研究中，發現單病毒感染率為76%，這在兒童年齡組中很常見(77%)。許多研究者報告說，單次感染在兒童年齡組中更為常見，其發病率在35.15%到36.6%之間[18,21,38-44]。

近年來發展的M-PCR技術特異性和敏感性較高，也證明多種病毒可合並感染呼吸道[45-50]。在我們的研究中，合並感染率為24%。RSV是合並感染中最常見的成分，其次是IV和ADV。在不同的研究中，合並感染率在5-62%之間存在差異，有報道稱RSV是這些感染中最常見的成分，其次是ADV、HBoV和IV[18,22,51,52]。這些研究結果與我們的研究結果一致，合並感染多見於兒童年齡組[22,24]。

生物技術在概念上到達的終點之一是微陣列方法。它的原理是在一個簡單的芯片上實現目標基因組的可視化。它還允許確定許多基因的相互作用。微陣列技術最初源於“南方印跡”技術。這種快速和自動化的技術也被用於基因表達分析、遺傳和突變分析、環境研究、抗微生物藥物耐藥性基因分析以及識別感染因子[53,54]。在兩項研究中，在調查的511個病毒病原體樣本中，使用微陣列技術鑒定出349個陽性，與PCR和DNA測序方法[55]得到的結果一致。由於微陣列法是一個自動化的係統，它最小化了人為誤差。盡管微陣列法有許多優點，但必須知道它也有一些缺點，例如一次執行太多的數據，需要時間來分析所有的結果，複雜和解釋的結果往往不夠定量，仍然是一項昂貴的技術。

結論

綜上所述，在本研究中，我們在初診ARI的患者中檢測到的病毒病原體患病率為58%，其中大部分為小兒年齡組(86%)。病毒性呼吸道感染在冬季和春季更為常見。合並感染多見於小兒。RSV、HRV、IV和HBoV被發現是最常見的病原體。及時、同時識別所有致病因子對疾病的預後、降低治療費用和住院時間都至關重要。基於微陣列的多重PCR方法具有較高的敏感性和特異性，可以同時檢測多種病原體並進行早期診斷，防止不必要的抗生素使用，並降低與ARI相關的發病率和死亡率。因此，M-PCR可以作為一種替代傳統診斷方法的方法。病毒感染的早期診斷很重要，因為它可以減少治療費用和住院時間。我們將病毒頻率輕微差異的原因歸因於患者群體的人口統計學特征的差異、季節變化和特定的流行病差異。

病毒性急性呼吸道感染的快速和準確診斷非常重要，特別是在住院患者中，以避免不必要的抗生素使用，采取必要的感染控製措施，並允許在必要時給予特定治療，如果存在針對病原體的特定抗病毒療法。此外，在病毒病原體鑒定的幫助下，信息的改進可以根據患者的年齡和季節等因素預測致病因子。因此，我們建議將M-PCR用於住院兒科ARI患者的診斷。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Kurtoglu MG, Akkaya O, Ugur AR, Bozkurt EN, Kaya N(2017)基於微陣列的呼吸道感染相關病毒病原體分子檢測。J感染Pulm Dis 3(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-3176.122

版權:©2017 Kurtoglu MG，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2017年1月31日

  • 接受日期:2017年2月17日

  • 發表日期:2017年2月23日