摘要

哮喘的發病率和嚴重程度在世界範圍內持續上升。β-激動劑是最常用的哮喘治療藥物，但對某些哮喘患者的療效較差，長期持續使用β-激動劑的副作用令人擔憂。開發新型哮喘療法的需求突出表明，需要一種標準化方法，利用相關的活體動物模型有效篩選和測試潛在的支氣管保護化合物。在這裏，我們描述了一種驗證的方法，測試潛在的治療化合物，在室內塵蟎挑戰動物模型誘導支氣管收縮期間，其快速作用的功效。

關鍵字

支氣管擴張劑;體內;哮喘

簡介

哮喘是一種慢性和長期的肺部疾病，以炎症和可逆性氣道阻塞為特征。哮喘的發病率和嚴重程度在全球範圍內持續上升，據報道，2015年有多達2400萬美國人(7.4%的成年人和8.6%的兒童)患有哮喘。哮喘對男女都有影響，與年齡、社會經濟背景和種族無關。雖然大多數哮喘患者在適當的醫生指導的治療和預防措施下得到了很好的管理，但目前還沒有治愈的方法，而且某些哮喘患者對常用療法反應不佳。哮喘發病和死亡的一個重要原因是急性加重，可導致氣道損傷、重塑、肺功能下降甚至死亡[2-4]。重症哮喘的加重尤其值得關注，因為該人群的加重與肺功能加速下降[2]相關。

由於肺功能下降是嚴重加重的危險因素[5,6]，這種惡性循環促進了哮喘的加重傾向表型。此外，長期使用最常用的哮喘處方藥物:皮質類固醇[7]或短效β2激動劑的副作用也令人擔憂[8,9]。因此，哮喘患病率的上升、更好地控製病情惡化的需要以及減少常用哮喘藥物的長期副作用的願望，提高了使用相關活體動物模型有效篩選和測試潛在支氣管保護化合物的標準化方法的必要性。

目前，強迫振蕩技術(FOT)是在小動物體內研究中進行肺功能測試(PFTs)的金標準[10,11]。該技術通過在實驗對象的氣道開口處應用一個簡短的、小幅度的振蕩氣流測試信號，並表征輸入和輸出信號[10]之間的關係，提供精確和可重現的動物實驗對象肺功能測量。

在肺力學的單室模型中使用預定頻率(2.5 Hz)的單個正弦波，以便測量確定整個呼吸係統[12]的總體阻力(Rrs)和彈性(Ers)。相比之下，寬帶低頻測量是使用覆蓋廣譜(1-20.5 Hz)的互質頻率波進行的。這些測量值用於恒相模型，以解剖出與中央(Rn)和外周氣道(G, H)[12]相關的值。

雖然這項技術可以適用於多種動物模型，但迄今為止，小鼠是哮喘研究中最常用的物種。正如Bates & Irvin[13]所描述的，該技術需要對受試者進行麻醉、氣管切開或口服插管和機械通氣。PFT測量的自動序列可以使用腳本預定義，以重複捕獲呼吸係統阻塞和僵硬度的整體變化和/或中央氣道和外周組織力學之間的劃分。PFTs可以在基線條件下進行，也可以通過一係列乙酰膽堿挑戰來評估測試動物[11]的氣道反應性。

雖然研究人員采用了各種方法在體內模擬支氣管擴張劑化合物的使用，但其給藥方法(皮下灌注、腹腔注射、氣管內灌注)並不總是與臨床給藥支氣管擴張劑的給藥效果一致[14,15]。最近的研究使用了與臨床給藥更一致的給藥技術，使用霧化器、僅鼻吸入或鼻內給藥技術[16- 22]。雖然在上述所有研究中都獲得了信息，但在支氣管收縮事件中，對潛在的新型治療吸入化合物的快速作用、立即緩解快速發作的支氣管保護作用的驗證方法尚未發表。

我們在此描述一種改進的實驗方法，以測試潛在的快速作用的支氣管保護化合物在甲氧膽堿挑戰。我們使用一種常見的哮喘支氣管擴張劑硫酸鹽沙丁胺醇(腎富龍製藥公司)驗證了我們的方法，這是一種快速作用的吸入短效β2激動劑，用於快速逆轉哮喘患者的支氣管收縮。

方法

為了驗證我們的方法，我們使用8-10周齡Balb/C雄性和雌性小鼠的常見過敏氣道模型，用100 μ g屋塵蟎提取物(HDM;在異氟醚麻醉下進行三次鼻內灌注(圖1A)。在最後一次HDM攻毒兩天後，小鼠用濃度為125 mg/ml的無菌dH製備的氨基甲酸乙酯(Sigma, U2500)麻醉₂O，以16 ul/克體重腹腔注射。一旦到達手術麻醉平麵，使用之前描述的方法[11,23]用19號金屬套管對受試者的氣管進行插管。接下來，受試者連接到商用計算機控製活塞呼吸機(flexiVent, SCIREQ Inc.， Montreal, Qc, Canada)進行機械通氣和PFTs[11]。然後將一種麻痹劑泮庫溴銨(0.8 mg/ml鹽水，Sigma P1918)以10 ul/克體重的體積通過腹腔注射給麻醉小鼠，以防止PFTs期間來自受試者的任何幹擾。在默認機械通氣設置下(150次呼吸/分鍾，潮氣量10 ml/kg，呼氣末正壓3 cmH2 O)經過短暫的平衡期後，進行兩次補充操作(充氣至標準壓力30 cmH₂O超過3秒並保持3秒)，以打開封閉的肺區域並標準化肺容積史。

圖1:一)小鼠在第0天、第7天和第14天接受HDM挑戰。第16天，所有HDM挑戰小鼠分為兩組B):對照組(左圖);鹽水霧化組和沙丁胺醇組(右);用硫酸沙丁胺醇霧化(0.083%鹽水)。C)隨後，兩組患者立即接受霧化乙酰膽堿支氣管收縮刺激(10、30、100 mg/ml)，並使用強製振蕩技術記錄肺功能。箭頭表示何時給予生理鹽水或沙丁胺醇和乙酰膽堿。

啟動了一個預定義腳本，用於在支氣管收縮事件中測試快速作用的支氣管保護治療化合物(圖1B)。首先進行兩次深度充氣，然後使用兩個獨立但相同的霧化器頭(Aeroneb實驗室霧化器;細霧模型，與吸氣同步，在50%占空比下工作12秒)。在使用強製振蕩技術進行間隔緊密的自動呼吸力學測量之前，這些模型用於交付兩種不同的試劑(圖1C)。

在人類中，暴露於噴霧器化合物被用來評估氣道高反應性和哮喘。在受試者暴露於支氣管擴張劑、支氣管收縮劑或其他製劑(如過敏原)之前和之後，可以對肺功能進行評估。這使我們能夠確定支氣管阻塞的可逆性或相對氣道高反應性，兩者都可以成為人類氣道疾病的重要標誌。在我們的小鼠模型中，我們使用了類似的方法。沙丁胺醇被用作支氣管擴張劑，以防止暴露於甲膽堿時出現的支氣管收縮。研究化合物可替代支氣管擴張劑或支氣管收縮劑，以評估其調節氣道反應的能力。

在本研究中，所有小鼠隨後接受兩次鹽水刺激，作為兩種噴霧器的對照。然後他們被分為兩個實驗組:對照組(圖1，左圖)和沙丁胺醇治療組(圖1，右圖)，在霧化的甲氧膽堿誘導支氣管收縮刺激之前，他們接受硫酸鹽沙丁胺醇氣溶膠或其載體(生理鹽水)。在第二次氣溶膠挑戰(即生理鹽水或甲氧膽堿)結束15秒後，一個緊密間隔的FOT測量循環開始。單頻(快照- 150;2.5Hz)和寬帶(Quick Prime-3;1-20.5 Hz) FOT測量間隔幾秒交替進行，在大約3分鍾的時間內，每次攝動總共測量12次。隨著甲膽堿濃度(0、10、30、100 mg/ml)的增加，該實驗共重複4次。從開始腳本到結束，機器上整個實驗協議的持續時間大約為每隻老鼠17分鍾(每周期× 4周期4分鍾12秒)。值得注意的是，在每次甲膽堿挑戰之前，受試者接受了新的生理鹽水或硫酸鹽沙丁胺醇氣溶膠挑戰。這樣做是為了確保適當的進入氣道，同時也確保在支氣管收縮加劇期間充分的藥物暴露(圖1C)。 In the present study, the same concentration of Albuterol Sulfate (0.083%) was used throughout the entire protocol, similar to what is done in a clinical setting. It was always administered prior to the methacholine challenge in order to prevent nebulization artifacts and delays on the bronchoconstrictor response. The efficacy of this commonly used asthma drug was assessed by comparing peak responses between subject groups for each respiratory mechanic’s parameter studied.

結果

呼吸係統的阻力(R_rs)反映呼吸頻率下的整體氣流阻力。R_rs由肺的經典單室模型與單頻FOT實驗數據擬合計算而成。它包括傳導和外周氣道、組織和胸壁的作用。在目前的驗證研究中，所有給予沙丁胺醇的小鼠的R顯著降低_rs與對照組在所有methacholine濃度下的值進行比較(圖2A)。

圖2:來自hdm致敏和挑戰小鼠的呼吸力學參數，這些小鼠在每次甲膽堿挑戰前立即給予對照劑(鹽-實線)或沙丁胺醇(0.083%-虛線)。結果以均數±SEM表示，每組n=11-15隻。沙丁胺醇和生理鹽水在各自挑戰條件下的比較顯示了每個參數的統計學意義。* * * p < 0.05, p < 0.01。

呼吸係統彈性(E_rs)量化了潮汐呼吸時整個呼吸係統的整體剛度。用經典的肺單室模型擬合單頻FOT實驗數據，計算了該模型的計算結果。

與對照組小鼠一樣，E_rs通常在支氣管收縮時增加。在我們的實驗條件下，沙丁胺醇處理顯著防止了乙酰膽堿誘導的大腸杆菌增殖_rs(圖2B)。

牛頓阻力(R_n)主要由不參與氣體交換的大傳導氣道的阻力所控製。該參數來自於擬合寬帶FOT測量阻抗數據[10]的恒相位模型[24]。沙丁胺醇治療的小鼠明顯降低R_n10 mg/ml和30 mg/ml乙酰膽堿的劑量高於對照組。在最高的甲膽堿濃度下也有保護的趨勢(p=0.08)(圖2C)。

組織阻尼(G)也是一個恒相模型[24]參數，反映了由於摩擦而在組織內損失的能量量的度量。它與組織阻力密切相關，組織阻力包括周圍氣道的空氣流動阻力。隨著甲膽堿刺激量的增加，對照組小鼠的G參數增加，而在30和100 mg/ml甲膽堿刺激時，沙丁胺醇治療小鼠的G參數明顯變鈍(圖2D)。

組織彈性(H)是組織剛度的一個指標。它是根據恒相模型[24]計算出來的，代表了組織縮回其原始形狀的能力。與對照組相比，沙丁胺醇治療的小鼠H的測量值有所減弱，盡管在研究的任何甲氧膽堿挑戰中，兩個實驗組之間的差異沒有統計學意義(圖2E)。總的來說，我們通過FOT測量的氣道生理學參數的結果與已經發表的沒有藥物幹預的HDM挑戰小鼠的結果相似。

討論

雖然我們認識到，小鼠過敏原挑戰模型經常被用作哮喘研究的工具，但我們承認，人類哮喘的複雜性不太可能在該係統中充分建模。我們的目標是模擬哮喘的一種特定疾病表型，氣道高反應性，並驗證一個係統來測試化合物，以減弱動物模型中的這種反應。正如Kumar和Foster[26]在一篇綜述中詳細討論的那樣，在小鼠哮喘模型中觀察到的幾個因素與人類哮喘症狀非常不同。其中最值得注意的是，與人類哮喘肺相比，過敏小鼠肺中觀察到的血管周圍和水腫性炎症的不同模式，小鼠灌洗液中嗜酸性粒細胞的數量更高(小鼠總細胞的40-80%，而人類哮喘灌洗液中的~1-5%)，觀察到的小氣道關閉獨立於平滑肌收縮[26]。然而，鑒於所有這些差異，人們普遍認為，支氣管收縮者挑戰導致氣道關閉，從而有助於人類哮喘和過敏性氣道疾病[27]小鼠模型的氣道高反應性機製。

由於與哮喘相關的最使人衰弱的表型是喘息和呼吸短促，這兩者都是由支氣管收縮加劇引起的，因此需要快速作用的治療藥物來管理這些哮喘性支氣管痙攣。β-激動劑是最常用的哮喘治療藥物，但對某些哮喘患者的療效較差。隨著哮喘負擔的不斷增加，需要新的和不同的緩解支氣管收縮的靶點，以及在臨床前水平篩選或測試這些靶點的手段。快速作用的藥物，如沙丁胺醇，或新的治療哮喘的方法，以前已經在動物研究中評估過，但至少在小鼠中，這些化合物從未在支氣管收縮事件中使用。我們提供了一種有效的、自動化的體內實驗方法，在這種方法中，潛在的快速作用支氣管保護藥物可以重複測試，以推進新型哮喘療法的發展。

經濟利益的聲明

在研究期間，JM和AR受雇於SCIREQ公司，這是一家涉及與本出版物內容相關的主題領域的商業實體。SCIREQ是emka科技公司

資金

NIH將HL111151和HL125602授予JGL。

作者的貢獻

研究理念與設計:KJA、JM、MOD、JGL;采集、分析解讀:KJA、JM、MOD、AR、JGL;起草稿件:KJA、MOD、JGL;重要技術細節手稿的關鍵修訂:JM, AR。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Addison KJ, Morse J, Robichaud A, Daines MO, Ledford JG(2017)一種新的支氣管擴張劑體內測試係統。J感染Pulm Dis 3(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-3176.120

版權:©2017 Addison KJ，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2016年12月22日

接受日期:2017年1月30日

發表日期:2017年2月3日