摘要

建立了反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析片劑中左旋咪唑和阿苯達唑的方法。該方法簡便、可靠、快速，適用於左旋咪唑和阿苯達唑組合形式的分離和定量測定。在Inertsil C18 (4.6 × 250mm, 5µm)色譜柱上，采用等速洗脫法成功分離。流動相含有0.02M磷酸鹽緩衝液(pH 3.0)和甲醇，比例為30:70v/v。流速監測為1.0 mL / min^－1整個分析、檢測和定量的主要藥物活性成分是通過PDA檢測器在220nm完成的。根據當前ICH指南的特異性、線性、準確性、精密度、堅固性和魯棒性對所提方法進行了驗證。該方法線性響應良好(R2 >0.999)，精密度(回收率97 ~ 103%)，精密度(RS≤1.0%)，靈敏度高，特異性好。預期的反相-液相色譜方法成功地有助於藥物製劑的常規分析。

關鍵字

高效液相色譜法;左旋咪唑;阿苯達唑;方法開發;驗證

縮寫

HPLC:高效液相色譜法;國際協調會議;鋁青銅:阿苯達唑;列弗:左旋咪唑;LOD:檢測限;LOQ:定量限度;Rt:保留時間;RSD:相對標準偏差

圖形抽象

APIs-Active製藥成分;BCSBiopharmaceutical分類係統;慢性阻塞性肺疾病;DNA(脫氧核糖核酸;GI-Gastrointestinal跟蹤;HPH-High壓力均勻化;國際協調會議國際協調會議;LED-Light-Emitting二極管;PS-Particle大小;PSD-Particle大小分布; PGP-P-Glycoprotein; USPUnited States Pharmacopeia

簡介

左旋咪唑是一種抗寄生蟲藥物[1]，廣泛用於治療由病毒性[2]和細菌性[3]引起的感染，最近也報道了用於治療covid-19[4]。它的化學名稱是(6S)-6-苯基- 2h,3H,5H, 6h -咪唑[2,1-b][1,3]噻唑。它由Janssen公司生產，1969年被用作治療蠕蟲感染的藥劑;左旋咪唑在1990年被FDA批準為結腸癌的輔助治療藥物。在此之前，左旋咪唑被用作類風濕性關節炎患者的抗風濕療法[5]。具有免疫調節作用[6-9];該藥物被研究用於治療各種免疫介導的疾病;這種藥物還與其他藥物聯合使用，用於治療各種癌症。左旋咪唑在人類和動物身上都被用作驅蟲藥來治療蠕蟲感染。左旋咪唑作為一種尼古丁受體激動劑，通過持續刺激寄生蟲的肌肉導致其癱瘓。 Levamisole has been used to treat many dermatological conditions, including skin infections, leprosy, warts, lichen planus, and aphthous ulcers. Levamisole drug is official in Indian Pharmacopoeia [10], European Pharmacopoeia [11], British Pharmacopoeia [12], and United States Pharmacopoeia [13].

阿苯達唑，又稱阿苯達唑侖，是一種用於治療各種寄生蟲感染的藥物。它被用來治療賈第蟲病，鞭蟲病，fil，神經囊蟲病，包蟲病，蟯蟲和蛔蟲病。化學上稱為甲基N-[6-(丙基磺酰基)- 1h -1,3-苯二氮唑-2-基]氨基甲酸酯。

阿苯達唑在英國藥典[14]、歐洲藥典[15]和美國藥典[16]中有正式名稱。

阿苯達唑和左旋咪唑聯合用於治療人類蠕蟲感染。阿苯達唑的作用原理是阻止食用的蠕蟲體內的糖分(葡萄糖)，因此它們失去能量而死亡。左旋咪唑通過降低肌肉功能和導致蠕蟲癱瘓來治療蠕蟲感染。左旋咪唑和阿苯達唑的化學結構如圖1所示。

圖1:左旋咪唑和阿苯達唑的化學結構。

據報道，有幾種分析方法可以單獨或在其他藥物中測定ALB或LEV。以往報道的方法采用GC-MS[17,18]、LC-MS[19-24]、UPLC[25,26]和HPLC[27-35]。

材料和方法

化學藥品和試劑

所用試劑均為分析級，所用溶劑均為HPLC級;甲醇(JT燒杯)認證純度為99.9%，購自Avantor性能材料有限責任公司，Radnor, PA, USA。磷酸購自美國馬克隆化學公司。實驗使用優質的室內純淨水(TOC<500ppb, pH約7.0，電導率<1.0µs/ cm，最後暴露於紫外線輻射下，經0.2µm過濾器過濾)。阿苯達唑(100%純)采購自MSN實驗室Pvt Ltd。海得拉巴,印度。左旋咪唑(100%純度)購自陝西漢江藥業集團有限公司。

儀器和軟件

Waters HPLC係統Alliance e2695分離模塊，帶有自動注射器，樣品存儲溫度控製器，Empower 3 Software Build 3471 SPs用於監測信號輸出。特性發布3 DB ID: 2639633283已安裝。色譜柱為Inertsil C18 (250mm × 4.6 mm) 5µm。它是由GL科學公司製造的。本研究采用分析平衡模型CP225D (make: Sartorius)，頂部負載平衡模型GP5202 (make: Sartorius)超聲儀(make: LIFECARE)， pH計(make: ORION 3 STAR)，熱烘箱(make: NEWTRONIC)。

色譜條件

采用LC Inertsil C18色譜柱(250mm × 4.6mm 5µm)，以0.02 m磷酸鹽緩衝液(pH 3.0)和甲醇為流動相，以30:70 (v/v)的比例進行色譜分離。流動相用0.22 μ m過濾，流速為1.0mL.min^－1用等差洗脫法。采用PDA檢測器，進樣量為10μL，進樣波長為220 nm，對主要活性成分進行檢測和定量。

標準製劑

左旋咪唑&阿苯達唑標準原液1000μg。毫升⁻¹)，將LEV、ALB (100mg)溶於流動相，製得100mL溶液。將10.0 mL標準原液上清液移至100mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至一定體積，混合均勻。體係適宜性、結果及評價見表1，標準色譜圖見(圖2)。

圖2:稀釋阿苯達唑和左旋咪唑標準品。

刊物名稱及參考文獻	色譜條件	推理
反相高效液相色譜法同時定量左旋咪唑和阿苯達唑的建立:在[34]測定驗證中的應用	流動相:pH為3.5的緩衝液和乙腈(70:30 v/v) 色譜柱:Inertsil ODS C18 (4.6 × 150 mm, 5µm) 流速:1.0 mL/min 檢測器:224海裏 注入量:20µL 列溫度:25°C	樣品濃度不足，在30 μ g mL和80 μ g mL的LEV+ALB中提取受試者樣品具有挑戰性 左旋咪唑和阿苯達唑的反應太低 活性化合物呈寬峰狀
同時評價鹽酸左旋咪唑和阿苯達唑片劑[37]的穩定性指示方法的開發與驗證	流動相:磷酸鹽緩衝液pH 5.0: 乙腈(30:70 % v/v) 柱:資生堂C18 (250mm × 4.6 mm, 5μm) 流量:1.0毫升/分鍾 檢測器:217海裏 注入量:20µL 列溫度:25°C	樣品濃度不足，在7.5 μ g mL和20 μ g mL LEV+ALB時難以提取受試者樣品 左旋咪唑和阿苯達唑的反應太低
當前的方法 根據ICH指南，開發了一種快速、簡單、特異性、可重複性和魯棒性的反相高效液相色譜法，用於測定散裝和片劑中阿苯達唑和左旋咪唑。使用Inertsil C在5分鍾內檢測到阿苯達唑和左旋咪唑18(4.6 × 250mm, 5µm)柱。采用簡單等容流動相，含0.02M磷酸鹽緩衝液(pH 3.0)和甲醇，比例為30:70(v/v)。流速為1.0 mL min－1，注射體積為10µl。檢測波長為220nm。

表1:已發表LC方法條件的比較。

樣品製備

準確稱量10片，在研缽和研缽中碾碎，然後將相當於100mg阿苯達唑和左旋咪唑(市場配方)的樣品轉移到100mL清潔幹燥的量瓶中，然後加入70mL流動相，混合物超聲20分鍾，間或搖晃。然後冷卻至室溫，用流動相稀釋至體積，得到濃度為1000µg/ mL，用於進一步分析。從原液中提取10mL上清，轉移到100mL容量瓶中，用流動相充分混合稀釋至體積。

結果與討論

方法開發策略與優化

對之前的文獻進行評估，總結報告，並在表2中進行討論。目的為該多組分藥物合劑的常規質量控製分析提供一種適用的方法。液相色譜法與二極管陣列檢測法相結合。開發的過程經過精心設計和優化，以分離引用的化合物。LC方法開發中最關鍵的方麵是在合理的分析時間內獲得充分的分析物分辨率和良好的峰對稱性。為了得到更好的結果，進行了許多實驗來優化固定相和流動相。在這些試驗中，評價是基於兩個分析物峰之間的有效分辨率。為優化固定相，采用Thermo Hypersil BDS C8 (4.6 × 150mm)、durashill -C18 (4.6 × 250mm)、Venusil XBP CN (4.6 × 250mm)、Inertsil C18 (250mm × 4.6mm) 5µm等不同類型色譜柱進行整體測試。使用Inertsil C18 (250mm × 4.6mm) 5µm柱在較短的運行時間內獲得了最理想的兩種初級化合物之間的清晰分離;因此，它成為這種混合物的首選色譜柱。 Other columns exhibited poor separation between the peaks of the target compounds. Some other trials revealed insufficient resolution between ALB and LEV. The excessive tailing for the peaks was another disadvantage of using the Thermo Hypersil BDS, Durashell-C18, and Venusil XBP CN columns.

複合	USP尾礦	RT	USP板數	決議	%相對標準偏差
阿苯達唑	1.13	2.34	5643	NA	0.8
左旋咪唑	1.22	3.16	7564	3．5	0．5

表2:係統適用性評估。
RT-Retention時間;RSD-Relative標準差

對多波長範圍進行評估，以測量每種分析物在其最大波長下的靈敏度。ALB和LEV在220nm處具有較強的紫外吸收峰。

通過改變流速(0.5 mL/min ~ 1.0 mL/min)和柱溫(25℃~ 40℃)對洗脫峰進行進一步優化，得到最佳分離效果。

測定左旋咪唑和阿苯達唑在不同流動相、溶劑-緩衝比下的含量，並提出最終色譜條件。以0.02M磷酸鹽緩衝液(pH 3.0)和甲醇為流動相(30:70v/v)，左旋咪唑和阿苯達唑的峰形、對稱性和分辨率均較好。等距洗脫，流速1.0mL/min，樣品和柱溫度保持在25℃。該方法成功地用於左旋咪唑和阿苯達唑的塊狀和片劑用量的測定。

方法驗證

分析方法驗證對於確保特定試驗所采用的分析方法適用於其預期的方法是至關重要的。方法開發完成後，分析技術在常規使用之前進行驗證。在現代方法開發過程中評估的參數包括特異性、線性、範圍、準確性、魯棒性和精度。

基於國際協調會議(ICH) Q2 (R1)指南[36,37]對提出的方法進行了驗證。

特異性

方法驗證的一個必要的強製性ICH準則是特異性或選擇性。換句話說，特異性是在共洗脫或共遷移雜質存在的情況下評估分析物純度的能力。在分析樣品色譜圖中，沒有賦形劑幹擾兩種藥物的保留時間，說明了方法的特異性。

方法精度

在方法精密度方麵，對單個批次的均質試驗進行了6次分析。結果決定一個方法是否在單個批處理中產生一致的結果。計算平均結果(X)、標準差(SD)和相對標準差百分比(%RSD)。結果表明，該方法精度較高，RSD值法精密度低於1.0。彙總結果如表3所示。

參數	阿苯達唑	左旋咪唑
線性
範圍(µg毫升－1）	10 - 150	10 - 150
坡	10956.22	9380.96
攔截	6173.49	4452.59
相關係數	0.999	0.999
冥河SD	9679.18	6666.72
LOD(µg / mL－1）	4.2	3.8
定量限(µg / mL－1）	14.3	16.5
精度(一)複蘇(%)
50%平均值±SD	100.3±0.38	99.5±1.15
100%平均值±SD	100.4±0.15	100.1±0.21
150%平均值±標準差	101.0±0.61	99.8±0.67
精度(b)(%相對標準偏差)
可重複性	0.9	0．5
中間精密度	1．1	1
95%置信區間	99.825, 100.775	100.540, 101.460

表3:方法驗證的結果。
^(一)每種濃度水平三次測定的平均值。
^(b)每種成分六次測定的RSD %。

LOD(檢測限度)和LOQ(定量限度)

LOQ和LOD是用分析響應3×10乘以背景噪聲時的信噪比計算的。方法驗證結果如表3所示。

LOD (mg/L) =3 ×Noise/信號×線性樣品的最低濃度

LOD (mg/L) =10 ×Noise/信號×線性樣品的最低濃度

線性

一種測定方法可以得到與樣品中分析物濃度成正比的檢測結果。該參數的確定將確定分析分析的範圍。通過繪製標定曲線確定了方法的線性度。采用標準原液連續稀釋製備的不同濃度水平(10%-150%)的左旋咪唑和阿苯達唑標準溶液。彙總結果如表3所示，線性曲線如圖3所示。

圖3:稀釋阿苯達唑和左旋咪唑標準品。

精度

分析方法的準確性是該過程所得到的測試結果與實際值的接近程度。通過檢測已知添加的分析物量，準確度通常可以表示為回收率的百分比。準確度是對分析方法準確度的測量。

在此HPLC方法中，用三個濃度水平(50%，100%和150%)驗證樣品的回收率。用API +安慰劑進行恢複，並注射到高效液相色譜中(3個重複)。彙總結果見表3。

魯棒性

為了證明該方法的魯棒性，對色譜條件和係統適宜性參數進行了更改，如尾砂因子(<2.0)、理論板數(>3000)和在最接近的峰(>2.0)之間的分辨率。結果表明，優化方法在變化條件下具有較好的魯棒性。彙總結果見表4。

參數	阿苯達唑			Levamesole			解決b / w鋁青銅 &列弗
	保留時間	USP尾礦	USP板數	保留時間	USP尾礦	USP板數
正常的	2．3	1．2	5512	3.2	1．1	7423	3.4
低流(0.8毫升/分鍾)	2.6	1．1	5342	3．5	1．2	7564	3.6
高流量(1.2 mL/min)	2.05	1	5453	2.95	1.3	7012	2.9
高溫(30ºC)	2．2	1．2	5544	3．1	1．2	7715	3．1
高有機(105%)甲醇	1.98	1．1	5098	2.89	1．1	7432	2.8
低有機(95%甲醇)	2.7	1	5231	3．7	1	7654	3．7

表4:魯棒性評估。

過濾器驗證和溶液穩定性

采用兩種不同類型的0.45μm過濾器(尼龍和PVDF)來測定過濾器對樣品的影響。計算兩種過濾樣品的濃度，並與離心樣品進行比較，結果沒有差異。樣品溶液在實驗台上穩定達24小時。

結論

根據ICH指南，建立了一種快速、簡單、可重複性和魯棒性的反相高效液相色譜法，用於測定阿苯達唑和左旋咪唑的散裝和片劑。該方法提供了選擇性定量的ALB+LEV混合物，沒有空白和安慰劑的幹擾。該方法易於應用於日常質量控製分析。

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文章類型:研究文章

引用:Ettaboina SK, Nakkala K(2021)反相高效液相色譜法同時測定散裝劑型和片劑劑型中左旋咪唑和阿苯達唑的新分析方法的開發和驗證。J pharmaceutical Anal Insights 3(1): dx.doi.org/10.16966/2471-8122.117

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出版的曆史:

收到日期:2021年7月18日

接受日期:2021年8月20日,

發表日期:08年9月,2021年