摘要

采用設計質量法(QbD)成功地建立了測定原料藥和製劑中頭孢地托寧酯(CTP)的高效液相色譜穩定性指示方法。在酸性、堿性、熱、氧化和光溶脅迫條件下進行了強製降解研究。色譜分離在不到10分鍾內完成;具有藥物和9種降解產物的基線分離;采用RP C-18色譜柱，流動相:甲醇:醋酸酯緩衝液0.035M, pH 4.5=55:45 v/v，流速1.5 mL·min^－1在225 nm處進行紫外檢測。方法的專屬性、線性度、精密度、準確性和魯棒性均得到驗證，CTP響應在90 ~ 670 μg.mL範圍內呈線性關係(r=0.9999)^－1檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為5.31 μg·mL^－1和16.1µg·毫升^－1,分別。日內和日間精密度分別為0.11%、0.44%。該方法成功地應用於散粉和片劑中CTP的測定。結果表明，該方法對CTP的質量控製和穩定性研究具有重要的應用價值。

關鍵字

實驗設計;AQbD;高效液相色譜法;Cefditoren pivoxil;穩定性指示

簡介

頭孢地托寧酯是第三代半合成口服頭孢菌素類抗生素。CTP是治療呼吸道感染的廣譜抗生素[1]。在化學上，頭孢地托酚酯(圖1)是(-)-(6R,7R)-2,2-二甲基丙-酰基氧基甲基7-[(Z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-2甲氧基亞氨基乙酰氨基]-3-[(Z)-2-(4-甲基噻唑-5-基)乙烯基]-8-氧基-5-噻唑-1-氮雜比環[4.2.0]辛-2-烯-2羧酸酯。

圖1:頭孢地托寧酯(CTP)的化學結構

文獻包括各種測定血漿中CTP的方法[2-4]或各種分光光度法測定藥物劑型中的CTP[5-7]。同時報道了不同穩定性指示的HPLC[8- 10]、UPLC[11]和HPTLC[12]方法。雖然已有的穩定性指示方法研究了CTP在不同應力條件下的水解，但沒有一種方法能在短時間內將CTP與所有降解產物同時分離;可能是由於CTP在不同條件下水解產生的複雜基質。開發一種能夠在存在不同應力條件下產生的各種降解產物的情況下分離CTP的方法的主要好處是挑戰該方法在極端條件下進行可接受的定量結果。傳統的高效液相色譜(HPLC)方法是通過試錯或每次改變一個因素(OFAT)，而保持其他因素不變，需要大量的實驗來確定最佳條件，盡管它們沒有考慮因素之間的相互作用。

設計質量(QbD)是過程開發的一種係統方法，以預定義的目標為起點，強調產品、過程理解和過程控製，基於健全的科學和質量風險管理[13]。設計質量原則已被應用於分析方法的發展，並被稱為“分析QbD”(AQbD)[14-19]。AQbD循環有不同的階段，即定義分析目標剖麵、關鍵質量屬性、進行風險評估、利用實驗設計(DOE)優化和開發方法、建立方法設計空間、定義控製策略。AQbD的結果是一個很好理解的、適合目的的、健壯的方法，除了直接的方法轉移和方法故障排除之外，它始終交付預期的性能。AQbD方法在分析方法開發中的應用有助於建立方法的質量，而不僅僅是在開發的方法中測試它，沒有任何事先的計劃。開發過程中的廣泛知識有助於建立一個設計空間[20]，提供合適的方法性能，此外還建立了有價值的方法控製，如係統適用性測試，可以幫助識別方法性能的失敗模式，並防止產生如Gavin和Olsen[21]所指出的錯誤結果。

本文旨在建立一種在單次短時間內測定CTP在酸、堿、熱、氧化和光解等9種條件下的穩定性指示高效液相色譜方法，可用於CTP在日常質量控製和穩定性評估工作中的應用。

材料和方法

儀器

安捷倫1200高效液相色譜係統(安捷倫技術，美國)配備第四泵(安捷倫LC 1200，型號G1311A);紫外可變波長檢測器(安捷倫LC 1200，型號G1314B);自動進樣器(安捷倫LC 1200，型號G1329A);Eclipse plus®RP C18色譜柱100 × 4.6 mm, 3.5 μ m粒徑(Agilent, USA);過濾脫氣(0.45 μm尼龍微孔膜過濾器);紫外檢測在225 nm。樣品經0.45 μm尼龍膜過濾器過濾;分析天平:XA205DU (Mettler Toledo，瑞士);超聲波水浴:FB15054型(Fisher Scientific, USA);Chemstation®軟件包用於LC係統:Rev B.03.01。 Mathematical and statistical manipulations involved in QbD approach were performed using Design expert® software package Version 7.0.0 (Stat-Ease Inc).

材料

化學藥品和試劑:所有使用的試劑均為分析級，溶劑為HPLC梯度級:甲醇(美國新澤西州Labscan分析科學公司);氯化鈉;醋酸鈉;鹽酸;氫氧化鈉(E. Merck, Darmstadt, Germany);純化水。

純粹的標準:Cefditoren pivoxil工作標準(99.69%)由Orchid製藥公司(印度)提供。

製藥配方:一種藥物配方由交叉氨基葡糖糖，甘露醇，硬脂酸鎂，casienate鈉，三聚磷酸鈉，除頭孢地托林酯。

實驗

色譜條件

用Eclipse plus進行色譜分離^®RP C-18色譜柱(100 mm l × 4.6 mm i.d, 3.5µm)，流動相為醋酸酯緩衝液0.035M, pH4.5/甲醇(45:55 v/v)。流動相和樣品通過0.45 m Millipore過濾^®膜過濾器(Billerica, MA)脫氣5分鍾，檢測波長為225 nm。係統運行溫度為40℃，流速為1.5 mL·min^－1．

標準溶液

CTP原液:4.4 mg·mL^－1在溶劑混合物(鹽酸/氯化鉀緩衝溶液(pH 1.2)/甲醇，1:1 v/v)中，CTP工作溶液:0.44 mg·mL^－1在溶劑混合物。

藥物配方測定

將10片磨成細粉，取CTP 44 mg的粉末裝入100.0 mL容瓶中，溶於混合溶劑中，進行色譜。

退化的解決方案

從原液中提取10毫升4.4 mg·mL^－1用0.001M氫氧化鈉溶液/甲醇(堿性脅迫條件)、0.1M鹽酸/甲醇(酸性脅迫條件)、1%過氧化氫/甲醇、純淨水/甲醇(熱分解)稀釋至50 mL，然後在60°C回流30 min。在光解的水解;用純淨水將原液中的10.0 mL稀釋為50 mL，然後在陽光直射下照射6小時。從這些溶液中取出5毫升轉移到100.0 mL容量瓶中，然後用溶劑混合物完成。

CTP線性度評估的解決方案

原液標準溶液(4.4 mg·mL^－1)與溶劑混合物進一步稀釋，得到(90-670µg mL)的7個溶液^－1)．注射前用流動相平衡柱，每個溶液在重複堿基上10.0µL注射色譜。將積分峰麵積與相應濃度進行繪製，得到CTP的校正圖和回歸方程。

CTP回收率評估方案

采用上述色譜條件，分別對標品濃度的50%、100%、150%添加安慰劑的標準溶液進行色譜。

結果與討論

CTP作為一種頭孢菌素，在不同的條件下容易降解，產生9種不同的降解產物。采用傳統的高效液相色譜法解決如此複雜的混合物並非易事，因此，設計質量法的應用開始了。根據Kumar K等人推薦的方法，CTP強製降解溶液在溫和條件下製備，降解率為1-30%。CTP在堿降解和氧化降解條件下的降解率分別為27%、28%，而在光解降解條件下的降解率為11%。與Gawande等相比，[23]的酸降解率較小，約為2.0%，而熱降解率分別為2.5%。將前麵提到的降解溶液混合在一起，以製備一種具有挑戰性的降解溶液，其中包含在產品貨架期內可能產生的各種降解產物。在溶液穩定性方麵，由pH為1.2:甲醇的HCl/NaCl緩衝溶液組成的溶劑混合物，發現1:1 v/v可為CTP在室溫下10小時內損失0.32%的溶液提供優越的穩定性。另一方麵，使用水:甲醇作為溶劑，在溶液中穩定性較低，5小時內觀察到2%的損失。

首先，係統地闡述了分析目標圖譜“開發和驗證了在酸、堿、氧化、熱和光降解產物存在下定量測定CTP的穩定性指示高效液相色譜方法”。接下來，獲取方法參數、關鍵質量屬性(cqa)—應該在適當的限製、範圍或分布內的屬性，以確保所需的方法質量[20]。采用失效模式與影響分析(FMEA)作為風險評估工具，對cqa的方法參數進行風險評估。FMEA顯示流動相甲醇百分比(MeOH%)和洗脫溫度(T)的風險等級較高，緩衝液pH對cqa的風險等級相對較低;而檢測波長和柱型等因素的風險等級較小。風險等級較小的因素(色譜柱類型、有機修飾劑類型、流速、波長)根據初步試驗確定值;緩衝液pH值采用單變量模式進行研究;采用多變量實驗設計(DOE)對MeOH%和T作為主要危險因素進行了廣泛研究，並建立了cqa模型。

係統適宜性溶液在200-400 nm掃描;其中λ=225 nm的靈敏度和精度最好。但甲醇作為有機改性劑增加了運行時間，甲醇/RP-C18色譜柱在選擇性和溶峰數量上優於乙腈/RP-C18、乙腈/RP-C8色譜柱甚至甲醇/RP-C8色譜柱。由於色譜運行時間是質量控製中釋放測試的關鍵問題，RP-C18色譜柱較短，粒徑較小(Eclipse plus^®C18 100 × 4.6 mm 3.5 μ m)，流速1.5 mL.min^－1采用該方法，取得了較好的效果。

采用雙因子中心複合設計(CCD)進行了18次實驗，研究了MeOH%和T在每個CQA上相互作用的響應麵(非對稱性、理論板、分辨率、最後洗脫峰保留時間作為運行時間的指示)。CCD提供了許多理想的特性;它們是估計響應曲率的有效設計，提供多項式係數的正交估計，並允許以逐步的方式進行實驗，而不是一次執行整個設計。對於不同構建的模型，不同模型的相交麵積定義了滿足所有cqa預定義值的溫度和流動相甲醇百分比的設計空間(DS)組合。

CQA	預定義的限製(s)
峰值不對稱一個	0.9到1.0
理論塔板數一個	壯年的4000
Pre-resolutionb	壯年的4
Post-resolutionc	壯年的4
LEP保留時間[min]d	NMT 10(最小化)

表1:關鍵質量屬性(cqa)和CTP的相關預定義限製
^一個相對於CTP的值。
^bCTP峰值相對於前一個峰值。
^cCTP峰值相對於下一個峰值。
^d最後洗脫峰。

除了定義滿足所有cqa預定義限製的設計空間(DS)外，還使用設計專家7.0.0軟件包進行數學、統計計算和預測。通過對實驗數據的分析，我們構建了非對稱性、理論板數、最後洗脫峰的分辨率和保留時間與MeOH%和t的函數關係的響應麵(圖2)展示了結果的響應麵，而表2展示了所構建模型的統計摘要。值得一提的是，在建模前將理論板數(N)轉化為倒數[1/N]，以便模型的階數最小，殘差分布更隨機，模型擬合效果更好。此外，為了驗證模型的可接受預測，在設計空間的中間點進行高效液相色譜係統，然後將實際得到的CQA與預測值進行比較，其中大多數實際得到的值在預測值的90-106%以內。最後，根據CTP理論板數最大化和運行時間最小化的要求，對cqa進行優先排序，確定54-56.5甲醇%和34-40°C之間的區域作為控製空間——溫度和流動相甲醇百分比的組合，滿足色譜過程中板數最大、運行時間最短的條件。此外，正常操作參數(NOP)“55甲醇%和40°C”被確定為控製空間內的最大可取點。圖3a，響應麵疊加圖顯示的是白色的DS，包括控製空間和NOP，而圖3b顯示的是應用於DS的期望函數等高線圖，其中紅色區域表示控製空間的最大期望麵積，藍色區域為零期望麵積。

圖2:(a) CTP不對稱;(b)倒數CTP理論板數(N);(c) CTP前分辨率，(d) CTP後分辨率;(e)最後峰值保留時間“作為流動相甲醇%和洗脫溫度(°C)的函數

圖3:顯示故障空間“灰色區域”、設計空間“白色區域”、控製空間“虛線區域”和交叉點正常運行參數的所有響應麵疊加圖
圖3 b:設計空間的二維願望圖

CQA	模型類型	平方	調整後的平方
不對稱	線性	0.931	0.893
1 /板。	2 fi一個	0.941	0.927
Pre-Res	二次	0.963	0.951
Post-Res	二次	0.993	0.991
最後峰值保留時間	二次	0.985	0.978
一個兩個因素的相互作用。

表2:模型統計摘要
a雙因素相互作用

在單變量模式下，研究了不同緩衝對流動相的影響。磷酸鹽緩衝液pH 2.5, 3.5, 6.5;使用pH 4.5、5.5的醋酸酯緩衝液。圖(4a-d)顯示了緩衝液pH值對CTP不對稱性的影響(A_年代)，理論板數(N)，分辨率(pre-R_年代& post-R_年代)和最後洗脫峰的保留時間。對數據的檢查得出結論，選擇pH值為4.5的醋酸鈉/乙酸緩衝液，因為它能提供優越的cqa響應結果。此外，該方法在pH值為4.5時緩衝容量大，有利於在進行生物棄權研究時忽略樣品溶劑pH值的影響，為該方法提供了廣泛的應用範圍。最後，表3總結了正常的操作參數，圖5為NOP的典型色譜圖，說明了CTP在不到10分鍾的時間內從9種降解產物中分離出來。

圖4:流動相緩衝液pH對CTP與前一個或下一個洗脫峰之間分辨率的影響
圖4 b:流動相緩衝液pH對CTP峰不對稱性的影響
圖4 c:流動相緩衝液pH對最後洗脫峰保留時間的影響
圖4 d:流動相緩衝液pH值對CTP峰值理論板數的影響

圖5:在NOP顯示係統適用性的色譜圖

參數	價值
流動相	醋酸酯緩衝液0.035M, pH 4.5:甲醇= 45:55
流量(毫升/分鍾)	1．5
溫度(°C)	40
注入體積(µL)	10
波長(nm)	225

表3:正常運行參數(NOP)

方法驗證

特異性:用強製降解產物加標溶液對標準溶液進行色譜分析;CTP峰與降解產物完全分離。此外，安慰劑溶液色譜圖顯示CTP與輔料之間無幹擾。表4所示的CTP和降解產物之間的色譜選擇性因子和色譜分辨率表明方法具有足夠的特異性。

參數	DP 1	DP2	DP 3		DP 4		DP 5		CTP		DP 6		DP 7		DP 8		DP 9	參考價值
分辨率(R）	1.95	5.3		2.7		3.16		5.56		6.21		1．1		2.25		8.44		R> 1.5
選擇性因子(α）	1.14	1.48		1.16		1.19		1.32		1.36		1.05		1.11		1.49		> 1
不對稱係數(T)	0.95																	0.9 - -1.1
容量係數(K）	2.82																	1 - 10
柱效率(N）	6700																	> 4000

表4:所提HPLC方法的係統適宜性參數的結果
*降解產物(DP#)根據洗脫順序編號

線性:在正常操作參數下，通過繪製CTP的綜合峰麵積與藥物濃度的線性關係。相應的濃度範圍、回歸方程及其他統計參數見表5。

方法參數	高效液相色譜法
波長	225海裏
線性範圍	90 - 670µg.mL－1
回歸方程(A=bC + A)一個
攔截(a)	30.2
斜率(b)	13.1
相關係數(r)	0.9999
精度
意思是南達科他州±	100.4%±0.28%
50％	100.50%
100％	100.64%
150％	100.06%
特異性和選擇性	該方法對降解產物具有良好的藥物分辨能力
精度
(盤中%相對標準偏差)b	0.11%
(Interday %相對標準偏差)>c	0.44%
t (2.228)d	0.62
魯棒性	方法對甲醇含量和洗脫溫度的變化具有較好的魯棒性，平均回收率在100.3 ~ 101.4%之間
LOD(µg / mL)	5.31
定量限(µg / mL)	16.1

表5:該方法測定CTP的分析參數及驗證結果
^一個A為峰麵積，C為濃度。
^b日內精度(在100%濃度/2重複下的6種不同測定(n=6))
^c日間精密度(6種不同的測定方法，濃度為100% /2重複(n=6))。
^dt表自由度=10，雙側檢驗α=0.05。

準確性:通過對三種CTP濃度水平(50、100和150%)下的安慰劑加標CTP標準的分析來表明該方法的準確性，在重複注射9種製劑的基礎上，計算了所有濃度水平的平均回收率，以及總平均值和標準偏差，並在表5中總結。采用Hypersil BDS®C18 (4.6 × 250 mm)， 5µm粒徑柱，水:乙腈(50:50 v/v)為流動相，流速為1.2 mL min，與m . Mathrusri Annapurna等穩定性指示法[24]作對照^－1在218 nm處進行紫外檢測。兩種方法比較差異不顯著表6。

項	Cefditoren pivoxil
	該方法	報道的方法一個
均值±St.dev	99.89±0.69	99.92±0.60
n	7	7
方差	0.48	0.36
F -值(4.28)b	０．７５
學生的學習任務(2.45)b	0.09

表6:純粉末狀CTP測定方法與報道方法的統計比較
^一個報道方法:HPLC法，采用Hypersil™BDS C18 (4.6 × 250 mm) 5µm色譜柱，水-乙腈(50:50 v/v)為流動相，流速為1.2 ml min-1，在218 nm[24]處進行紫外檢測。
^b括號內的數字是α=0.05時的相應表格值

精密度:精密度通過在重複基礎上計算日間精密度來評估，計算六種不同標準溶液在相當於設計標準濃度100%的濃度水平下的回收率。0.11%的相對標準偏差(RSD)表明所提方法的日內精度可以接受。將其他6種不同標準溶液在重複堿基上進行一天的日間精密度分析，RSD為0.44%，也表明日間精密度較好，結果見表5。

魯棒性:考慮影響色譜過程的最關鍵參數，即方法魯棒性;洗脫溫度和流動相甲醇百分比。流動相甲醇含量百分比分別為53%、55%和57%。相對於最佳甲醇回收率(55%)，CTP回收率分別為101.1,101.3和101.4%。在不同柱溫(38、40和42℃)下對標準溶液進行層析，對於CTP響應，相對於最佳柱溫(40℃)的回收率分別為100.3、100.5和101.1%。

檢測限(LOD)和定量限(LOQ): 7個標準製劑(90µg·mL)^－1-670µg·毫升^－1)，用對應的峰麵積-濃度關係估計回歸方程，分別計算LOD和LOQ(分別為3.3和10.0乘以回歸線標準差除以回歸線斜率)為5.31µg·mL^－1和16.10µg·毫升^－1,分別。

結論

QbD開發方法引入了對影響色譜分離的方法參數的機械理解，此外，還引入了對方法能力的最大魯棒性和提供預期性能的高置信度。在方法開發過程中創建設計空間，實現了方法轉移和應用的靈活性。並為故障排除方法的性能提供指導。該方法成功建立了良好的頭孢地托寧旋軸酯和9個降解產物之間的分辨率，遠高於基線分離，運行時間小於10分鍾。驗證結果表明，該方法具有較高的特異性、準確性和精密度。

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文章類型:研究文章

引用:Gad M, Zaazaa HE, Amer SM, Korany MA(2017)建立頭孢地托寧透視安定性指示方法的設計質量法。J pharmaceutical Anal Insights 2(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2471-8122.112

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出版的曆史:

收到日期:2017年1月31日

接受日期:2017年7月14日

發表日期:2017年7月19日