摘要

在證明瘦素溶解在合適的載體中，並口服給小型齧齒動物和大型哺乳動物，可迅速達到血液循環，並作用於目標下丘腦和棕色脂肪組織，以減少食物攝入和控製體重後，我們評估了我們的方案，以提高治療效率。我們發現，抗蛋白酶和膽鹽的存在在車輛是必要的。緩衝液的pH值應保持在堿性側，以中和胃液中的蛋白酶。在載體中添加氨基酸，可以長時間維持高水平的瘦素循環;這可能沒有好處，因此被丟棄了。事實上，它可能會阻止長時間的進食，引發瘦素抵抗。在幾個腸段中，回腸被發現更有效地內化瘦素。最後，比較口服瘦素與腹膜內或皮下注射的效果，表明口服途徑顯示出更高的效率。這可能是由於當通過腸道細胞時，口服瘦素獲得它的伴侶，與它的可溶性受體形成複合物。瘦素-瘦素受體複合物構成正常的循環激素。 Thus oral leptin administered in an optimal vehicle presents great potential for the control of food intake and the maintenance of optimal body weight.

關鍵字

瘦素口服;胃瘦素;口服給藥效率

簡介

我們對瘦素分泌的研究表明，這種激素實際上是由幾個器官分泌的;主要是白色脂肪組織和胃黏膜[1]。通過免疫細胞化學，我們確定胃主細胞是胃瘦素[2]的主要來源。瘦素分泌模式的主要差異將胃粘膜與脂肪組織區分開來。事實上，雖然白色脂肪細胞通過瘦素的內分泌分泌進行活動[1,3]，但胃粘膜釋放瘦素是通過調節分泌的外分泌方式進行的[1,2]。這意味著白色脂肪細胞在不需要觸發的情況下持續釋放瘦素，而胃瘦素隻有在受到刺激時才會短暫釋放，並與胃液[1]一起分泌到胃腔中。我們在組織培養中發現，脂肪細胞的瘦素分泌可以增加，但隻有在持續刺激一小時後，瘦素分泌才顯著增加[1,3]。另一方麵，胃瘦素在刺激[1]後立即釋放。瘦素的兩種來源之間的分泌模式的差異是非常重要的，與它的功能活動有關。脂肪組織分泌的瘦素通過血流運輸，通過飽和轉運體穿過血腦屏障[4,5]，到達其主要靶點下丘腦細胞，特別是弓狀核內的下丘腦細胞。 This nucleus contains two populations of neurons expressing leptin receptors with an overall effect on increasing energy expenditure, on activation of the sympathetic nervous system and on the feeling of satiety [6-8]. On the other hand, significant but short lasting release of leptin by the gastric mucosa occurs upon food intake. From the gastric juice, leptin is channeled to the duodenal lumen and crosses the intestinal barrier to reach blood circulation [9]. Upon reaching its hypothalamic target cells it triggers the feeling of satiety thus regulating on a short-term food intake [1,9]. Furthermore gastric leptin through paracrine action controls nutrients absorption and enterocyte metabolism [1]. It activates several intracellular pathways in intestinal cells. It acts on gastric and intestinal epithelial cells potentiating the effect of cholecystokinin, slowing gastric emptying and promoting gastric distension [10,11]. It stimulates production and release of Glucagon-like peptides 1 and 2 (GLP1 & GLP2) that inhibits gastric emptying [12,13]. As we all well know, the feeling of satiety is of short-lasting and is reactivated as soon as gastric leptin secretion is again stimulated through new food intake. Thus, there are two major sources of leptin: a constitutive one arising from adipose tissue which acts on basal and steady state conditions and a gastric one which is of a more narrow acting, targeting intestinal absorption of nutrients, feeling of satiety and overall food intake.

我們的細胞生物學研究表明，脂肪組織和胃粘膜中的瘦素通過相應細胞的RER-GolgiGranule分泌通路分泌;一種是本構過程，另一種是調節過程[1,2,14]。事實上，胃外分泌的瘦素，一種非常小的肽，加入胃液引起了嚴重的關注。事實上，我們已經證明自由瘦素不能抵抗胃液的惡劣條件，並立即被降解[1,15]。因此，為了讓這種外分泌的激素進入循環，大自然提供了一種保護伴侶，防止早期降解。該伴侶蛋白被發現是瘦素受體的可溶性亞型[1,15]。這種可溶性受體由與瘦素相同的胃主細胞合成，遵循相同的rer -高爾基顆粒分泌途徑，並在釋放[15]前與瘦素在高爾基體和顆粒水平結合。進一步，我們發現脂肪組織分泌的瘦素也與同樣的保護性瘦素可溶性受體結合[1,14]。事實上，我們已經證明，所有循環中的瘦素分子都與其受體[1]的可溶性亞型結合。與這種可溶性受體的結合不僅提供了防止早期降解的保護，而且還使[1]在循環中的半衰期長得多。 We have previously emphasized that the circulating hormone is not free leptin but rather the complex leptin-leptin receptor [1,15,16].

至於外分泌的胃瘦素，除了在胃液中存活外，它還必須到達血液循環。我們已經證明，在開始進食或CCK刺激5分鍾後，循環中的瘦素水平顯著上升[1,9,16]。這種升高不能歸因於脂肪組織通過緩慢的本構分泌來處理瘦素;相反，這是由於胃分泌通過活躍的跨細胞途徑[9]通過腸壁進行非常有效的運輸。事實上，一旦與腸細胞頂端刷狀邊界膜上的瘦素膜受體結合，胃瘦素就會通過包被網格蛋白的囊泡進入高爾基體。它與可溶性瘦素受體結合，再次形成瘦素-瘦素受體複合體，然後轉移到基底外側膜，在腸粘膜間質空間釋放[1,9,16]。瘦素通過毛細血管內皮壁到達血液循環，被運送到目標細胞。

瘦素通常存在於胃腔內，由胃液運輸到十二指腸，並通過腸壁轉移到循環係統，這一事實引發了口服外源性瘦素也可以到達血液循環，作用於下丘腦細胞，以控製食物攝入的建議。一旦到達胃液，口服瘦素應該遵循非常有效的生理途徑從胃腔到毛細血管。一旦進入循環，外源性口服瘦素就會到達下丘腦靶細胞，引發飽腹感。這種方法似乎是治療瘦素水平低的患者的一種強有力的途徑，如脂肪組織疾病(脂肪營養不良)、飲食障礙和某些肥胖情況。此前曾對肥胖患者注射瘦素進行過試驗，但結果令人失望[17-20]。在這些初步研究中，瘦素的注射量相當顯著，影響相對較低，成本效率比高。我們認為，主要問題是他們注射的是自由瘦素，而不是瘦素-瘦素受體複合物。循環中的自由瘦素半衰期很短，對下丘腦靶細胞作用差。口服給藥瘦素繞過了這個限製，因為正如我們在體外而且已在實驗中，瘦素在釋放進入循環之前通過十二指腸上皮細胞，與可溶性瘦素受體形成複合物形式[1,9,15,16]。

我們對這一假設進行了驗證，並給正常和肥胖動物口服遊離瘦素[21-23]。由於大量的口服瘦素確實在[21]給藥後的五分鍾內進入循環，因此獲得的結果相當驚人。這種外源性瘦素能夠控製食物攝入，並誘導小鼠體重大幅度下降。實驗分別在正常小鼠、瘦素缺乏的ob/ob肥胖小鼠[24,25]和瘦素受體缺乏的db/db肥胖小鼠[24,25]上進行。用重組瘦素強製喂養正常小鼠，早在給藥後5分鍾，循環瘦素就增加了。此後，60分鍾後水平下降，達到基礎值。給小鼠口服瘦素後，它們的食物攝入量顯著減少。連續注射幾天後，接著降低動物體重[21]。口服瘦素對ob/ob瘦素缺乏肥胖小鼠的影響更顯著，食物攝入量減少約60%，體重減少約1g /天[21];口服瘦素的效果與[21]的濃度成正比。 This indicates that oral administrated free leptin joins the gastric juice, is vehiculated towards the intestinal lumen and crosses efficiently the intestinal wall getting complexed to its receptor before reaching blood circulation and its target hypothalamic cells. Interesting results were obtained when oral leptin was administered to leptin receptor-deficient db/db mice [21]. These obese animals normally display high levels of circulating leptin but lack the corresponding membrane-bound leptin receptors [25]. When db/db obese animals were given oral leptin, the exogenous leptin reached blood circulation but was unable to induce changes neither in the amounts of food intake, nor in their daily increase in body weight [21].

這些結果表明，口服給藥的瘦素能夠到達胃液，被載至腸腔，穿過腸壁與可溶性瘦素受體結合，從而在被轉移到循環和到達下丘腦靶細胞之前，形成高效的瘦素-瘦素受體複合物。在正常動物和ob/ob動物中，這種口服瘦素觸發其調節食物攝入的激素反應[21]。結果還表明，瘦素(內源性或口服)要觸發反應，完整的瘦素受體係統必須在靶細胞質膜[21]上。

在這些研究的基礎上，我們評估了長期口服瘦素對小鼠[21]的影響。每天給正常和肥胖瘦素缺乏的ob/ob小鼠口服瘦素30天，導致它們的食物攝入量減少和體重穩定。經瘦素處理的動物胃、腸黏膜和肝組織的組織病理學和電鏡檢查顯示[21]組織無變化。這些結果表明，口服瘦素能夠到達其目標下丘腦細胞，觸發控製食物攝入和體重增加，而不引起任何主要的組織改變。在這些結果的鼓舞下，我們對更大的動物，即狗[22]進行了進一步的研究。結果表明，囊化的瘦素含有適當的抗蛋白酶和其他成分，能夠減少狗[22]的食物攝入量。循環的外源性口服瘦素量與食物攝入量減少之間的相關性非常顯著。

我們進一步對棕色脂肪組織進行了研究，該組織是瘦素[26]的靶點。在瘦素的刺激下，棕色脂肪組織在產熱中發揮關鍵作用[26-31];它進行脂肪分解，減少脂肪合成，有助於體重和肥胖的快速減少[27,28]。這一作用主要通過激活線粒體蛋白UCP1來實現[26,27,29,31]。口服瘦素後評價棕色脂肪細胞活性，發現其受到刺激[23];脂肪細胞內線粒體數量明顯增加，脊多，基質致密。包括UCP1在內的幾個線粒體蛋白，增加了許多倍，脂滴破碎成許多小滴，並被吞噬酶體活性[23]降解。

綜合這些數據清楚地表明，一旦口服，外源性瘦素能夠穿過腸壁，通過循環到達目標細胞，引發生理效應。這促使我們繼續我們的研究。我們決定評估和提高我們的口服瘦素方法的效率。綜合效率與處理的不同步驟有關。我們知道瘦素是一種含有146個氨基酸的16kDa的小肽，因此，口服給藥的肽在與胃液和胰液接觸時會遇到很大的問題。我們已經證明，當pH值為酸性的胃液存在時，遊離瘦素會迅速並完全降解[1,9]。應該提供適當的保護。此外，促進從腸腔到循環的轉運也很重要。因此，我們在此報告了瘦素從口服到循環路徑上不同步驟的效率評估，以在胃液中存活，並改善其穿越腸道屏障到達目標細胞。

材料、方法和結果

實驗在體重約20g的正常成年C57BL/6J小鼠上進行。在說明的地方，體重約為40克的ob/ob成年肥胖小鼠也被使用。動物從Jackson實驗室(Bar Harbor, ME, USA)獲得。實驗是按照加拿大動物護理委員會的指導方針和蒙特利爾大學動物設施義務論委員會批準的協議進行的。除非另有說明，10 μ g重組瘦素(R&D Systems Inc.)明尼阿波利斯，MN, USA)溶解在0.5ml的載藥中，通過強迫喂養給小鼠。在尾靜脈采集血液，並使用瘦素Elisa試劑盒(R&D Systems Inc.)對血漿瘦素進行評估。明尼阿波利斯,美國)。所有研究的統計分析均采用均數標準誤差和學生t檢驗。

車輛效率

第一種被測試的車輛是含有抗蛋白酶和膽鹽的緩衝溶液。組成如下:碳酸氫鈉125毫米(pH9)，一片抗蛋白酶(羅氏診斷密西沙加，ON，加拿大)每10ml緩衝液和脫氧膽酸鈉30毫米(Sigma StLouis, MO, USA)。為了減少瘦素在胃液中的降解，需要添加抗蛋白酶，脫氧膽酸鈉則可以促進腸道吸收[32-34]。10 μ g溶解體瘦素灌給正常小鼠;分別在第0、30分鍾、1小時和每小時評估循環瘦素水平，共持續5小時。結果如圖1所示。他們證明，單獨給藥對循環瘦素水平沒有任何影響。在沒有抗蛋白酶或膽鹽的情況下，將瘦素溶解在PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)中也會導致沒有效果，循環瘦素水平保持在基線水平。另一方麵，瘦素溶解在含有抗蛋白酶和膽鹽的碳酸氫鈉緩衝液中，導致循環瘦素水平在30分鍾時顯著增加(圖1)。大約3小時後恢複到基礎水平。

圖1:C57BL/6J正常小鼠口服溶解於0.5ml對照物或PBS的10µg瘦素後，血漿中瘦素水平的變化。單獨使用PBS或載體並不促進瘦素向循環的轉移。* p < 0.05

然後我們評估了各種緩衝器的效率。10µg瘦素溶解於含有抗蛋白酶混合物和膽鹽的不同緩衝液中。圖2A和2B說明了得到的結果。口服瘦素循環水平的增加與大多數緩衝劑非常相似，除了導致較低值的醋酸鹽。當碳酸氫鹽緩衝液的pH值在pH 5到pH 11之間變化時，循環瘦素也會出現類似的升高(圖3)。當pH值為11時，循環瘦素水平在較長時間內保持高水平，但在第2小時時達到基礎水平(圖3)。因此，我們選擇將緩衝液的pH值維持在基本值(pH 9)，以便以某種方式幹擾胃液中存在的酶。

圖2::緩衝效果。
圖2:正常小鼠灌胃10µg的瘦素對照劑、PBS或生理鹽水後，血清瘦素水平的變化。碳酸氫鹽緩衝劑的使用似乎很重要。* p < 0.05

圖2 b:正常小鼠口服10µg瘦素(0.5ml含抗蛋白酶和膽鹽的對照劑)後血漿瘦素水平的變化。測試了各種緩衝器。碳酸氫鹽和磷酸鹽緩衝液產生類似的結果，而乙酸緩衝液似乎效率較低。* p < 0.05

圖3:pH值對瘦素吸收的影響。正常小鼠在pH5 ~ pH11不同pH下灌胃10µg瘦素後，血清瘦素水平變化。* p < 0.05

接著我們測試了抗蛋白酶混合物。將其移除後，循環瘦素增加30分鍾，但其顯著水平低於使用原始載體獲得的水平(圖4A)。然後，我們比較了羅氏抗蛋白酶混合物與抑肽酶(Trasylol, Bayer, Leverkusen, FRG)的效率，結果表明抑肽酶保護瘦素的劑量依賴方式;抑肽蛋白在100 μ g /ml時與羅氏診斷混合物具有類似的保護作用(圖4B)。

圖4:anti-proteases效果
圖4:正常小鼠灌胃10µg無抗蛋白酶瘦素後血漿瘦素水平的變化。在缺乏抗蛋白酶的情況下，瘦素的吸收效率降低。* p < 0.05

圖4 b:正常小鼠口服10µg瘦素(含羅氏抗蛋白酶合劑)或100µg抑肽素(含羅氏抗蛋白酶合劑)後血漿瘦素水平變化。兩種抗蛋白酶溶液似乎有相似的效果。

最後，我們測試了不同膽鹽的效率(圖5和圖6)。從我們的車輛中移除膽鹽的結果是沒有效果;循環瘦素水平保持在基線水平(圖5)。將脫氧膽酸與牛磺酸膽酸、膽酸或石膽酸進行比較，我們得出結論，它們都產生非常相似的結果(圖6A, 6B, 6C);所有測試的膽鹽都能刺激十二指腸細胞對瘦素的吸收，其效果相似。

圖5:膽鹽的作用:正常小鼠口服10µg瘦素後血漿瘦素水平。除去膽鹽會導致瘦素吸收的缺失。* p < 0.05

圖6:膽鹽的作用
圖6:用牛磺膽酸代替去氧膽酸增加瘦素的吸收，但這不是非常顯著的

圖6 b:用膽酸取代脫氧膽酸並沒有帶來顯著的改善

圖6 c:用石膽酸取代脫氧膽酸並沒有帶來顯著的改善

在我們尋找一種最佳的瘦素口服載體的過程中，我們進行了一項額外的測試。我們之前已經證明了氨基酸刺激脂肪組織分泌瘦素[1,35]。因此，我們向我們的載體中添加了500 μ M的穀氨酰胺。這導致循環瘦素水平顯著增加(圖7)。載體中氨基酸的存在使瘦素水平在長達5小時的長時間內保持在高位。正如後麵所討論的，這些高水平可能來自於脂肪組織對瘦素分泌的刺激，但可能對個人無益。

腸道吸收效率

圖7:添加氨基酸。正常小鼠口服10µg瘦素(含500µM穀氨酰胺的載藥)後血漿瘦素水平的變化。這種氨基酸的存在導致循環中瘦素的高水平持續較長時間。* p < 0.05

下一步，我們評估了最有效地將瘦素內化和轉移到血液循環中的腸段。為了進行這項實驗，瘦素被溶解在其載體中，並插入腸的不同部分的腔內。小鼠被麻醉，腹腔暴露。選擇十二指腸、空腸或回腸的片段(每個5cm長)，並通過放置兩個夾子將其與消化道的其餘部分原位分離，同時保持消化道的完整性。在每個節段的腔內插入相同體積的含有瘦素(10µg)的載藥(0.5ml)，並在第一個小時內的固定時間點采血。實驗在15隻動物身上進行(每個腸段5隻)。結果如圖8所示。他們表明瘦素的吸收發生在整個小腸，回腸遠比十二指腸或空腸更有效。這個結果對於設計一個最終的“瘦素丸”．然而，我們應該意識到可以影響這些實驗的許多因素。事實上，回腸袢離十二指腸很遠，因此可能含有相當低水平的胰蛋白酶。另一方麵，由於腸細胞的質膜頂端存在微絨毛，難以評估十二指腸空腸表麵和回腸表麵的實際吸收細胞膜麵積和差異。

圖8:腸段效率。10µg瘦素，0.5ml對照液，分別插入十二指腸、空腸或回腸腔內。每個片段都選擇了5cm長的循環。每個腸段各進行5次實驗。瘦素從腸腔到血液循環的轉移在不同的節段之間有顯著的差異。回腸似乎是最有效的轉移瘦素從管腔到循環。* p < 0.05

管理方法的效率

最後，為了證明我們的口服給藥方法的有效性，我們進行了一項實驗，比較瘦素通過四種不同途徑的吸收。我們評估了口服給藥與皮下注射(肩胛間)、腹膜內注射和靜脈注射(尾靜脈)後循環瘦素的水平。

口服給藥時，將10µg瘦素溶解於最佳載體(包括抗蛋白酶和膽鹽)中，灌給正常C57BL/6J小鼠(每實驗5隻)。皮下注射、腹腔注射和靜脈注射時，將生理鹽水溶解的瘦素10µg注射給動物。在最初的30分鍾內每隔5分鍾采樣一次血液，然後每隔15分鍾采樣一次，共持續2小時。結果表明，口服瘦素的吸收非常有效，而且發生得非常快(圖1)。正如預期的那樣，皮下、腹腔和靜脈注射瘦素導致循環瘦素的水平非常高，並且迅速下降(圖9A-9C)。然而，盡管有高循環水平，不同遞送的瘦素的生理效率仍有待評估。

圖9:在不同部位注射後血液中的瘦素水平。
圖9:正常小鼠皮下(肩胛間)注射10g生理鹽水後循環瘦素水平(N=5)。血液濃度在5分鍾內迅速上升

圖9 b:正常小鼠靜脈(尾靜脈)注射10g生理鹽水後循環瘦素水平(N=5)。血液水平迅速上升。

圖9 c:正常小鼠腹腔內注射10µg生理鹽水後循環瘦素水平(N=5)。血液水平迅速上升

實驗評估了循環瘦素的整體生物效率，為期三天。測試了不同濃度的瘦素。口服給藥時，將最佳載體中溶解的瘦素2.5µg和10µg灌胃，每天1次，連續3天。腹膜內注射2.5µg、30µg或120µg生理鹽水溶瘦素，每天1次，連續3天。皮下注射僅一個濃度，120µg的瘦素在生理鹽水，每天1次，連續三天。在尾靜脈反複靜脈注射被證明是相當困難，疼痛和問題;因此我們決定不通過這種方法來完成實驗。每次實驗在5隻正常小鼠身上進行。記錄每天的體重變化。結果總結在圖10中，並證明了傳遞瘦素的生物效率有很大的差異。 The differences are related to the method of leptin administration. Orally-administered leptin appears to be by far the most efficient. Indeed, at the end of the 3 days experiment, the animals force-fed with 2.5µg of leptin lost 2.5g while those receiving 10µg lost 4g (Figure 10). These changes are more significant that those obtained upon subcutaneous or intra-peritoneal administrations (Figure 10). The rational of those differences lies on the fact that upon reaching the gastric juice, the oral administered hormone uses the normal physiological in situ path for crossing the intestinal wall and reach blood circulation. This will be considered in details in Discussion.

圖10:不同給藥方式對瘦素效率的比較評價。每日服用三天後體重下降報告。口服給藥似乎比腹腔或皮下注射更有效地降低體重。知識產權:intra-peritoneal注入;SC:皮下注射。

討論

我們之前已經證明，胃粘膜負責瘦素的分泌，瘦素是一種有效的食物攝入調節劑[1,16,36,37]。事實上，當我們開始吃飯時，胃主細胞受到刺激，將瘦素釋放到胃腔中。這種瘦素與一種保護性伴侶結合，我們發現它是瘦素受體[15]的可溶性亞型。因此，由主要細胞釋放的瘦素-瘦素受體複合物與胃液結合並被運輸到腸腔。瘦素到達腸細胞的管膜後，與腸細胞頂端刷狀邊界膜上的膜結合受體結合並內化。瘦素通過腸細胞的內體隔室被引導到高爾基體，在那裏它再次與受體的可溶性異構體結合，然後在基底外側膜釋放進入血液循環。瘦素受體複合物到達它的下丘腦靶細胞，觸發飽腹感並控製食物攝入。胃粘膜分泌這樣一種重要的激素麵臨許多缺陷，特別是胃液的惡劣條件和跨腸上皮細胞的跨細胞途徑。除了保護肽免於早期降解外，與瘦素可溶性受體的結合使肽[15]的半衰期延長。這種較長的半衰期允許肽被運送到腸腔，穿過腸壁，加入循環，最終到達目標細胞。 The binding to the soluble receptor is not unique for the gastric leptin, it also applies to leptin secreted by the adipose tissue [1,16]. We have demonstrated that the circulating hormone is not the free peptide but rather the complex leptin-leptin receptor [1, 16].

胃瘦素是通過外分泌方式分泌到胃腔的，這一事實促使我們提出了通過口服瘦素增加其循環水平[21]的可能性。事實上，口服瘦素可能具有重要意義，是調節食物攝入的一種有效途徑，以減輕肥胖患者的體重。如果適當的話，它還可以使體重保持在適當的水平。在之前的研究中，我們已經證明，口服瘦素確實能夠減少食物攝入量，引發體重下降，如果適當地使用，可以長期穩定體重[21]。

在我們的第一份關於口服瘦素[21]的報告中，我們已經表明，給小鼠服用它會導致體重下降，食物攝入量顯著減少。這些變化與口服瘦素的數量密切相關。調整這些量可以使動物在很長一段時間內降低、維持和穩定他們的體重[21]。對正常、ob/ob瘦素缺乏小鼠和db/db瘦素受體缺乏動物進行的實驗表明，口服瘦素對ob/ob小鼠減少食物攝入量和長時間保持相當正常的體重特別有效。相比之下，db/db動物對口服瘦素沒有反應，這意味著口服瘦素作用的機製需要目標下丘腦細胞[21]的質膜上有一個功能完整的瘦素受體係統。我們還證明，長期口服瘦素並沒有引起胃或十二指腸黏膜的任何改變，也沒有引起肝組織[21]的改變。在對小型齧齒類動物進行研究的基礎上，將瘦素口服給大型哺乳動物，也得到了類似的結果[22]。給狗服用瘦素藥丸後，狗的食物攝入量減少了15%到55%。效率的變化與進行實驗的時間有關;早上比下午效率高多了。 Finally we demonstrated that brown adipose tissue a target for circulating leptin [26- 29] is also stimulated by oral leptin [23]. Brown adipocytes responded to the oral leptin by increasing lipolysis and decreasing fat synthesis leading to reduction of adiposity [23]. Thus oral administration of leptin is proposed and is anticipated as a promising avenue for the management of food intake and for the control and maintenance of optimal body weight.

這種口服方法的成功是基於其管理的優化。為了使口服瘦素到達下丘腦細胞的目標，必須避開幾個陷阱。注射激素的載體應該能夠在保護激素不被早期降解和刺激其通過腸壁向血液轉移方麵發揮關鍵作用。我們在此報告一些評估執行，以建立一個最佳的車輛。

對幾種緩衝解決方案進行了測試，發現大多數常用的緩衝是足夠的;碳酸氫鹽和磷酸鹽產生類似的最佳結果。如果緩衝液的pH值保持在堿性側，以抵消消化酶活性所需的胃液的酸度，則其影響不大。另一方麵，抗蛋白酶和膽鹽的存在至關重要。我們以前報道過，在缺乏保護的情況下，瘦素肽被胃液[1]迅速降解。抗蛋白酶保護小肽不被胃液和胰液早期降解。對於內源性瘦素，這種保護是通過與瘦素受體的可溶性亞型結合而提供的。一旦進入十二指腸腔，這種保護就會持續存在，以防止胰腺蛋白酶的降解。我們的試驗表明，無論是羅氏抗蛋白酶混合物還是抑肽酶都能提供足夠的保護，防止酶降解。膽鹽刺激腸細胞內化[32-34]。 As for the buffer, several bile salts were tested and have shown to confer similar promotion for internalization. Since we reported previously that amino acids are able to stimulate leptin secretion by adipocytes [1,35], an additional test was carried out. Following the rational that amino acids would stimulate leptin secretion by the adipose tissue and promote combined actions of exogenous oral leptin and endogenous adipose tissue-secreted leptin, we added glutamine to our vehicle. This resulted in increasing levels of circulating leptin. However, since adipose tissue is long to respond to stimulation and processes leptin through a constitutive secretion [1,3], levels of circulating leptin remained high for long periods of time; maybe too long periods. The proposition of adding amino acids to the vehicle was thus discarded since our aim is to promote rapid but short lasting effects on food intake. Keeping high levels of circulating leptin for long periods may maintain the feeling of satiety for too long, preventing normal and regular food ingestion. On a long term, it might also trigger leptin resistance which will go against our main objective. The proposal of adding amino acids to our vehicle was not implemented.

因此，我們非常簡單的載體由抗蛋白酶和膽鹽在適當的緩衝液中組成，已經顯示出相當有效。

為了設計最佳的瘦素口服膠囊或藥丸，我們需要評估不同腸段的吸收效率。在這一實驗中，我們將溶解在最佳載體中的相同數量的瘦素引入十二指腸、空腸或回腸的腔內，以發現最新的顯示出更高的瘦素轉移到血液循環的能力。由於許多未知的內在因素無法避免，因此本實驗和所得結果難以分析，無法得出明確的結果。事實上，由於其結構，腸細胞膜的吸收麵是很難評估的。盡管在具有相同長度的腸段中引入相同數量的瘦素，但上皮管膜(微絨毛)的特性使得測量真正的吸收表麵極其困難。腸段間胰管酶含量的差異也會影響結果的正確解釋。

最後但並非最不重要的是，進行測試以比較瘦素給藥途徑。我們比較了口服給藥與皮下注射和腹膜內注射。雖然注射後瘦素的循環水平要高得多，但我們發現口服瘦素的生理活性明顯高於注射。正如之前的報道[1,16,36]中明確提到的，循環的生物活性激素不是遊離的瘦素肽，而是瘦素-瘦素受體複合物。因此，通過注射遊離肽獲得的生物作用較弱。相反，口服給藥的瘦素需要穿過腸壁，通過這樣做，與它的可溶性受體結合。因此，口服瘦素在血液中循環，以其複雜的形式到達目標下丘腦細胞，因此更穩定，與下丘腦細胞通過正常途徑以最佳效率相互作用。

我們可以得出結論，就瘦素給藥而言，有兩種途徑是可能的:

• 注射瘦素:在這種情況下，我們認為注射瘦素受體複合物是必須的;或
• 口服瘦素:在這種情況下，瘦素藥丸可能包括-瘦素-瘦素可溶性受體複合物或遊離瘦素結合抗蛋白酶和膽鹽。

我們的結果表明，後者確實更簡單，直接，結果很好。

鳴謝

作者對Daniel Hofmann (MBA)和Ilan Hofmann(博士)的熱情和支持表示感謝。這項研究是由I-Med製藥公司資助的。

參考文獻

1. Cammisotto PG, Levy E, Bukowiecki LJ, Bendayan M(2010)脂肪和胃瘦素之間的相互作用控製食物攝入和能量代謝。細胞化學進展45:143-200。［Ref。］
2. Cammisotto PG, Renaud C, Gingras D, Delvin E, Levy E，等(2005)胃粘膜分泌瘦素的內分泌和外分泌。J組織化學細胞化學53:851-860。［Ref。］
3. Cammisotto PG, Bukowiecki LJ(2002)白色脂肪細胞分泌瘦素的機製。美國物理學雜誌細胞物理學283:C244-C250。［Ref。］
4. Kastin AJ, Pan W, Maness LM, Koletsky RJ, Ernsberger P(1999)缺少瘦素受體短型的大鼠，瘦素通過血腦屏障的運輸減少。肽20:1449 - 1453。［Ref。］
5. Koistinen HA, Karonen SL, Livanainen M, Koivisto VA(1998)循環瘦素在人體內可飽和運輸進入鞘內空間。歐洲臨床投資28:894-897。［Ref。］
6. Mercer JG, Hoggard N, Williams LM, Lawrence CB, Hannah LT等(1996)小鼠下丘腦和鄰近腦區通過原位雜交定位瘦素受體mRNA和長形式剪接變體(Ob-Rb)。FEBS雜誌387:113-116。［Ref。］
7. Elmquist JK, Bjorbaek C, Ahima RS, Flier JS, Saper CB(1998)大鼠大腦中瘦素受體mRNA異構體的分布。神經神經雜誌395:535-547。［Ref。］
8. Schwartz MW, Woods SC, Porte Jr D, Seeley RJ, Baskin DG(2000)中樞神經係統控製食物攝入。自然404:661 - 671。［Ref。］
9. Cammisotto PG, Gingras D, Bendayan M(2007)胃瘦素通過大鼠十二指腸黏膜的轉運。美國胃腸肝髒物理雜誌293:G773-G779。［Ref。］
10. Moran TH, Ameglio PJ, Schwartz GJ, McHugh PR(1992)阻斷A型而非B型CCK受體減弱外源性和內源性CCK的飽腹作用。Am J Physiol 262: R46-R50。［Ref。］
11. 王麗，Barachina MD, Martinez V, Wei jyy (2000) CCK與瘦素的協同作用調節食物攝入。Regul Pept 92: 79-85。［Ref。］
12. Nauck MA, Niedereichholz U, Ettler R, Holst JJ, Orskov C等(1997)在健康人群中胰高血糖素樣肽1對胃排空的抑製作用大於其嗜胰島素作用。雜誌編號:E981-E988。［Ref。］
13. Naveilhan P, Hassani H，卡納斯JM, Ekstrand AJ, Larefalk A，等(1995)正常的攝食行為，體重和瘦素反應需要神經肽yy2受體。Nat Med 5: 1188-1193。［Ref。］
14. Cammisotto PG, Bukowiecki LJ, Deshaies Y, Bendayan, M(2006)白色脂肪細胞中的瘦素生物合成途徑。生物化學細胞生物學84:207-214。［Ref。］
15. Cammisotto PG, Gingras D, Renaud C, Levy E, Bendayan M(2006)胃粘膜外分泌和內分泌細胞分泌可溶性瘦素受體。胃腸肝髒雜誌290:G242-G249。［Ref。］
16. Bendayan M, Cammisotto P(2016)脂肪組織和胃粘膜分泌瘦素控製食物攝入:綜述。內分泌與糖尿病雜誌3:1048。［Ref。］
17. Heymsfield SB, Greenberg AS, Fujioka K, Dixon RM, Kushner R，等(1999)重組瘦素在肥胖和瘦弱成人中的減肥作用:一項隨機、對照、劑量遞增試驗。《美國醫學會雜誌》282:1568 - 1575。［Ref。］
18. Rosenbaum M, Sy M, Pavlovich K, Leibel RL, Hirsch J(2008)瘦素逆轉減肥誘導的視覺食物刺激引起的區域神經活動反應變化J臨床雜誌118:2583-2591。［Ref。］
19. Trevakis JL, Lei C, Koda JE, Weyer C, Parkes DG，等(2010)飲食誘導的肥胖大鼠瘦素和澱粉素在長期維持減重中的相互作用。肥胖18:。第21到26［Ref。］
20. 王愛梅，陳琳，陳麗娟，李燕，李誌強等。(2010)瘦素治療胰島素缺乏性1型糖尿病的研究。美國科學院學報107:4813-4819。［Ref。］
21. Bendayan M, Cammisotto PG(2016)通過口服瘦素控製食物攝入量和體重。《內分泌學雜誌》3:1050。
22. Bendayan M, Cammisotto PG(2016)通過口服瘦素控製狗的食物攝入量。奧斯汀j .性。糖尿病3:1050。［Ref。］
23. Bendayan, M, Cammisotto PG(2016)口服瘦素激活棕色脂肪組織。內分泌與糖尿病雜誌3:1051。［Ref。］
24. Coleman DL, Hummel KP(1967)小鼠突變糖尿病的研究。Diabetologia 3: 238 - 248。［Ref。］
25. 肥胖與糖尿病:在小鼠中引起糖尿病-肥胖綜合征的兩個突變基因。Diabetologia 14:141 - 148 (Ref。］
26. Siegrist-Kaiser CA, Pauli V, Juge-Aubry CE, Boss O, Pernin A，等(1997)瘦素對棕色和白色脂肪組織的直接影響。J clinin投資100:2858-2864。［Ref。］
27. Fedorenko A, Lishko PV, Kirichok Y(2012)棕色脂肪線粒體中脂肪酸依賴性UCP1解耦的機製。細胞151:400 - 413。［Ref。］
28. Yi CX, Meyer CW, Jastroch M(2013)瘦素在大腦中的作用。如何以及何時燃燒脂肪。Mol Metab 2: 63-64。［Ref。］
29. Commins SP, Watson PM, Frampton IC, Gettys TW(2001)瘦素通過棕色脂肪組織中UCP1依賴的機製選擇性減少小鼠白色脂肪組織。Am J Physiol endodoc Metab 280: E372-E377。［Ref。］
30. Kortelainen ML, Pelletier G, Ricquier D, Bukowiecki LJ(1993)人體褐色脂肪組織解偶聯蛋白的免疫組化檢測。J組織化學細胞化學41:759-764。［Ref。］
31. 科紮克LP, Anunciado-Koza R (2008) UCP1:其在肥胖中的作用和效用。Int J Obes (Lond) 32 supply 7:S32-S38。［Ref。］
32. Bendayan M, Ziv E, Gingras D, Ben-Sasson R, Bar-On H，等。(1994)對照組和糖尿病大鼠胰島素腸道吸收的生化和形態細胞化學證據。十二指腸粘膜與結腸粘膜療效比較。Diabetologia 37: 119 - 126。［Ref。］
33. Ziv E, Lior O, Kidron M(1987)通過腸壁吸收蛋白質的定量模型。生物化學藥學36:1035-1039。［Ref。］
34. Ziv E, Bendayan M(2000)腸細胞對多肽的腸道吸收。Microsc Res techhn 49: 346-352。［Ref。］
35. Cammisotto PG, Gelinas Y, Deshaies Y, Bukowiecki LJ(2005)胰島素、糖酵解底物和氨基酸對白色脂肪細胞瘦素分泌的影響。Am J Physiol Metab Endo 289:166-171。
36. Cammisotto PG, Bendayan M(2007)白色脂肪組織和胃粘膜分泌瘦素。Histo組織酚22:199-210。［Ref。］
37. Cammisotto PG, Bendayan M(2012)胃瘦素:一種胃激素的外分泌。阿納細胞生物學45:1-16。［Ref。］

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Bendayan M, Cammisotto PG(2017)口服瘦素控製食物攝入和體重:方法的效率。Obes開放訪問3(1):doi http://dx.doi。org/10.16966/2380 - 5528.126

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出版的曆史:

收到日期:2016年12月21日

接受日期:2017年2月06

發表日期:2017年2月13日