摘要

為研究妊娠期母體高脂高能量日糧中添加或不添加植物甾醇對子代氧化狀態的影響，將妊娠期C57BL/6j小鼠隨機分為飼料對照組(NC)、高脂高能量日糧組(HFED)和高脂高能量日糧中添加植物甾醇組(HFEP) 3組。一旦斷奶，存活的後代小鼠被給予飼料直到10周大。測定10周齡子代血脂。根據製造商的協議分析肝髒勻漿氧化生物標記物。結果表明，與周糧組相比，HFED組的體重、血脂均顯著升高。HFED組母鼠和新生兒小鼠肝髒勻漿氧化應激水平明顯高於HFED組。新生和成年小鼠肝髒的抗氧化能力均受到損害。早期補充植物甾醇可改善子代血脂代謝異常，但不能改善氧化損傷。

關鍵字

植物甾醇;產婦高脂肪高能量飲食;胎兒發育;氧化劑;抗氧化作用;脂質代謝

簡介

胎兒在子宮內的發育可能會受到母體飲食的影響，這現在被認為是成年期慢性非傳染性疾病的一個來源[1-3]。Bayol和他的同事報告說，在胎兒期和吸吮期接觸母體垃圾食品的大鼠在出生[4]後10周出現超重。其他許多研究也表明，在妊娠和哺乳期喂食高脂肪飲食的母鼠在後代中表現出肥胖、久坐行為和血管功能障礙等代謝綜合征特征[1,5,6]。

高脂肪飲食會破壞能量攝入、消耗和儲存之間的平衡。它會導致肥胖增加，並破壞多種代謝過程的調節，包括肥胖、胰島素抵抗和脂質氧化[7,8]。據報道，高脂飲食[9]誘導小鼠產生活性氧(ROS)是觸發胰島素抵抗的最初事件，提示活性氧的產生可能是觸發高脂飲食誘導代謝綜合征的最初關鍵事件。在持續的研究中，母體高脂肪喂養已被證明與肝髒氧化應激增加、抗氧化能力降低有關，並導致小鼠[10]的大腦氧化應激升高和莫裏斯水迷宮表現降低。新生兒、吸吮子代和成年子代的氧化應激變化是否與母體高脂肪高能量飲食HFED的影響相同，尚不清楚。植物甾醇是一組天然存在於植物中的類固醇和酯類物質，可通過與膳食膽固醇和膽道膽固醇競爭腸道吸收，增強膽固醇排泄，從而降低血清膽固醇濃度[11,12]。在此之前，我們已經報道了在生命早期攝入植物甾醇可能有助於減輕母體高脂肪飲食對小鼠[13]膽固醇代謝的不利影響。然而，植物甾醇對母體高脂飲食引發的氧化應激的影響尚未闡明。在本研究中，我們研究了高脂飲食對後代發育和氧化應激的影響，並評估了在妊娠和哺乳期間攝入植物甾醇的影響。

材料和方法

材料

植物甾醇購自藍天生物工程有限公司(中國西安)，其組成如表1所示。使用巴倫醫療設備有限公司(北京，中國)的羅氏診斷試劑盒測定血清脂質譜。使用商用試劑盒分析從南京建成生物技術研究所獲得的新生兒肝髒勻漿中的活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。

表1:植物甾醇的組成

動物和飲食

C57BL/6j小鼠，體重18-22 g(10周齡)，由北京大學衛生科學中心動物服務處提供。在首都醫科大學實驗動物中心進行治療前，所有動物適應接種1周。溫度、濕度、光照循環自動控製。在整個研究過程中，溫度和濕度分別為20-24°C和40%-70%，每小時至少換氣15次。白天是8:00-20:00。動物們可以自由地獲得食物和水隨意．飼養1周後，將兩隻未交配的雌鼠關在籠子裏過夜，其中一隻雄鼠單獨關在一個籠子裏，每天檢查雌鼠是否有陰道塞。一旦確認懷孕，雌性小鼠被隨機分為三組(每組30隻)，並按如下方法處理:飼糧(對照組，NC，總能量352千卡/100 g)、高脂高能量飼糧(HFED, 84%周糧+16%豬油+0.2%膽固醇，總能量439.68千卡/100 g)、添加植物甾醇的高脂高能量飼糧(HFEP, 82%周糧+16%豬油+0.2%膽固醇+1.5%植物甾醇，總能量439.68千卡/100 g)，這些飼糧在妊娠和哺乳期不變，存活後代飼喂周糧至10周齡。新生小鼠隨機分為新生組、斷奶組和10周齡組。小鼠分別在0日齡、21日齡和10周齡記錄體重後頸椎脫位致死。然後收集肝髒並稱重。相對肝重計算為肝重與體重之比。所有的肝髒立即被冷凍在液氮中，並保存在-80°C進行進一步研究。

所有實驗程序都按照《實驗動物護理原則》(NIH第85-23號出版物，1985年修訂)和首都醫科大學動物研究委員會的指導方針進行。

生化試驗

從10周齡小鼠後代的全血中以3000轉/分離心10分鍾分離約0.4 ml血清。采用全自動生化分析儀(Hitachi 7180, Tokyo, Japan)測定血清總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

肝髒氧化狀態測定

小鼠(母鼠及子代)肝髒洗淨，用超聲波細胞粉碎粉碎，在0.9 g/L、NaCl加冰的鹽水溶液中均質。根據Bejma[14]，采用2′，7′-二氯熒光素(DCFH)作為探針，測定勻漿中肝髒活性氧(ROS)含量。將肝髒(20 mg)在80 μ l PBS (0.1 mM, Ph 7.0)緩衝液中徹底切碎，並用電動波特Elveljem玻璃均質器在冰上均質。肝勻漿在4℃下離心(13000 r/ min, 15 min)。取勻漿的一部分(10µl)用於測定ROS的產生。H₂O₂標準曲線(圖1)根據Cell Biolabs (San Diego, USA)提供的協議製備，H₂O₂濃度範圍為0 ~ 70 μ M。用Cary Eclipse熒光分光光度計在485 nm激發/530 nm發射條件下讀取熒光。

肝勻漿中總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量根據製造商(南京建成生物工程研究所，中國)的協議進行測定。

統計分析

SPSS 18.0 for Windows軟件(SPSSInc。，芝加哥，IL, USA)用於所有統計分析。數據分析采用單因素方差分析。當p<0.05時考慮顯著性。

結果

HFED和HFEP對雄性後代發育的影響

與飼料組相比，HFED組新生鼠和吸吮鼠的平均體重顯著增加(p<0.05)，而成年子代體重在三組間無顯著差異。與HFED組相比，HFEP組新生小鼠體重顯著降低(p<0.05)，但對於吸吮小鼠和成年小鼠而言，HEFP組未發生顯著變化(表2)。在新生兒階段，所有試驗雄鼠的相對肝髒重量均未發生顯著變化，而HFEP組雌鼠相對肝髒重量較其他各組略有降低。在吸吮期(21日齡)，HFED組的相對肝髒重量顯著增加。而在成年期(10周齡)，HFEP組的相對肝髒重量增幅最大(表3)。

表2:孕、哺乳期母鼠高脂高能量飲食對子代小鼠體重的影響(g，均值±SD) NC:周糧，正常對照組;HFED:高脂肪、高能量飲食;HFEP:添加植物甾醇的高脂肪能量飲食;0 d:小鼠後代娩出的那天;21 d:幼鼠斷奶的日子;10w:小鼠後代10周齡
**與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)
*表示與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)
^一個與HFED組比較有顯著性差異(P<0.05)

表3:孕、哺乳期不同飼糧處理小鼠後代的相對肝重(g/100g.BW) NC:飼料，正常對照組;HFED:高脂肪、高能量飲食;HFEP:添加植物甾醇的高脂肪能量飲食;0 d:小鼠後代娩出的那天;21 d:幼鼠斷奶的日子;10w:小鼠後代10周齡
**與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)
*表示與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)
^一個與HFED組比較有顯著性差異(P<0.05)

成年子代血清膽固醇譜

血清TC水平對早期心血管疾病的評價具有重要作用。HFED飼糧在妊娠和哺乳期顯著提高子代血清TC和HDL-C水平(p<0.05)，而添加植物甾醇抑製了其升高(p<0.05)。血清LDL-C水平在母體飲食中沒有顯著變化(p<0.05)(表4)。

表4:母體在妊娠和哺乳期不同飲食對10周齡小鼠子代血脂的影響(mmol/L，平均值±SD) NC:周糧，正常對照組;HFED:高脂肪、高能量飲食;HFEP:添加植物甾醇的高脂肪和能量飲食。
**與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)
*表示與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)
^一個與HFED組比較有顯著性差異(P<0.05)

胎體及其子代的氧化狀態(圖2)

在新生兒階段，HFED組肝髒中SOD、總抗氧化活性(T-AOC)和穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活性顯著低於NC組(圖2a、2b和2d)。對於MDA和GSH水平，治療組無差異(圖2c和2e)。有趣的是，h飼料處理過的雛鳥肝髒勻漿中的ROS水平顯著增加，在其新生兒後代中也觀察到類似的增加趨勢(圖2f)。顯示了產婦和新生兒肝髒勻漿之間的相關關係(圖2g)。

圖1:過氧化氫標準曲線

圖2:母體高脂飲食在妊娠和妊娠期間添加或不添加植物甾醇對新生、吸吮和成年小鼠氧化狀態的影響。(a)和(d)在新生小鼠中，HFED組肝髒中SOD和GSH-Px活性顯著低於飼料組。(b) HFED組小鼠總抗氧化能力(T-AOC)明顯降低。(c) HFED組吸吮小鼠肝髒MDA含量顯著低於飼料組。(e)與周糧組相比，HFED組吮吸小鼠肝髒勻漿中總穀胱甘肽水平顯著升高。(f) HFED誘導雛鳥肝髒勻漿中ROS水平顯著升高，繼而在其新生兒後代中升高。(g)母體肝勻漿ROS與新生兒肝勻漿ROS濃度之間的相關性。皮爾遜相關係數:r=0。602, p = 0.002。

在吸吮期，肝髒中SOD、總抗氧化活性(T-AOC)和穀胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活性逆轉下降趨勢，HFED組較NC組呈升高趨勢(圖2a、2b和2d)。同時，MDA水平降低(圖2c);與NC組相比，HFED組GSH水平升高(圖2e)。

對於成年子代(10周齡)，HFED組肝髒SOD活性顯著低於NC組，且母體飼糧中添加植物甾醇不影響其活性的降低。其他氧化應激生物標誌物不受母親飲食的影響。

討論

越來越多的證據表明，富含脂肪和能量的母親飲食會增加子女成年期胰島素抵抗、血脂異常、肥胖和高血壓的風險[15,16]。有研究表明，氧化應激可能是胎兒在成年期發生疾病的關鍵[17,18]。在這些研究中，評估了母體HFED飼糧對新生兒、吸吮後代和成年後代肝髒氧化狀態的影響，並觀察了母體飼糧中添加植物甾醇的影響。結果表明，母體在妊娠和哺乳期飼喂HFED飼糧可降低子代抗氧化活性。同時，我們觀察到，與HFED組相比，母親飲食中添加植物甾醇改善了後代的發育和血清膽固醇水平，但沒有提高氧化應激。

在本研究中，我們的數據與其他報道一致[3,5]，即HFED組成年子代血清TC和LDL-C水平顯著升高。HFED組吸吮小鼠的相對肝髒重量顯著增加;然而，在新生和成年小鼠中，沒有觀察到這種趨勢。對新生兒來說，營養物質通過胎盤從母體輸送到胎兒，從而調節胎兒[19]的營養供應。我們發現HFED飲食對孕婦體重和孕期食物攝入量沒有顯著影響。相比之下，[20]組的血清TC、LDL-C、HDL-C、FFA和胰島素水平顯著升高。為了適應水壩的過度營養狀態，可能會抑製脂質合成基因的轉錄。這也許可以解釋產婦飲食中肝髒重量相對未改變的原因。

在正常妊娠期間，循環氧化應激的生物標誌物包括脂質過氧化物和丙二醛顯著升高。氧化應激可能是人類妊娠相關疾病的誘因，如複發性妊娠丟失、胚胎吸收、宮內生長限製(IUGR)、先兆子癇和胎兒死亡[22]。眾所周知，成年後長期攝入高脂飲食會導致氧化應激和/或肝髒[23]損傷。在我們的研究中，母親的高脂飲食導致了母魚肝髒中ROS水平的升高，這表明氧化應激升高。在另一項研究中，它還發現妊娠期間的HFED飲食會導致母體氧化[20]。綜上所述，這些結果表明，母親的高脂飲食可能是妊娠性疾病的誘因之一。

我們認為，母體氧化應激可能轉譯給胎兒，從而影響子代的抗氧化能力。因此，我們分析了後代肝髒氧化應激標誌物和抗氧化酶活性。我們的研究結果表明，新生兒和成年子代肝髒的抗氧化活性降低，而哺乳小鼠肝髒的抗氧化活性升高。與我們的觀察結果一致的是，有報道稱，母體在妊娠期間食用HFED會降低大鼠胎肝中的SOD活性和mRNA表達，並增加非人類靈長類動物胎肝中的8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OH-DG)和4-羥基-2-壬烯醛(HNE)水平[24,25]。這些結果表明，胎兒或新生兒肝髒的抗氧化活性降低。

在妊娠期和哺乳期飼喂HFED飼料的成年後代中，盡管斷奶後飼喂周糧，但肝髒中負責抗氧化防禦能力的基因被抑製了191個。在我們的研究中，我們觀察到HFED組的SOD活性下降。但HFED組的GSH-px活性並不顯著低於NC組。我們的關鍵發現是，我們觀察到在妊娠和哺乳期間，喂食HFED的母鼠所產的哺乳小鼠的肝髒抗氧化活性增加。幼崽出生後，由喂食HFED飼料的水壩喂養;這些水壩產的奶可能含有很高的能量[27]。據報道，高脂肪和高能量的飲食增加了小鼠的氧化應激[9]。由此可見，在對高能量飼料的響應中，肝髒的抗氧化活性被誘導。這種響應的機製有待於未來的研究。

眾所周知，食用補充了植物甾醇的食物可能有助於降低動物模型或人類的LDL-C水平。最近，研究人員發現植物甾醇可緩解高血糖、結腸癌動物模型和高膽固醇血症患者的氧化應激[29-31]。我們認為，添加植物甾醇可能減輕HFED飼糧對雌魚及其子代的氧化損傷。結果表明，抗氧化活性在母魚體內有效，但在子代中不太好，說明母魚飼糧中補充植物甾醇可能不是防止母魚食用HFED飼糧對子代產生不利影響的好方法。

結論

綜上所述，我們目前的研究表明，在妊娠和妊娠期間，飼喂HFED飼糧的雛菊、吸吮子代和成年子代的氧化應激是不同的。植物甾醇的補充可以減輕大壩的氧化損傷，但不能減輕子代的氧化損傷。

的利益衝突

作者聲明沒有利益衝突。

確認

本研究得到國家自然科學基金(No. 81273070、30771802)和北京市自然科學基金(No.7092012)的資助。

參考文獻

1. Ashino NG, Saito KN, Souza FD, Nakutz FS, Roman EA，等(2012)妊娠和哺乳期母體高脂喂養易使小鼠後代發生分子胰島素抵抗和脂肪肝。中國生物化學雜誌23:341-348。［Ref。］
2. 安吉H，湯普森C, Ozanne SE，魯尼KB(2011)母體高脂喂養和子代血糖控製的動物模型係統綜述。地球物理學報(自然科學版)35:325-335。［Ref。］
3. Elahi MM, Cagampang FR, Mukhtar D, Anthony FW, Ohri SK，等(2009)母鼠從斷奶到妊娠和哺乳期的長期高脂喂養易使幼鼠患高血壓、血脂升高和脂肪肝。Br J Nutr 102: 514-519。［Ref。］
4. Bayol SA, Farrington SJ, Stickland NC(2007)母鼠在妊娠期和哺乳期的“垃圾食品”飲食促進了大鼠後代對“垃圾食品”的更強烈的口味和更大的肥胖傾向。植物學報(自然科學版)98:843-851。［Ref。］
5. Benkalfat NB, Merzouk H, Bouanane S, Merzouk SA, Bellenger J，等(2011)飲食肥胖大鼠後代脂肪組織代謝的改變。臨床科學(國際)121:19-28。［Ref。］
6. Chen H, Simar D, Lambert K, Mercier J, Morris MJ(2008)產婦和產後營養過剩對食欲調節和燃料代謝的影響差異。內分泌學149:5348 - 5356。［Ref。］
7. Woods SC, D 'Alessio DA, Tso P, Rushing PA, Clegg DJ，等人(2004)攝入高脂肪飲食會改變能量平衡的內穩態調節。物理行為學83:573-578。［Ref。］
8. 張傑，張峰，Didelot X, Bruce KD, Cagampang FR，等(2009)妊娠和哺乳期產婦高脂飲食改變成年子代胰島素樣生長因子-2和關鍵微rna的肝髒表達。BMC基因組學;10:478。［Ref。］
9. Matsuzawa-Nagata N, Takamura T, Ando H, Nakamura S, Kurita S, et al.(2008)氧化應激增加先於高脂飲食誘導的胰島素抵抗和肥胖的發生。代謝57:1071- 1077。［Ref。］
10. White CL, Pistell PJ, Purpera MN, Gupta S, Fernandez-Kim SO，等(2009)高脂肪飲食對大鼠Morris迷宮表現、氧化應激和炎症的影響:母係飲食的貢獻。神經生物學雜誌35:3-13。［Ref。］
11. eusen SR, Feenstra TL, Toxopeus IB, Hoekstra J, Klungel OH，等(2011)在預防心血管疾病的他汀類藥物治療中添加含有植物甾醇/-甾醇的功能食品的成本和健康影響。歐元製藥;668: S91-S100。［Ref。］
12. 錢麗麗，吳麗麗，李廷林，黃樂生(2010)含植物甾醇乳發酵奶粉對倉鼠降膽固醇的影響。食品化學119:1121-1126。［Ref。］
13. 於海林，高麗峰，馬偉偉，謝峰，畢青雲，等(2013)植物甾醇對妊娠期高脂高能量飼糧小鼠血清LDL-C水平和學習能力的影響。國際食品科學與營養雜誌64:724-729。［Ref。］
14. 貝馬J, Ramires P, Ji LL(2000)自由基產生和氧化應激與衰老和運動:心肌和肝髒的不同影響。物理學報(自然科學版)。［Ref。］
15. Barnes SK, Ozanne SE(2011)早期環境與長期健康和壽命之間的聯係途徑。生物生物學進展:323-336。［Ref。］
16. Howie GJ, Sloboda DM, Vickers MH(2012)母體在發育關鍵窗口期的營養不足對成年大鼠後代的出生後肥胖和相關代謝特征產生差異和性別特異性影響。中華植物學報108:298-307。［Ref。］
17. Saker M, Soulimane MN, Merzouk SA, Merzouk H, Belarbi B, et al.(2008)根據出生體重對母親及其新生兒氧化和抗氧化狀態的影響。中華婦產科雜誌32(5):593 - 593。［Ref。］
18. Bouanane S, Benkalfat NB, Baba AF, Merzouk H, Mokhtari NS，等(2009)過度喂養肥胖大鼠及其後代血清氧化/抗氧化狀態變化的時間過程。臨床科學(國際)116:669-680。［Ref。］
19. Larqué E, Ruiz-Palacios M, Koletzko B(2013)胎盤對胎兒營養供應的調節。Curr Opin clinr Nutr Metab Care 16: 292-297。［Ref。］
20. 於海林，苗海濤，高麗芳，李麗，席依德，等(2013)小鼠胎兒通過下調SREBP1對母體HLE飲食的適應性反應:一項基於微陣列和生物分析的研究。血脂雜誌54:3269- 3280。［Ref。］
21. Barden A(1999)正常妊娠和子癇前期循環氧化應激標誌物升高。中華婦產科雜誌106:1232。［Ref。］
22. Al-Gubory KH, Fowler PA, Garrel C(2010)細胞活性氧、氧化應激和抗氧化劑在妊娠結局中的作用。國際生物化學雜誌，細胞生物學雜誌42:1634-1650。［Ref。］
23. 香港文生，Taylor AG(2006)人類肥胖誘導氧化應激的生物標誌物和潛在機製。生物化學學報(自然科學版)30:400-418。［Ref。］
24. 林燕，韓曉峰，方誌峰，車麗琴，Nelson J，等(2011)高脂膳食纖維補充對大鼠胎兒發育的有益影響。Br J Nutr 106: 510-518。［Ref。］
25. McCurdy CE, Bishop JM, Williams SM, Grayson BE, Smith MS, etal .(2009)母體高脂肪飲食引發非人類靈長類動物胎兒肝髒的脂毒性。臨床投資119:323-335。［Ref。］
26. 張旭，Strakovsky R，周東，張穎，潘yx(2011)母體高脂飲食抑製雄性子代大鼠肝髒抗氧化防禦基因表達，誘導細胞衰老通路。中華醫學會雜誌。［Ref。］
27. Kelishadi R, Hadi B, Iranpour R, Khosravi-Darani K, Mirmoghtadaee P，等(2012)母乳中脂質和脂肪酸含量及其與母親飲食組成關係的研究。中華醫學雜誌17:824-827。［Ref。］
28. 王曉燕，王曉燕，王曉燕。(2010)植物甾醇和甾醇對低密度脂蛋白膽固醇降低的影響。《心血管藥理學雜誌》15:120-134。［Ref。］
29. Gupta R, Sharma AK, Dobhal MP, Sharma MC, Gupta RS (2011) β-穀甾醇在鏈脲佐菌素誘導的實驗性高血糖中的抗糖尿病和抗氧化作用。《糖尿病雜誌》3:29 -37。［Ref。］
30. Baskar AA, Al Numair KS, Gabriel Paulraj M, Alsaif MA, Muamar MA，等(2012)β-穀甾醇在1,2-二甲基肼誘導的結腸癌大鼠中防止脂質過氧化，改善抗氧化狀態和組織結構。醫學食品雜誌15:335-43。［Ref。］
31. Mannarino E, Pirro M, Cortese C, Lupattelli G, Siepi D，等(2009)富含植物甾醇的乳製品對高膽固醇血症患者血脂、甾醇和8-異前列腺素的影響:一項意大利多中心研究。中華心血管雜誌19:84-90。［Ref。］

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文章類型:研究文章

引用:高麗芳，於海林，範傑，李麗，肖銳，等。(2016)母體妊娠期高脂飲食及添加植物甾醇對新生兒、吸吮子代和成年子代氧化狀態的影響。肥胖開放訪問2(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2380-5528.119

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出版的曆史:

收到日期:2015年12月02

接受日期:2016年5月28日

發表日期:2016年5月31日