營養與食品技術科學

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研究文章
分離得到的豌豆蛋白理化性質和功能性質的評價

Huda Elgubbi1 *阿德爾Alajtal2Nazer Dabri2薩阿德Aboualkasem3.

1利比亞米蘇拉塔大學環境與中性資源學院環境係
2利比亞米蘇拉塔大學理學院化學係
3.利比亞米蘇拉塔大學理學院生物學係

*通訊作者:利比亞米蘇拉塔大學環境與中性資源學院環境學係胡達·埃爾古比電子郵件:Elgubbi@Sci.miuratau.edu.ly


摘要

蛋白質是從豌豆種子中提取的。用蛋白質溶解度、吸水吸油能力、乳化能力和乳化穩定性、發泡能力和泡沫穩定性等指標測定了豌豆中蛋白質的化學和功能特性。堿性(NaOH 0.1 N)增溶(pH 10)， 1:10 (gm/ml)比例，TCA/丙酮沉澱法得到的豌豆蛋白蛋白含量最高，功能性能最好。參與豌豆蛋白(PPP)的溶解度曲線顯示在pH值為4-10的範圍內具有最小溶解度。豌豆蛋白的乳化能力較低(3.2)，但乳化穩定性較高(98.9)。PPP在pH值下表現出較高的發泡能力2泡沫形成的最佳時間為30 min，泡沫的高穩定性為78.8%。研究結果強調，PPP的吸水能力比石油更強。因此，根據其營養價值、化學成分和功能特性，本實驗表明PPP可以成功作為食品配料。

關鍵字

豌豆;豌豆分離蛋白(IPP);參與豌豆蛋白(PPP);化學和功能性質


簡介

豆科植物是在人類和動物營養方麵發揮重要作用的重要作物。此外，它們還被認為是複合碳水化合物、膳食纖維以及蛋白質和礦物質的良好來源。豌豆(豌豆)是人類和動物使用的最古老的作物之一。這類作物在生長的各個階段都具有抗寒性，是世界寒冷地區大豆的優良替代品。豌豆被認為是營養成分的主要來源，可以被分成許多成分和富含蛋白質、澱粉、纖維等的食品。一般來說，豌豆種子含有20- 25%的蛋白質，40-50%的澱粉和10-20%的纖維[2,3]。豌豆蛋白的許多特點使其在世界範圍內流行，例如它的低成本，可獲得性和健康益處。

豌豆蛋白具有良好的遺傳多態性[4]。所有蛋白質序列數據庫可在http://www.expasy.org上查詢，該數據庫顯示，豌豆種子中發現了638個不同豌豆品種的蛋白質和多肽氨基酸序列，其中包括種子貯藏蛋白[5]。總的來說，豌豆的蛋白質主要分為四大類:穀蛋白、脯氨酸、白蛋白和球蛋白，每種蛋白的含量分別為2-4%、4-5%、18-25%和55-65%，可見在豌豆種子[6]中，球蛋白和白蛋白的含量最高。球蛋白組分中含量最高的是11s -豆莢素和7S-vicilin[7]。豌豆豆莢素的氨基酸序列與大豆豆莢素的氨基酸序列相似。

豆科蛋白由兩個亞基組成，一個是含有大量酸性氨基酸的α-鏈，一個是含有大量堿性氨基酸的β-鏈，分子量分別約為40 kDa和20 kDa。豆科植物的兩個亞基通過二硫化物鍵連接在一起，總分子量為330 kDa。豌豆vicilin含有α (19kda)、β (13.5 kDa)和γ (16kda)[5]三個鏈。

豌豆種子蛋白質組學分析正在發展成為一種非常適合的生物化學研究工具，包括營養成分的研究。多種生物化學方法可用於豌豆蛋白的提取和參與，並測定其溶解性、乳化性、起泡性、粘度和水解性等理化性質。因此，本研究的目的是確定豌豆蛋白的理化性質和功能特性，並確定其在食品中的潛在用途，並采用不同的技術參與蛋白質，確定蛋白質的最佳純化條件和蛋白質的純化條件。

材料與方法
材料

氫氧化鈉(BDH)、氯化鈉(PARK)、丙酮(BDH)、鹽酸(默克)、石油醚(默克)、硫酸銨、三氯乙酸(Fluka)、碘化鉀(BDH)、五水硫酸銅(二)(Fluka)、酒石酸鉀鈉(Fluka)、白蛋白(Fluka)、脫鹽水(Fluka)、玉米油、巰基乙醇、丙烯酰胺(BDH)、雙丙烯酰胺(BDH)、丁醇(默克)、醋酸、甘油(BDH)、四甲基乙二胺(TEMED-BDH)、鹽酸三酯(Tris HCl)、十二烷基硫酸鈉(SDS-Fluka)，過硫酸銨(APS-Pharamacia)和甘氨酸(氧化)。

收集和準備樣品

綠豌豆是從浦田市的當地市場隨機采集的。去除所有雜質後，用實驗室研磨機將豌豆研磨幾次，為化學分析做準備。

理化性質測定

並對其水分、脂肪等理化性質進行了研究。用微量凱氏定氮法測定種子蛋白質含量。

相對濕度(RH)估算

相對濕度是種子在烤箱中烘幹後，直到重量穩定為止所流失的水分。樣品在150°C烘箱中幹燥2小時後，濕度估計為[8]。之後，用4.632 g的粉末根據下式(1)來評估相對濕度。

\[{\rm{相對濕度(\%)}}= \frac{{{\rm{幹燥前樣品重量-幹燥後樣品重量}}}}{{{\rm{幹燥前樣品重量}}}}\times 100 - - - - - (1)\]

總蛋白濃度的測定

氮是生物中除碳、氫、氧之外的主要元素。微量凱氏定氮法測定氮含量。在這種方法中，蛋白質中的氮被H2所以4在消化。2 g樣品，計算如下(2)。

\[{\rm{蛋白質總量\%}}= \frac{{{\rm{校準量}}\乘0.014 \乘6.25}}{{{\rm{樣品重量}}}}\乘100 - - - - - (2)\]

總灰分測定

豌豆灰分是指豌豆中的無機物質。0.289 g豌豆粉中測定的灰分如式(3)所示。

\[{\rm{灰分總量\%}}= \frac{{{\rm{燃燒前幹樣重量-燃燒後樣品重量}}}}{{{\rm{燃燒前幹樣重量}}}}\乘以100 - - - - - (3)\]

脂肪的決心

采用石油醚瑞典管萃取法，按[9]法測定豌豆粉中的粗脂肪。

優化蛋白質的純化條件

縮二脲試驗:將3 g五水硫酸銅與9 g酒石酸鉀鈉稀釋在500 ml氫氧化鈉中，加入0.2 mol / 5 g碘化鉀，搖勻後與0.2 mol的氫氧化鈉繼續調至1升，製備雙縮脲試劑。用分光光度計將純化的豌豆蛋白的強度與一係列已知濃度的牛血清白蛋白(BSA)的強度進行比較，計算出純化蛋白的濃度。

蛋白質純化條件的優化

采用可變條件從種子中提取蛋白質。當使用三種溶劑，蒸餾水，氫氧化鈉和氯化鈉時，變化是在溶劑類型。並對種子粉采用不同濃度的溶劑。其他條件的優化，如使用不同的溫度(25,30,40,45,50)℃。pH值為(1.03,1.97,3.08,5.19,6.24,7.15,8.05,9.07,10.7,12.07)。最後優化提取時間為(30、60、74、90)min。

TCA /丙酮沉澱法

如Isaacson T等人所述，使用TCA/丙酮改性方法沉澱蛋白質[10]。

豌豆籽粉懸浮在10% TCA/丙酮中，-20°C保存過夜。然後，樣品在4℃，5000 g離心30分鍾。合成的小球用冷丙酮洗滌兩次，每一步都是在4°C下5000 g離心10分鍾。蛋白質沉澱風幹(1-3分鍾)後在4℃下長期保存。

分離的豌豆蛋白的功能性質

蛋白質溶解度[11]:測定蛋白質在不同PH值(10-8-4-2)的水中(0.02 g/2 ml水)的溶解度，在室溫下攪拌30分鍾。離心30分鍾後，用二縮脲法測定上清中蛋白質的濃度。

泡沫容量和泡沫穩定性:將0.1 g的樣品與不同PH值(2- 4- 8- 10)的蒸餾水10ml混合，鎖殼5 min，在不同時間(0- 30- 60- 90- 120)min監測形成泡沫的數值，計算泡沫容量的方法(4)。

\ [{\ rm {FC (\% )}} = \ 壓裂{{{rm \{泡沫體積}}}}{{{rm \{最初的樣本體積}}}}\乘以100 - - - - - ( 4) \]

將泡沫靜置不同時間(0- 30- 60- 90- 120)min以測試其泡沫穩定性，然後測量FC試驗剩下的泡沫體積，並計算泡沫穩定性(FS)(5)。

\ [{\ rm {FS (\% )}} = \ 壓裂{{{rm \{泡沫體積測試後乘以}}}}{{{rm \{初始泡沫體積}}}}\乘以100 - - - - - ( 5) \]

豌豆蛋白乳化特性的測定:當加入0.07 g分離豌豆蛋白時，測定了蒸餾水5 ml與商品化玉米油5 ml之間的乳化效果。pH值為7的乳化液以厘米為單位進行測量，由盧誌祥等計算[6]。此外，乳化液的穩定性通過在900°C的水路徑中加熱30分鍾，然後冷卻到室溫來確定。

\ [{\ rm {ES (\% )}} = \ 壓裂{{{rm \ {VB - VAd}}}} {{{rm \ {VB}}}} \乘以100 - - - - - ( 6) \]

VB和VA為加熱前和加熱後的水相，900°C加熱30分鍾。

粘度估算:使用ubbelohde粘度計在不同溫度(25、35和45)℃下估算所有樣品的粘度。將0.1 g分離的豌豆蛋白加入10毫升蒸餾水中製備樣品。

油結合能力:將0.125 g分離蛋白混合物與2.5 ml商業化玉米油混合，搖勻30分鍾。然後在室溫下靜置30分鍾，然後以4000轉/分離心1分鍾。最後根據Sosulski FW等人[13]提出的方法測定油的結合能力。吸油能力以吸收的g水/g蛋白質表示。

水結合能力:用類似的方法來測量之前提到的脂肪結合能力，除了油和水交替。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質

根據製造商的說明，在迷你蛋白酶II係統(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)上還原條件(10 mM 2-巰基乙醇)下，使用SDS-PAGE可視化分離的豌豆蛋白的蛋白質組成。用考馬斯亮藍(CBB)染色。

統計分析

蛋白質提取一次，得到的分離物用於進一步的分析。所有分析均重複3次，結果以平均值±標準差表示。感官分析結果采用單因素方差分析，隨後采用Tukey事後檢驗。所有統計分析均采用SPSS進行，p<0.05為差異有統計學意義。

結果與討論

豌豆種子的化學成分和蛋白質產量

下麵的表1顯示了豌豆種子粉的化學結構。

豌豆組件 百分比
1 蛋白質(每2克) 5.3
2 灰分(0.289 gm) 3.8
3. 水分 9.5
4 脂肪 2．3

豌豆籽粉的蛋白質含量高達5.3%。灰分和脂肪含量為3.8% ~ 2.3%。本研究得到的脂肪和灰分含量在其他研究的不同品種的範圍內[14-16]。

豌豆粉的蛋白質含量為5.3%。蛋白質含量與其他研究不同[17,18]。許多作者報道了蛋白質含量和組成的巨大變異性，包括基因型之間的差異，以及基因型內的環境影響[19,20]。Klein和Raidl[21]解釋說，影響大田豌豆蛋白質含量的環境因素包括氮肥、成熟期、土壤磷鉀含量和溫度。

豌豆種子蛋白的提取條件優化

溶劑濃度對DPS蛋白提取液的影響:圖1顯示了不同溶劑對蛋白提取液的影響。結果表明，NaOH (0.1 N)和NaCl(1%)中提取的蛋白質最高(2.7 mg/g，占種子總重量的1.9)，與NaCl(5%)和H差異極顯著(P=0.001)20時可提取蛋白最低，NaCl(5%)和H20分別為種子總重的0.1 mg/g和1.1 mg/g。

圖1:用burite法測定不同濃度NaOH和Nacl對豌豆種子蛋白質的影響。

Redant L等人[22]所做的一項研究報告稱，當堿濃度從0.01 M增加到0.1 M時，提取的蛋白質比例從57.2%增加到61.5%。這一結果與本研究中使用NaOH (0.1 N)提取蛋白質的結果一致。NaCl (1%=10 N)。這表明豌豆蛋白質的可溶性較低，NaOH濃度高於0.05 N可能會導致蛋白質修飾[23,24]解釋說，較高的堿性濃度被認為有助於打破氫鍵，並將氫從酸性氨基酸側鏈和硫酸鹽基中分離出來。然而，高濃度可能導致蛋白質的修飾，導致蛋白質的分解和分子尺寸的減小，使其不易溶解。一般來說，一些研究人員[24]強調0.1 M左右的濃度是某些蛋白粉的最佳提取條件。

與其他提取方法如鹽、酸或堿提取相比，水提取方法被認為效率較低，因此本研究的結果與[25,26]的研究一致，其中水提取蛋白質的效率較低。

本研究的結果也與[27-31]的研究一致，堿液是提取可溶性蛋白的最佳方法之一。[32]的研究結果表明，pH≥10的高堿溶液會增加蛋白質的提取量，因此這與研究結果一致，證實了氫氧化鈉溶液為0.1 N (pH=12)的堿性溶液比水更有效地從豌豆中提取蛋白質。

確定最佳提取比例:圖2和圖3顯示了用0.1 N NaOH (pH=12)和水作為提取液，在45分鍾的時間內對豌豆蛋白提取比例的影響。當分離的豌豆蛋白(IPP)溶劑比從1:10增加到1:25時，氫氧化鈉溶液可提取的蛋白質從1.51 mg/g豌豆總蛋白增加到0.86 mg/g豌豆總蛋白。在質量體積比(1:15及以上)開始時，可提取蛋白質的總含量下降。在IPP:溶劑比高於1:15的情況下，圖2中觀察到的可提取蛋白質的高度顯著(p=0.001)下降可能與從粉末中共提取其他成分有關，這些成分與可溶性蛋白質形成不溶性的複合聚合體，如前麵所述[33]。

圖3顯示了用水作為溶劑對豌豆蛋白質的提取比例的影響。當分離出的豌豆蛋白(IPP):溶劑比從1:10增加到1:40時，可提取蛋白與總蛋白的比例從2.09 mg/g增加到7.52 mg/g。在從(1:15及以上)開始的質量體積比中，可提取蛋白質的總量有所增加。圖2顯示，當IPP:溶劑比超過1:40時，可提取蛋白顯著增加。從上述結果可以清楚地看出，最佳溶劑與粉末的比例與溶劑的類型有關。

圖2:確定了(NaOH 0.1N)溶液提取豌豆蛋白的最佳比例，提取時間為45min。

圖3:確定了豌豆蛋白的最佳提取比例，提取時間為45 min。

溫度對DPS蛋白提取物的影響:從圖4可以看出，當溫度從4℃升高到50℃時，堿性相(NaOH)中可提取蛋白質的含量顯著增加(p=0.001)，從占總蛋白質的0.5 mg/g增加到3.9 mg/g。因此，當溫度從0°C上升到50°C時，蛋白質的增溶性會隨著溫度(50°C)的升高而增加，此時非共價鍵變得不穩定，二級和三級結構[35]丟失。還解釋了蛋白質變性誘導疏水基團之間的相互作用，導致沉澱和降低溶解度。在0°C到60°C之間，疏水相互作用顯著增加，長時間使用60°C或以上的高溫會使蛋白質變性[36,37]，但50°C是IPP蛋白提取的合適選擇。

圖4:用NaOH溶液提取豌豆蛋白的最佳溫度的確定。

圖5顯示了水相中可提取蛋白質的數量。當溫度從4°C升高到35°C時，可提取蛋白質的含量從總蛋白質的2.66%上升到3.68 mg/g，隨後下降(p=0.001)。在25°C和30°C的溫度下，蛋白質的數量也顯著減少。因此，結果表明，不需要將溫度提高到35℃以上，從而導致蛋白質的提取量下降。

圖5:用H2O的解決方案。

提取時間對IPP蛋白提取物的影響:以NaOH和1:40為比例，提取時間對可提取蛋白的影響如圖6所示。可提取蛋白質的量略有下降，從提取時間30分鍾時的1.72下降到提取時間90分鍾時的最大1.40。在30分鍾以上的提取時間內，蛋白質的提取量在統計限度內變得恒定。但IPP提取的最佳時間為30分鍾。

圖6:確定0.1N NaOH溶液提取豌豆蛋白的最佳溫度。

蛋白質提取，使用水相和1:40作為比例，如圖7所示。可見，60 min以上的提取時間對IPP蛋白的提取影響很小。提取時間為60分鍾的平均提取蛋白略有下降，可能是由於蛋白質溶解度可能較低，也可能是由於可溶性蛋白質可能與其他食物成分[38]聚集。

圖7:用H2O的解決方案。

pH值對IPP蛋白提取的影響:不同pH值對分離出的豌豆種子蛋白可提取性的影響如圖8所示。

圖8:豌豆蛋白提取最佳溫度的確定。

在堿性和中性pH值下，IPP中總蛋白提取率較高(P=0.001)，在pH值為7時，IPP中總蛋白提取率為0.69 mg/g (P=0.001)，在pH值為8、9時，IPP中總蛋白提取率分別為0.28和0.22 mg/g，在pH值為10、11和12時，IPP中總蛋白提取率分別為0.66、0.62和0.77 mg/g (P=0.001)。在堿性pH條件下對種子蛋白的最佳提取已有研究。Abu-Tarboush HM等人的研究結果強調，蛋白質的最高提取率木槿sabdariffapH值為11.0。IPP蛋白在pH值為7時含量較高，可能是可溶性蛋白所致。一個結論是大多數IPP蛋白是水溶性的。

種子豌豆蛋白參與(PPP):蛋白是用以下方法參與:改性TCA/丙酮[40]和硫酸銨，丙酮法。共製備了2克豌豆種子蛋白。結果表明，TCA/丙酮(0.98 gm)和40%硫酸銨(0.07 gm)製備的粉末蛋白質含量最高，而actenoe提取的粉末蛋白質含量最低(0.003 gm)。改進的TCA/丙酮方法的參與量的增加可以解釋為在參與過程中去除汙染糖或脂肪分子。然而，由於TCA/丙酮改性方法在最終粉末中得到了最高質量的蛋白質(49% w/w)，該粉末被用於研究蛋白質的finical性質。

改性TCA/丙酮(PPP)對參與豌豆蛋白功能性質的影響

溶解性:豌豆蛋白參與(PPP)的溶解度分布如圖9所示。這包括在pH值2,pH值4,pH值8和pH值10下提取的那些。豌豆蛋白具有可溶性，且PPP的溶解度隨pH值的增加而增加。pH值在pH 2到pH 4範圍內記錄的溶解度最小，在pH 8和pH 10記錄的溶解度較高(p=0.03)。這一結果與Damodaran S等和Tian SJ等[41,42]的結果一致。

圖9:不同pH值對室溫下蛋白質溶解度的影響。

發泡能力和泡沫穩定性:PH和時間對PPP泡沫容量和穩定性的影響分別如圖10和圖11所示。

圖10:PPP泡沫容量。

圖11:PPP泡沫穩定性。

在pH值下，PPP具有最高的發泡能力2在pH值下，PPP的發泡穩定性最高2(圖9)。

發泡穩定性和發泡能力受時間和pH值的影響，如圖9所示，發泡能力在pH值下形成2(78.8%)在pH10時起泡量下降最低(6.5%)(P=0.001)。這與Sathe S等人[43]提到的從羽花豆籽中分離出的蛋白質在高酸性介質中形成的泡沫增加是一致的，他解釋[44]，形成泡沫的能力受pH值的影響。同時,泡沫的穩定性受時間因素的影響,泡沫的穩定性是比例最高的記錄在一個30分鍾的時間在pH = 2,和泡沫容量的百分比是78.8%,在pH值(4、8、10)注意到,減少泡沫能力達到的百分比(38歲,22.8,6.5%),分別,因此可以看出堿度影響泡沫形成的結果,因為它減少了泡沫的形成以及其穩定性。而泡沫容量的增加則是由於蛋白質的電荷增加，然後蛋白質的溶解度和靈活性增加，從而導致蛋白質在界麵(水-空氣)和周圍氣泡處擴散，進而增加泡沫的形成。

泡沫在pH值4,8,10時的最低穩定性可能是由於多糖的存在或由於聚集或變性。

乳化性能的測定:圖12的結果表明，PPP乳化活性較低(3.2%)，但乳化穩定性較高(98.9%)。蛋白質的乳化活性下降可能是由於蛋白質達到電解質點，導致其沉澱，降低其乳化活性。蛋白質的乳化特性是通過吸收水並與水結合而與水形成凝膠結構的重要因素。從而減少了混合物中的遊離水。

圖12:豌豆蛋白的乳化穩定性(A)和乳化性(B)。

對於乳化的穩定性，從結果可以看出，PPP具有較高的穩定性百分比，乳化劑在pH=7的介質中穩定性百分比較高。Keerati-u-rai M等人[45]解釋說，乳劑的穩定性取決於油滴周圍溶解的蛋白質形成帶電層，導致油滴相互排斥。它有一個有效的表麵，具有乳化能力，通過穩定的靜電力在脂滴[46]表麵的穩定性。

吸油吸水能力:PPP的吸油能力(3.2 ml/g)低於吸水能力(4 ml/g)。油脂吸收能力較低(圖13)可能與蛋白質[47]的變性程度有關。

圖13:吸油吸水能力。

如[48]所述，PPP蛋白可作為湯和肉汁的增稠劑。

結論

本研究獲得的豌豆種子的功能特性顯示了其開發不同食品的潛力。本研究結果表明，分離的豌豆蛋白(IPP)含有豐富的蛋白質。為了從豌豆種子中提取蛋白質，本研究結果表明，豌豆分離蛋白含有豐富的蛋白質。為了從豌豆種子中提取蛋白質，必須確定最佳提取條件。研究結果證實，豌豆蛋白的提取需要以下最佳條件:堿性介質中比例為1:10 (g/ml)或水介質中比例為1:40,NaOH (0.5 N)或水介質中比例均為30分鍾，(p H 10-12)， NaOH中比例為50℃或30℃。本研究采用的最佳參與方法為TCA/丙酮法。結果表明:豌豆蛋白的溶解度、水、油處理能力、發泡穩定性、乳化穩定性、乳化能力等。聚丙烯酰胺具有良好的發泡和乳化穩定性，並具有良好的吸水能力，可用於營養和食品配方開發。

致謝

作者要感謝米蘇拉塔大學生物醫學和研究處的幫助。


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條信息

文章類型:研究文章

引用:Elgubbi H, Alajtal A, Dabri N, Aboualkasem S(2022)分離的豌豆蛋白的理化和功能性質的評價。Nutr Food technology開放訪問8(1):dx.doi.org/10.16966/2470-6086.177

版權:©2022 Elgubbi H，等人。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2021年11月11日

  • 接受日期:2022年1月20日

  • 發表日期:2022年1月27日