摘要

從卡裏奧比亞省的不同超市收集了共120份午餐、新鮮生香腸、冷凍包裝肉末和凍肉(各30份)的隨機樣本。收集的樣品在完全無菌條件下直接轉移到實驗室的冰盒中。樣品立即進行細菌學檢查以檢測Salmonellae．的Salmonellae分離株經PCR鑒定。

Salmonellae午餐牛肉樣品中未檢出Salmonellae在新鮮香腸中為10%，分離的serovars為傷寒杆菌(3.3%),美國沙門氏菌感染(3.3%)和美國腸炎(3.3%)。在冷凍包裝的肉糜中，所占的百分比Salmonellae是6.7%，孤立的serovars是傷寒杆菌(3.3%)和美國沙門氏菌感染(3.3%)，而在凍肉中Salmonellae是13.3%和分離的serovars美國papuana(6.7%),美國甲型副傷寒(3.3%)和美國vircho(3.3%)。通過對分離株的聚合酶鏈反應(PCR)進行分子技術鑒定，確定分離株的毒力Salmonellae檢測毒力因子(invA基因)。

關鍵字

午餐;香腸;肉末;冷凍肉;Salmonellae；型;聚合酶鏈反應

簡介

世界衛生組織(世衛組織)認為，食源性疾病是由攝入的食物中的病原體引起的傳染性或毒性疾病。2005年的報告記錄了180萬人死於引起腹瀉的疾病，其中很大一部分是由於食物和飲用水的汙染[1]。Salmonellae食物中毒是世界上最常見和分布最廣的疾病之一，估計在全世界造成13億例腸胃炎和300萬人死亡。

近年來，一些食源性疾病被認為是新興疾病。各種食源性病原體已被確定為食源性疾病。彎曲杆菌、大腸杆菌O157: H7,單核細胞增多性李斯特氏菌而且Salmonellae被發現是大多數食物源性爆發的原因[4]。

香腸、午餐和肉糜等肉製品更受歡迎，因為它們被認為是快速容易準備的肉類食品，解決了許多人無法達到的鮮肉短缺問題。

在從製備、處理、加工、分配和儲存以及銷售的漫長加工過程中，微生物可能會汙染肉製品。這種汙染可能使產品質量低劣，甚至不適合人類消費，有時可能構成公共健康危害。特別是肉類產品被食物中毒細菌汙染的可能性Salmonellae生物體已被廣泛報道。

傳統和常規的微生物病原鑒定方法依賴於特異性的細菌學和生化鑒定[6]，費時費力，準確性較低，且速度慢Salmonellae需要5-7天才能確認其存在於肉製品[8]中。幾種聚合酶鏈式反應(PCR)的測定方法已經發展了不同的靶點Salmonellae基因,如再次(9、10)。的再次基因，是廣泛應用於PCR檢測的靶點沙門氏菌檢測(11 - 13)。

材料和方法

分離和鑒定Salmonellae

采用的技術是根據ICMSF(1978)[14]進行的。培養樣品用於分離Salmonellae麥康基瓊脂上的物種。在37°C孵育24小時後，疑似菌落具有典型的Salmonellae在XLD(木糖賴氨酸脫氧膽酸)瓊脂上繼代培養24 h, 37℃和沙門氏菌誌賀氏杆菌(s.s.)瓊脂板，然後在37°C孵育24小時。

分子識別Salmonellae由PCR分離

根據QIAamp DNA迷你試劑盒說明書提取基因組DNA:根據Lee SH等人的說法，使用Qiagen公司的QIAamp®DNA Mini試劑盒，從37℃XLD肉湯中生長的細菌細胞懸液中提取基因組DNA。[15]。一個來自Salmonellae重懸於3ml XLD液體培養基中，在37°C下生長一夜。在5000 xg的微離心機中離心10分鍾沉澱細菌培養。細菌球重懸在180 μ l的AL緩衝液(QIAamp DNA Mini Kit中提供)中完全裂解。立即冰冷5min，用蛋白酶K(終濃度800 μg/ml) 20 μl在56℃消化3 h，每管加200 μl乙醇(96 ~ 100%)旋渦處理15 s。將混合物加載到QIAamp Mini自旋柱上，以6000 xg的速度離心1分鍾。丟棄濾液，將自旋柱置於清潔的收集管(2ml)中。在QIAamp旋轉柱中加入500 μl AW1洗滌緩衝液，以6000 xg離心1分鍾。使用500 μl洗滌緩衝液AW2重複洗滌2次。在柱中央加入100 μl洗脫緩衝液(AE)洗脫細菌DNA, 37℃孵育5 min，然後在20,000 xg離心1 min。用分光光度計(GeneSys 10UV, Thermo Scientific, USA)測定DNA純度和數量。

寡核苷酸引物對Salmonellaespp。(再次基因):分離出的病原型和毒力基因引物Salmonellaesp .根據Oliveira, et al.[16](表1)。

底漆	序列	放大產品
再次	GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA	284個基點
	TCATCGCACCGTCAAAGGAACC

表1:用於檢測的引物Salmonellaesp。

DNA放大:樣品在BioRad熱循環器(T100-England)中進行，其熱特性如下:在95°C初始變性5分鍾，然後在95°C變性30秒，在60°C退火30秒，在72°C擴展30秒，35個循環，最後一個循環後，混合物在72°C孵育最終擴展10分鍾。

PCR產物檢測參照Sambrook J, et . [17]:擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中檢測，用溴化乙錠預染色，80 V, 1小時。在紫外透光下觀察特異性擴增子，並與標記物進行對比，將凝膠轉移到紫外櫃中，用凝膠文檔係統對凝膠進行拍照，並用計算機軟件對數據進行分析。

結果與討論

在這項工作中，共120個肉製品隨機樣本(30個午餐牛肉樣本，30個新鮮香腸樣本，30個冷凍肉糜樣本和30個冷凍肉樣本)被檢測Salmonellae．分離的血清型經檢測證實毒力再次負責致病性的基因沙門氏菌血清型。

的發病率Salmonellae

Salmonellae在7.5%的肉製品樣品中檢測出。的百分比Salmonellae午餐肉、新鮮香腸、冷凍肉糜和凍肉的比例分別為0%、10%、6.7%和13.3%(表2)。

樣品	不。的樣本	積極的	％
午餐(牛肉)	30.	0	0
新鮮香腸	30.	3.	10
冷凍包裝的肉末	30.	2	6.7
冷凍肉	30.	4	13.3
總計	120	9	7．5

表2:的發病率Salmonellae在檢驗的肉類產品及凍肉樣本中。

表2的結果顯示Salmonellae午餐樣品檢測不出。

這些結果與Gouda HI, Saleh AA, Edris A, Nashed-Heba F, Moussa MM，等，Fathi S，等，Aiedia HA, AbdEl-Aziz A, S，等，Ouf-Jehan M, Eleiwa-Nesreen ZH, Edris AM，等，Abd el - kder - hanaa A，等和Shaltout FA等的報道一致[18-30]。該結果與Mohamed(1988)[31]記錄的結果不一致Salmonellae可以從100個午餐樣本中檢測出，Mohamed K[32]是誰記錄的Salmonellae在10份午餐樣本中可檢出(10%)。

表2所示的結果顯示Salmonellae在10%的新鮮香腸樣品中存在。Edris AM等記錄了類似的結果。[28]。Ouf-Jehan M、Eleiwa-Nesreen ZH和Mohamed FA[26,27,33]得到了幾乎相似的結果，Cabedo L等(11.1)和El-Kader HA等(13.3)[34,29]的發病率均為(8%)。Banks JG等[35](55%)和Shaltout FA等[30](16%)報告的結果較高。Zaki EMS(5%)和Ahmed AAH等(5%)的結果較低[36,37]。一些調查人員未能發現Salmonellae如Vazgecer B等和Ismail AH[38,39]。

從表2報告的結果中可以清楚地看出，6.7%的冷凍包裝肉糜檢測樣本呈陽性Salmonellae．這一結果與Edris AM等和ElKader HA等[28,29]的結果一致。

Abd El-Aziz AS等(5%)和Shaltout FA(6%)[25,40]得到了幾乎類似的結果。Roberts TA等人和Abd El-Atty NS等人[41,42]記錄的結果較低，分別為(2%)。另一方麵，Molla B等(32.7%)、Ejeta G等(14.4%)、Mohamed K(40%)、al - jobori KM等(36%)和Shaltout FA等(40%)[43,44,32,7,30]報道了較高的結果。

Salmonellae在13.3%的凍肉檢測樣本中存在(表2)。El-Kader HA等人[29](10%)記錄了幾乎類似的結果，但al - jobori KM等人[7](40%)和Mahmood NR等人[45]報告了更高的結果SalmonellaeElsayed MS, et al.(18%)[46]。

從表2中記錄的結果可以清楚地看出，冷凍肉的發病率更高Salmonellae其次是新鮮香腸和冷凍包裝的肉末Salmonellae在午餐中沒有發現。

缺席的情況下Salmonellae在午餐肉中可能由於添加了香料和防腐劑等食品添加劑，這些添加劑具有抗菌活性並抑製微生物[47]的生存和繁殖。這也可能是由於在加工和烹飪過程中暴露在高溫下。

高發病率Salmonellae在新鮮香腸中，可能是由於某些屠宰和處理過程中的錯誤，如使用了受汙染的刀、工具、抹布、鋸、板等，以及屠宰場和肉店中不衛生的屠宰、敷料、清洗、運輸、處理和切割，影響了發病率Salmonellae．高發病率Salmonellae在新鮮香腸可能是由於這一事實，該產品是由生肉除了天然腸衣是經常使用在他們的製造和可能作為重要的來源沙門氏菌[48]。

高發病率Salmonellae在冷凍包裝的碎肉可能是由於切割和汙染的肉類，除了增加其水和氧氣的含量，以及汙染來自研磨機，空氣，包裝材料和工人的手。磨削過程中溫度升高(2-4°C)也會增加發生沙門氏菌生物[49]。

的發病率Salmonellae凍肉可能源於不同的受感染接觸的食品操作人員和屠夫，不適當的服裝，糞便手汙染，可能是通過齧齒動物和其他昆蟲或屠宰場的不衛生做法。有機會發展沙門氏菌病的風險是主要由於生存沙門氏菌在非常低的溫度下。它們可能有不同的血清型腸球菌，傷寒杆菌，傷寒杆菌，等[50]。

對被隔離者進行血清分型Salmonellae

從表3記錄的結果可以清楚地看出，3沙門氏菌從新鮮香腸樣品中檢出傷寒杆菌1株(3.3%)，1株(3.3%)為傷寒杆菌美國沙門氏菌感染1株(3.3%)菌株為美國腸炎．

沙門氏菌型	不。	% *	% * *
S.typhi	1	33.3	3．3
S.typhimurium	1	33.3	3．3
美國腸炎	1	33.3	3．3

表3:血清學分型的Salmonellae從檢驗過的新鮮香腸樣品中分離出來(n=30)。
%*=僅從正極收集的百分比沙門氏菌樣品
%**=從全部檢測樣本中收集的百分比

Abd EL-Kader-Hanaa等人[29]也得到了類似的結果傷寒杆菌而且美國沙門氏菌感染每個菌株的百分率為3.3%，但記錄的結果更高美國腸炎這個比例是6.7%。

Rao NM等人[51]在他們可以分離的地方得到了幾乎相似的結果美國沙門氏菌感染而且美國腸炎每個菌株的比例為2.5%，Edris AM等人[28]可以分離傷寒杆菌，傷寒杆菌而且美國腸炎分別為4%，4%和2%，以及Shaltout FA，等。[30]美國腸炎(4%)。

從表4記錄的結果可以清楚地看出，2Salmonellae在檢驗的冷凍包裝肉糜樣品中發現Serovars，並鑒定為1株(3.3%)美國沙門氏菌感染1株(3.3%)菌株為傷寒杆菌。

沙門氏菌型	不。	% *	% * *
S.typhi	1	50	3．3
S.typhimurium	1	50	3．3

表4:血清學分型的Salmonellae從檢驗過的冷凍包裝肉糜樣品中分離出來(no=30)。
%*=僅從正極收集的百分比沙門氏菌樣品
%**=從全部檢測樣本中收集的百分比

這一結果與El-Kader HA等人[29]的結果一致，他們記錄了美國沙門氏菌感染在檢查的冷凍包裝肉末樣品中，這一比例為3.3%。

Edris AM等人[28]在他們可以分離的地方得到了幾乎相似的結果傷寒杆菌(2%)和美國沙門氏菌感染(4%)和Shaltout FA等[30]傷寒杆菌(4%)，但記錄的結果較高美國沙門氏菌感染(8%)。

從表5中記錄的結果可以清楚地看出，3沙門氏菌在檢驗的凍肉樣品中檢出Serovars，其中2株(6.7%)為美國papuana， 1(3.3%)株為美國甲型副傷寒A和1株(3.3%)菌株為美國vircho．Elsayed MS等人[46]報道了更高的結果美國甲型副傷寒8/18(44.44%)陽性樣本檢出A。

沙門氏菌型	不。	% *	% * *
S.papuana	2	50	6.7
S.paratyphi一	1	25	3．3
美國vircho	1	25	3．3

表5:血清學分型的Salmonellae從經檢驗的凍肉樣本中分離出來(n=30)。
%*=僅從陽性沙門氏菌樣本中收集的百分比
%**=從全部檢測樣本中收集的百分比

的識別沙門氏菌通過聚合鏈反應

通過對所有引物的檢測來確定引物的特異性沙門氏菌用引物對靶向invA基因(特異性的所有成員沙門氏菌物種)。

所有的6沙門氏菌用相同引物對在XLD瓊脂和全部瓊脂上選擇富集培養基進行PCR檢測沙門氏菌Serovars陽性擴增出284個bp片段再次如圖1所示。

圖1:瓊脂糖凝膠電泳2%顯示PCR產物再次基因(284 bp)特異於所有沙門氏菌物種。車道(1)至(6):正麵沙門氏菌物種的再次基因。
L道:分子標記DNA階梯(100 bp) (cat。編號:239035)QIAGEN(美國)
跑道Pos:控製良好應變為再次基因
Lane陰性:對照陰性
巷1:沙門氏菌傷寒
巷2:沙門氏菌沙門氏菌感染
巷3:沙門氏菌腸炎
巷4:沙門氏菌甲型副傷寒
巷5:沙門氏菌papuana
巷6:沙門氏菌vircho

目前的研究支持這一特異性引物集確認分離物的能力沙門氏菌．分離株受到沙門氏菌特定的基因(再次)，並被證實為沙門氏菌以284 bp DNA片段預測產物為陽性。本研究的結果與Nagappa K等人、Abd ElKader-Hanaa A等人和Moustafa NY等人[52,29,53]的結果一致，他們可以擴增284 bp的invA基因，該基因對分離株的鑒定和表征具有特異性沙門氏菌種。

的能力沙門氏菌特異性引物檢測沙門氏菌從invA的基因中選擇引物序列，是快速、準確地進行物種分離的主要原因S.typhimurium由Darwin KH，等，Nucera DM，等，和Craciunas C等報道[54-56]。

培養技術被公認為檢測細菌病原體的標準方法，如沙門氏菌在食品中[57]。與基於PCR的方法相比，這些技術通常需要更長的時間，靈敏度更低[55,56]。的使用再次基因特異性PCR方法在大多數診斷和研究實驗室是可能的，通過分子基礎沙門氏菌識別技術中，這種方法是最簡單且成本較低的。

結論

總之，PCR是一種快速、特異的檢測大腸杆菌毒力菌株的方法Salmonellae在肉類產品和冷凍肉類樣品中。它提供了檢測的能力沙門氏菌並在短時間內鑒定分離菌株的毒力，PCR被證明是準確的方法美國血清識別。

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文章類型:研究文章

引用:沙塔特·FA, El-Toukhy EI, Abd El-Hai MM (2019)Salmonellae冷凍肉和一些肉製品Nutr Food technology開放訪問5(1):dx.doi.org/10.16966/2470-6086.155

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出版的曆史:

收到日期:07年3月2019

接受日期:2019年4月22日,

發表日期:2019年4月29日