摘要

從埃及menoufia省不同地方隨機收集了60份新鮮本地牛肉和冷凍進口牛肉(各30份)，利用高效液相色譜法(HPLC)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對其抗生素(土黴素OTC和青黴素)殘留進行評估。在本研究中，在檢查的本地牛肉樣品中，牛四環素或青黴素的抗生素殘留濃度高於進口牛肉，其中5個(16.67%)和3個(10.00%)樣品因殘留含量超過埃及標準化和質量組織記錄的(MRL)而不接受;牛四環素和青黴素分別為200 μ g/kg和50 μ g/kg。相比之下，進口牛肉樣本中記錄的睾酮激素殘留濃度最高，其中5個(16.67%)樣本的睾酮激素殘留水平超過糧農組織/世衛組織推薦的最大殘留限量。不同烹飪方法(煮沸、燒烤和微波)對各類別(n = 5)牛肉的應用表明，烹飪方法顯著降低了OTC、青黴素和睾酮的殘留。結果表明，降低或消除牛肉中抗生素和激素的最有效的烹飪方法是燒烤，其次是微波，然後是煮沸。

關鍵字

抗生素殘留;增長enhancer-hormone;氧四環素;Pencillin

簡介

為控製、預防和治療感染，以及提高動物生長和飼料效率，抗菌素可通過注射、口服飼料或水、局部皮膚、乳房內或宮內注射的方式給動物使用。從理論上講，所有這些途徑都可能導致動物源性食品如牛奶、肉類和雞蛋中出現殘留[1]。土黴素是非洲處方中最主要的抗生素，占病例的41%，其次是β-內酰胺，占18%。食品中的抗生素殘留與公眾對抗生素耐藥微生物傳播、人類過敏反應和腸道菌群失衡的日益擔憂有關。此外，它們的存在可能會影響食品生產行業的發酵過程[3]。一些國家在牲畜中普遍采用合成代謝劑，通過刺激蛋白質合成和提高飼料轉化率來增加肉類產量。在這些國家，最常用的化合物是天然合成代謝劑(睾酮)和合成合成合成代謝劑(醋酸曲勃隆)。在巴西，由於對外部市場和對公眾健康可能存在的風險的規定，這些化合物是被禁止的[4,5]，規定鑒於其致癌潛力及其殘留物和明顯的人類健康風險，歐洲共同體禁止在家畜飼養中使用類固醇作為生長促進劑。烹飪肉類有許多常見的方法;最受歡迎的是煮、微波或燒烤。 However, grill was found to be the sole cooking method that reduced sex steroid hormone residues in meat with a level of reduction approached 31% of that found in raw non cooked meats [6]. Due to the excessive use of antibiotics in raising fattening animals for human consumption and the implementation of growth promoters in some animal farms, our study focus on the monitor of residues of such chemical compounds to figure out if these residues fall in the accepted MRLs and measuring the effect of various popular cooking method in reducing or elimination of such residues in meat. Moreover the observed findings may be helpful in confirming and selecting the ideal method for cooking so as to effectively reduce antibiotic and hormone residues in meat prior to consumption.

材料和方法

第1部分:抗生素和激素殘留量的測定

60塊新鮮的本地和冷凍的進口巴西牛肉的肌肉樣本(大腿肌肉);其中30個是從埃及Menofia省不同地方的不同超市購買的。這些樣本是在其有效日期內的不同時期收集的。每一份采集的樣本分別放置在幹淨的無菌聚乙烯袋中，並盡快用冰盒轉移到實驗室，以評估其中的一些抗生素和激素殘留。

牛肉樣品中抗生素殘留量的測定

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測土黴素和青黴素的殘留量。

土黴素[7]含量的測定

從樣品中提取藥物:所有標本在切除外脂肪和筋膜後，用剪刀細切。每兩克待分析的肉樣本被切成非常小的塊，然後用薩多利斯絞肉機磨成細顆粒。然後在攪拌機中均勻化2分鍾，然後加入0.1 g檸檬酸。在混合物中分別加入硝酸1 ml(30%)、甲醇4 ml和去離子水1 ml。將含有固體顆粒的懸浮液放入渦流中充分混合，在超聲浴中保持15分鍾，然後以5300 rpm的轉速離心10分鍾。通過0.45µ尼龍濾網過濾後，20µl的清液注入HPLC進行分析。

色譜條件:甲醇和甲酸(0.1%)的流動相采用梯度法，流速為1.5 ml/ min, 25°C。色譜柱為Hypersil gold C18(10µm, 100 × 4.6 mm)，流動相如上所述。PDA檢測器設置在350 nm波長處進行檢測。通過軟件(Chromo Quest 5)自動外推曲線下的麵積，得到並計算樣品中殘留物的定量。

校準曲線:以10、20、30、40、50、60µg/L的土黴素洗脫液製備曲線。這些標準品是從日常準備的原液中製備的，並對100mg土黴素標準品進行精確稱量，放入100ml容量瓶中。將粉末溶解在100毫升甲醇中製成原液。土黴素的檢出限為0.01 ppm，保留時間為3.9 min。根據土黴素工作溶液的校準曲線計算樣品中抗生素殘留濃度。為了製備工作溶液，使用甲醇作為稀釋劑，將抗生素的原液(1 mg/ml甲醇)鹽酸土黴素(Sigma Aldrich, Inc.， St. Louis, MO, USA)稀釋到幾個濃度。

青黴素殘留量的測定

從樣品中提取藥物:準確地說，5克樣品被放入50毫升蓋住蓋子的聚丙烯離心管中，並在其中加入15毫升乙腈/水(15:2)混合物。以4000轉/分鍾的速度離心，使樣品完全均勻化1分鍾。取上清液重複均質和離心一次。此外，將組合上清液放入圓底燒瓶中，乙腈在37°C下蒸發。至少，在燒瓶中應該找到大約6毫升的剩餘上清。使用磷酸鹽緩衝液(pH值8.5)時，上清液的總容積應達到20毫升。上清通過再生纖維素過濾，25mm, 45甕注射器過濾器(Agilent引腳5185-5831)。實際上，10毫升的提取物被裝在安捷倫Sampli Q OPT 6毫升/150毫克的藥盒上

淨化[9]:用0.1%的甲酸在水中洗滌，然後用(pH 8.5)磷酸鉀緩衝液洗滌。最後，用3ml乙腈洗脫樣品。樣品用13mm, 45ml聚四氟乙烯(PTFE)注射器過濾器過濾(安捷倫引腳518-5836)。淋洗液在氮氣下室溫幹燥。殘渣在流動相中重新懸浮至1.0 ml。樣品旋轉2分鍾，然後轉移到2ml的自動進樣瓶(Agilent引腳5182-0864)。

固相萃取(SPE)和最終樣品製備:固相萃取管置於真空歧管係統中，固相萃取管流出液進入溶劑阱。準確地說，25毫升甲醇，25毫升水，然後加入40毫升0.01 M氫氧化鈣。流速對於這些步驟來說並不重要。此外，3ml的樣品應用於墨盒，流速不超過2滴。這一步不允許墨盒幹燥。用40毫升蒸餾水和10毫升乙腈衝洗藥筒。用40 ml含50%甲醇的2.5%醋酸洗脫。收集的洗脫液在45°C旋轉蒸發器蒸發，直到完全幹燥。幹燥後的殘渣在3ml流動相中被重組。樣品經0.2 μ m過濾器混合過濾後注入LC體係。

HPLC固相分離青黴素:用於抗生素測定的高效液相色譜(HPLC)是在德國Waldbronn Agilen Technologies的Dokki動物衛生研究所的Agilent 1100高效液相色譜係統，配備第四泵型號G 1311A，紫外檢測器(型號G 1314A)設置在254 nm波長，自動進樣器(型號G1329A v - ods)和Shim包裝(150 × 4.6 mm)柱(日本京都島津)。

試劑盒中試劑和材料(EIA甲基睾酮2小時手冊試劑盒)

樣品的製備:在1克均質牛肉樣品中，加入1毫升67毫米磷酸鹽緩衝液(pH值7.2)，用力搖5分鍾。

提取的樣品:準確地說，提取5 ml叔丁基甲基醚(TRME)，在搖晃30-60分鍾後，以3000轉/分離心10分鍾。將上清轉移到另一個管中，用5ml叔丁基甲基醚重複提取。醚相在40°C時聚集並減少到幹燥。用1毫升甲醇/蒸餾水(80/20)溶解殘渣。樣品在60°C蒸發至幹燥。再用200 μ l乙醇和1.8 ml稀釋緩衝液溶解。(樣品中的甲基睾酮濃度=提取物中的甲基睾酮濃度× 4)

試劑的製備

應用試劑盒所推薦的技術進行了試驗。提供濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2ng /ml的標準液和空白液，構建標準曲線。

第二部分:實驗部分(熱處理)

目前工作的主要目的是調查某些常見的烹飪方法對抗生素和激素殘留濃度的影響。因此，5份含有低、中(接近允許限度)和高濃度土黴素、青黴素和睾酮的陽性牛肉樣品接受了家庭使用的各種烹飪方法。樣品重10 gm，厚度2.5 cm，芯溫71.5℃。因此，對被證實含有土黴素、青黴素和睾酮殘留的陽性樣品進行100°C煮沸30分鍾、200°C燒烤15分鍾、180°C微波10分鍾的處理，以確定每種烹飪方法對這些嚴重殘留的穩定性的影響。

結果與討論

根據Feldmanet et al.[11]，應用學生t檢驗對所得結果進行統計評價。

表(1)和圖(1)的結果顯示，經檢驗的進口牛肉和本地牛肉樣品中，分別有10%和36.67%檢出土黴素(OTC)殘留。進口牛肉的OTC殘留含量(g/kg)為12.7 ~ 56.0，均值為35.1±2.24;國產牛肉的OTC殘留含量(g/kg)為17.5 ~ 601.8，均值為212.5±14.96。進口牛肉與國產牛肉檢驗樣品間差異極顯著(P<0.01)。根據埃及標準化和質量組織“EOSQ”第3692號規定，肉類中OTC的最大殘留限量為200 μ g/kg。(表1)和(圖2)表明，進口牛肉樣品中OTC殘留在允許範圍內的樣品被接受，而檢測的本地牛肉樣品中16.67%的樣品不被接受。本研究結果與Olatoye、Ehinmowo和Mehran等[12,13]記錄的三頭肌樣品中tc總殘留平均值為176.3±46.8µg/kg的結果在一定程度上一致。Muriuki等人[14]獲得了更高的結果，他們記錄了肯尼亞Athi河樣品的平均tc水平為280 μ g/kg。然而，Adesokan等人[15]記錄的結果較低，肌肉中OTC殘留的平均量為16.17±5.52µg /kg。四環素類藥物對各種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌具有廣泛的活性，而且價格低廉，因此在獸醫中廣泛用於預防和治療幾種疾病和促進牛[16]的生長。非處方食品的殘留物可能對消費者的健康構成威脅，這取決於食品的種類和殘留物的數量。攝取亞慢性非處方藥暴露水平導致的人體健康問題包括胃腸道紊亂[17]。 OTC residues possessed a teratogenic risk to the fetus with allergic reaction [18] and help in development of resistant pathogens for human and animals [19]

圖1:國產和進口牛肉樣品中土黴素、青黴素和睾酮濃度的平均值(µg/kg)

		進口牛肉	當地的牛肉
積極的樣品	不。	3.	11
	％	10	36.67
最低		12.7	17.5
最大		56	601.8
均值±東南部		35.1±2.24	212.5±14.96 + +
推廣/(µg /公斤)		200	200
接受樣品	不。	30.	25
	％	One hundred.	83.33
未被接納的樣品	不。	0	5
	％	0	16.7

表1:根據土黴素殘留量(µg/kg)對國產和進口牛肉檢驗樣品的統計分析結果和可接受性(n = 30)。
++ = t檢驗，差異極顯著(P< 0.01)。

(表2)和(圖1)的結果表明，分別有26.67%和23.33%的進口和本地牛肉檢測樣品檢出青黴素殘留。進口牛肉的青黴素殘留量(µg/kg)為3.6 ~ 24.1，均值為12.10±0.93;國產牛肉為5.9 ~ 71.3，均值為36.57±4.08。進口牛肉與國產牛肉檢驗樣品間差異極顯著(P<0.01)。根據“EOSQ”No. 3692(2008)[20]的建議，肉類中青黴素殘留的最大MRL為50µg /kg，因此表(2)和圖(2)顯示，當青黴素殘留在允許範圍內時，進口牛肉的檢測樣品被接受，而10%的檢測本地牛肉樣品不被接受。目前的結果與尼日利亞西南地區的Adesokan等人[15]報道的一致，他們報告說，每個肉類標本中含有可檢測到的peng水平，平均值為11.67±2.94µ/kg。尼日利亞的Ibrahim等人[21]報告了較低的百分比，他們發現peng殘留陽性樣本為14%。值得注意的是，經檢查的本地牛肉樣本含有可檢測到的OTC或PEN殘留。G.這可能是由於這兩種抗菌素是埃及特別是非洲畜牧業工人最常使用的藥物之一。這一發現與最近在南非進行的一項調查報告一致(Eagar and Van, 2012)[22]。其中tc構成了第二大抗微生物藥物和PEN。G是大多數出售的腸外劑型。

圖2:本地及進口牛肉樣本中殘留土黴素、青黴素及睾酮的可接受程度

		進口牛肉	當地的牛肉
積極的樣品	不。	8	7
	％	26.67	23.33
最低		3.6	5.9
最大		24.1	71.3
均值±S。E *		12.10±0.93	36.57±4.08 + +
最大殘留限(µg/kg)*		50	50
接受樣品	不。	30.	27
	％	One hundred.	90
未被接納的樣品	不。	0	3.
	％	0	10

表2:國產和進口牛肉檢樣中青黴素殘留量(µg/kg)的統計分析結果和可接受性(n = 30)。
++= t檢驗，差異極顯著(P<0.01)。

(表3)和(圖1)顯示，在進口牛肉和本地牛肉的檢測樣本中，睾酮殘留率分別為76.67%和73.33%。進口牛肉睾酮殘留量(µg/kg)為0.014 ~ 0.605，平均值為0.133±0.008;國產牛肉睾酮殘留量(µg/kg)為0.011 ~ 0.047，平均值為0.026±0.002。進口牛肉與國產牛肉檢驗樣品間差異極顯著(P<0.01)。FAO/WHO(2004)[23]建議肉類中睾酮殘留的最大殘留限量為0.100µg/kg，因此，表(3)和圖(2)表明，16.67%的檢驗進口牛肉樣品不被接受。相比之下，檢測的本地牛肉樣品中睾酮殘留在允許的限度內。目前的結果與Oveisi et al.[24]在德黑蘭的記錄一致，他們揭示了牛肉睾酮的平均濃度水平為0。810 uµg /公斤。阿曼蘇丹國的Mahgoubet al.[25]記錄的結果較低，肉樣品中睾酮殘留的最大值為0.05µg/kg，而Zeitoun和Ahmed[6]記錄的結果較高，肉樣品中睾酮殘留的平均值為1.8602±0.1148µg/kg。意大利從1961年開始禁止使用激素，丹麥從1963年開始，德國從1977年開始禁止使用激素。比利時和希臘從未允許為增肥目的使用激素。然而，西班牙、英國、法國和荷蘭允許使用大多數激素來加速肉牛[26]的生長，因此檢查的進口牛肉樣品中有高濃度的睾酮殘留。 The effect of different cooking methods on the oxytetracycline, penicillin and testosterone residues in beef was shown in (Table 4) and (Figure 3) which showed that the mean concentrations of tested control samples of oxytetracycline, penicillin& testosterone residues were 283.78, 45.48and 0.32 µg/kg ,respectively , by application of different cooking methods(boiling ,grilling and microwave) the reduction percentage were 74.54%, 96.9% &77.54%; 90.5%, 98.28% & 96.08 % and 64.74 %, 92.38% & 78.52% for oxytetracycline, penicillin and testosterone residues respectively. The lower results were reported by Zeitoun and Ahmed [6] who recorded that the reduction percentage of testosterone residues were 29%, 23% and 19% for grilling, microwave and oven, respectively. Cooking time and temperature are two main factors which affect antibiotic residues in meat, where in some cooking procedures, sufficient heating temperature and time can reduce several antibacterial drug residues although it does not generally provide an additional margin of safety for consumers [27]. It is concluded that the most preferable methods of cooking for reducing antibiotic and hormone residues on meat were grilling followed by microwave and boiling .To safeguard consumers from the risk of such residues proper use of antibiotics through good diagnosis of the diseases by experienced veterinarians and creation of legislation of compulsory following the rules of withdrawal time of the antibiotic and hormone. Control of antibiotic and hormone residues by heat treatment by cooking processes that have a higher temperature and longer time should be done to inactivate antibiotic and hormone residues in meat and it is advised that meat broth should be discard in order to reduce exposure to residues as the most of antibiotic and hormone residues during boiling procedure excreted from tissue to cooking fluid.

圖3:不同烹調方法(蒸煮、微波和燒烤)對牛肉中土黴素、青黴素和睾酮殘留量的影響(還原%)。

		進口牛肉	當地的牛肉
積極的樣品	沒有	23	22
	％	76.67	73.33
最低		0.014	0.011
最大		0.605	0.047
均值±王新宏*		0.133±0.008	0.026±0.002 + +
最大殘留限(µg/kg)*		0.100	0.100
接受樣品	沒有	25	30.
	％	83.33	One hundred.
未被接納的樣品	沒有	5	0
	％	16.67	0

表3:國產和進口牛肉檢測樣品睾酮殘留量(µg/kg)的統計分析結果和可接受性(n = 30)。
++= t檢驗，差異極顯著(P<0.01)。

試驗			1	2	3.	4	5	均值±王新宏*
控製		氧四環素	48.3	198.5	256.1	314.2	601.8	283.78
		Penicllin	10.4	29.7	52.9	63.1	71.3	45.48
		睾酮	0.012	0.098	0.392	0.489	0.605	0.32
沸騰 (100°Cfor 30分鍾)。	內容	氧四環素	0	7.8	69.4	127.5	335.2	107.98
		Penicllin	0	0	2．2	10.6	18.9	6.34
		睾酮	0	0	0.185	0.297	0.414	0.179
	減少%	氧四環素	One hundred.	96.1	72.9	59.4	44.3	74.54
		Penicllin	One hundred.	One hundred.	95.8	83.2	73.5	90.5
		睾酮	One hundred.	One hundred.	52.8	39.3	31.6	64.74
燒烤(200°Cfor 15分鍾。	內容	氧四環素	0	0	0	5.3	82.6	17.58
		Penicllin	0	0	0	1.7	4.2	1.18
		睾酮	0	0	0	0.061	0.155	0.043
	減少%	氧四環素	One hundred.	One hundred.	One hundred.	98.3	86.2	96.9
		Penicllin	One hundred.	One hundred.	One hundred.	97.3	94.1	98.28
		睾酮	One hundred.	One hundred.	One hundred.	87.5	74.4	92.38
微波(180°Cfor 10分鍾。)	內容	氧四環素	0	0	13.8	47.1	119.5	36.08
		Penicllin	0	0	0	3.8	9.6	2.68
		睾酮	0	0	0.099	0.184	0.269	0.110
	減少%	氧四環素	One hundred.	One hundred.	94.6	85	80.1	77.54
		Penicllin	One hundred.	One hundred.	One hundred.	93.9	86.5	96.08
		睾酮	One hundred.	One hundred.	74.7	62.4	55.5	78.52

Table4:不同烹調方法對牛肉中土黴素、青黴素和睾酮殘留量的影響。

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文章類型:研究文章

引用:Elbagory AM, Edris AM, Muhammad KM(2017)進口和本地生產牛肉中抗生素和生長促進激素的殘留研究。Nutr Food technology開放訪問3(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-6086.140

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出版的曆史:

收到日期:2017年1月23日

接受日期:2017年3月13日

發表日期:2017年3月18日