魚油溶解他汀類藥物:創新配方的多功能和簡單組合

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研究文章

摩斯Santaniello朱塞佩尼^＊

西格瑪- tau工業研發中心，Farmaceutiche Riunite S.p.A, Via Pontina Km 30,400。I-00071，羅馬，波米齊亞，意大利

*通訊作者:Giuseppe Giannini, Sigma-Tau industrial Farmaceutiche Riunite S.p.A, Via Pontina Km 30,400。I-00071，羅馬，波米齊亞，意大利，電話:39-069-139-3640;電子郵件:giuseppe.giannini@sigma-tau.it

摘要

血脂異常或高脂血症主要包括高甘油三酯血症和/或高膽固醇血症;由於人們認為對它們的控製會對公共衛生產生影響，這一點現已得到充分證實。因此，在一個過度擁擠的領域，尋找降低血液中膽固醇和甘油三酯水平的適當答案，我們在這裏報告了配方研究的發現，旨在聯合他汀類藥物和n-3 PUFA，克服與溶解度和穩定性相關的缺陷。一種新的配方已經被製造出來，它可以使他汀類藥物(如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀)完全溶出。對於辛伐他汀，也需要用分子篩進行初步脫水，以達到穩定的目的。這些發現是非常重要的，可以廣泛應用於所有的情況下，共同給予兩種有效的治療成分例行公事。

關鍵字

魚油;n3-PUFA;他汀類藥物;穩定液配方;他汀類藥物增溶;離子乳化劑

縮寫

PUFA: Omega-3多不飽和脂肪酸;心血管疾病:心血管疾病;衛生組織:世界衛生組織;β-:3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA;DHA:二十二碳六烯酸;環保局:二十碳五烯酸;LC/PDA/MS:液相色譜/光電二極管陣列/質譜;HPLC:高效液相色譜法;DAD:二極管陣列檢測器;聚四氟乙烯過濾器:Phenex^®聚四氟乙烯^®過濾器;RH:相對濕度;INN:國際非專有名稱;LDL:低密度脂蛋白;SGF:模擬胃液;SIF:模擬腸液

簡介

西方人口的久坐生活方式與高熱量和高脂血症飲食的使用密切相關，是心血管疾病(CVD)的重要危險因素之一，心血管疾病是世界上主要的死亡原因。

西方的生活方式及其向世界範圍內越來越多的人的傳播，正日益引起世界衛生組織(WHO)的擔憂。世衛組織最近公布，從現在到2030年的框架時間內，缺血性心髒病和腦血管疾病將分別排在死亡人數的第一位和第二位。幸運的是，心血管疾病以及2型糖尿病、癌症和其他可怕的疾病是可以通過適當的幹預措施來減少危險因素的影響來預防的。血脂異常是CVD的重要危險因素，表現為血漿脂蛋白濃度升高或降低[1,2]。因此，血脂異常是一個極其重要的公共衛生問題，不僅給個人及其家庭帶來了巨大的成本，也給衛生保健係統帶來了巨大的負擔。控製血液中的甘油三酯和膽固醇水平是預防血脂異常最常見的做法之一[3,4]。他汀類藥物是上個世紀在治療和商業上最成功的一類藥物，用於降低血液中的膽固醇水平，而主要是魚油的PUFAs(-3多不飽和脂肪酸)被廣泛用於降低甘油三酯。

通常情況下，對於膽固醇和甘油三酯水平較高的患者，醫生會以不同的劑量開出他汀類藥物和PUFAs，並根據具體情況進行評估，這就是為什麼這些藥物沒有固定劑量的組合[5,6]。第二個原因是由於技術限製:他汀類藥物在魚油中的溶解性通常很差，而且不穩定。為了消除這一切，人們提出了不同的技術，主要是基於他汀類藥物在魚油[7]中混合之前的微膠囊化。

在此，我們報道了一項旨在開發魚油中他汀類藥物穩定液體溶液製備技術的研究項目的結果。

他汀類藥物

HMG-CoA(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a)還原酶是膽固醇合成代謝途徑中的一種重要酶，他汀類藥物作為其抑製劑的發現，是預防高膽固醇血症及相關疾病的一個突破。到目前為止，臨床證據[8]已經充分證明了這一點。市場上的他汀類藥物全部或部分來自發酵(洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀)或完全合成(阿托伐他汀、羅伐他汀、匹伐他汀和氟伐他汀)。所有的他汀類藥物都是相對不穩定的，它們的降解是由氧氣、濕度、酸度和溫度等多種因素催化的。

本文的目的不是根據不同的他汀類藥物的吸收和生物利用度、藥代動力學和代謝進行分析，而是根據他汀類藥物的化學結構對魚油配方中的不同限製進行描述。他汀類藥物可分為兩類:A型(十卡林環衍生物)和B型(氟苯基衍生物)。另一個重要參數是內酯形式(封閉的，前藥物)或陰離子羧酸鹽形式(開放的;(表1)。考慮到這些信息，研究人員研究了兩種類型的少數他汀類藥物在魚油溶液中的溶解度和穩定性。

表1:目前市場上的他汀類藥物，根據其化學結構分類。INN(國際非專有名稱)和商號。據報道，降低低密度脂蛋白(低密度脂蛋白或“壞膽固醇”)的典型劑量為25-45%。

魚油

海洋和淡水魚油是omega-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)的主要來源，主要由DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)組成，它們被發現以劑量依賴性的方式調節脂質代謝和降低血液甘油三酯水平，顯示出在預防心血管事件方麵的有益作用。根據一級和二級預防研究，食用omega-3脂肪酸、魚和魚油可以降低所有原因的死亡率和各種心血管疾病的結果，如猝死、心髒性死亡和心肌梗死，證據主要支持魚和魚油補充劑[9]。在文獻中可以找到許多例子，說明食物或膳食補充劑中的n-3多不飽和脂肪酸對幾種疾病的預防和治療具有積極作用，但這不是本文的主題。鼓勵有興趣的讀者參考最近的評論，以獲得更廣泛的理解這一領域[10-12]。

魚油中的他汀類藥物

在此，我們報告了一項含n-3 PUFA和他汀類藥物的流體配方(溶液)的研究結果;盡管多篇論文已經記錄了他汀類藥物與PUFA(魚油)的協同作用[13- 18]，但我們也知道，某些他汀類藥物對酸性環境敏感，導致其降解為內酯形式和各種異構體。例如，普伐他汀、阿托伐他汀和氟伐他汀在酸性環境中轉化為內酯形式;同時，內酯形式的他汀類藥物，如洛伐他汀和辛伐他汀，對堿性環境敏感，導致其轉化為酸性形式。另一方麵，魚油也容易氧化，迫使使用抗氧化劑來防止酸敗。綜合來看，將他汀類藥物和魚油結合起來是一項特別困難的任務。所以，為了結合這兩個活性原理必須克服兩個臨界點，溶解度和穩定性。

已經報道了三種劑型:溶液劑型、懸浮液劑型和固體劑型。然而，為了保護組件不受可能的降解，大多數都采用了至少一種組件的微膠囊化技術。他汀類藥物通常很難在魚油中溶解，這與它們的生物利用度差有關;在微膠囊化的配方中，觀察到它們的生物利用度進一步降低。因此，為了克服這些限製，使用齊次解可能是有用的。為了在魚油中製備他汀類藥物的溶液，必須克服其溶解度差的限製，特別是對最新一代的他汀類藥物。事實上，辛伐他汀在魚油中的溶解度為11mg/ml，而阿托伐他汀(鈣鹽)的溶解度<0.1 mg/ml。在這兩種情況下，溶解度都遠遠不適合獲得最佳治療劑量。第二個缺點是穩定性:辛伐他汀在魚油中的溶液是不穩定的。

因此，本研究的目的是確定輔料和/或一種技術，以提高他汀類藥物在魚油中的溶解度和穩定性。通過對一套乳化劑和助溶劑的係統測試，得到了以磷脂酰膽堿為主要成分的純化大豆卵磷脂的最佳效果。溶解和穩定的過程很可能是由於反向膠束的形成。事實上，卵磷脂中的疏水介質被組織成反膠束，其中疏水鏈在外部，極性殘基在內部。這些係統可以改善他汀類藥物的溶解度。辛伐他汀比其他藥物更容易溶解，需要克服的主要問題是穩定性。解決這個問題的方法是在分子篩上對溶液進行脫水。

材料和方法

-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)是多不飽和脂肪酸乙酯的混合物，EPA和DHA的含量大於85%，EPA/DHA的比值在0.9 ~ 1.5之間;產品由Pronova Norway提供。本研究中使用的他汀類藥物均為市售藥物:阿托伐他汀鈣無定形鹽和辛伐他汀，由Biocon(印度)公司生產;瑞舒伐他汀鈣無定形鹽，Biocon(印度);匹伐他汀由MSN實驗室Pvt. LTD(印度)生產。聚氧乙烯(20)山梨醇單油酸酯(Tween^®80)和docusate鈉，從Sigma-Aldrich購買;聚氧乙烯甘油三羥基硬脂酸酯(Cremophor)^®RH 40)和聚乙二醇(15)羥基硬脂酸酯(Solutol^®HS 15)，由巴斯夫意大利公司生產。甘油酯和聚乙二醇酯的混合物^®)， 2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇(Transcutol^®P)和單月桂酸丙二醇(月桂醇^®90)，從Gattefossè Italia, S.r.l(意大利米蘭)購買。氫化磷脂酰膽堿(Epikuron^®200 SH)和脫油濃縮卵磷脂磷脂酰膽堿(Epikuron)^®200)使用的均由嘉吉提供，固體天然卵磷脂(Lipoid S PC-3)由Lipoid GmbH提供。

LC / PDA / MS

采用二極管陣列檢測(DAD)與質譜聯用的高效液相色譜(HPLC)儀器對他汀類藥物和魚油成分進行定量分析。液相色譜儀由以下模塊化組件組成:Alliance係統2695,Waters 2996光電二極管陣列和Waters Quattro Micro (Waters USA)質量係統。

LC條件為辛伐他汀，阿托伐他汀，瑞舒伐他汀

HPLC柱為Intersil^®ODS-3 (4.6 × 250 mm;5µm)色譜柱，流動相為乙腈、水、三氟乙酸(70:30:10 .1,v/v/v)。對於匹伐他汀，乙腈，水和三氟乙酸(30:70:0.1,v/v/v)。所用的流速為1ml/min(表2)。

-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)的高效液相色譜法

高效液相色譜柱為Waters symmetric C-18 4.6 × 150 mm 5µm (Waters USA)。流動相為乙腈、甲醇、水和三氟乙酸(45:45:10:0.1,v/v/v/v)。所用流量為1 ml/min。在λ=215 nm處對EPA和DHA進行紫外檢測和定量(圖1)。

含非離子表麵活性劑的配方(比較實例)

非離子表麵活性劑親水端不帶電荷，這有助於使它們成為優良的含油土壤乳化劑。在本研究中，月桂醇^®90年,漸變^®80年,Cremophor^®RH40, Labrasol^®使用Solutol®HS15作為非離子表麵活性劑。將乳化劑溶解在n-3 PUFA中，機械攪拌。然後加入他汀類藥物(即阿托伐他汀)，評估溶液外觀。所使用的乳化劑都是已在批準的藥品中使用的輔料，並可在市場上獲得。在某些情況下，輔表麵活性劑(即Transcutol)^®在第二步中加入P)以進一步提高阿托伐他汀的溶解度(表3)。

含有離子表麵活性劑乳化劑的配方(docusate鈉- Epikuron)^®200)

這些表麵活性劑(陽離子或陰離子)乳化劑在極性端帶有電荷。乳化劑直接溶解在n-3 PUFA中，機械攪拌。然後加入他汀類藥物(即阿托伐他汀)，評估溶液外觀(表3)。

與低可溶性他汀類藥物(如阿托伐他汀)，協同表麵活性劑如Transcutol^®在第二步中加入P，以進一步提高溶解度，然而，沒有達到這個目的。

溶解度測試程序

對於阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、吡伐他汀和辛伐他汀這四種他汀類藥物，在魚油中達到的最大濃度也通過另一種方法計算:在n-3 PUFA (1 ml)中加入越來越多的他汀，直到形成沉澱物為止。攪拌18小時後，用0.22 m PTFE過濾器過濾，采用高效液相色譜法進行分析，方法參照上圖(圖2)。結果彙總見(表4)。

圖1:l=215nm分析n-3 PUFA的色譜譜。a)有兩個主峰:在19.08 e 23.25 min。b)第一個分離峰對應EPA EE (EPA乙基酯)，ESMS為ES+ m/z 331.36;c)次之為DHA EE (DHA乙酯)，ES- ms: ES+ m/z 357.37。

表2:分析了n-3 PUFA中溶解的他汀類藥物的最大含量。Intersil®ODS-3 (4.6 × 250 mm;5 μ m)柱，洗脫液為CH3 / h2 / O(70/30 + 0.1%的CF3COOH)或CH3 / h2 / O(30/70 + 0.1%的CF3COOH)，流速為1ml/min。
^:辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀的高效液相色譜法
*:匹伐他汀的高效液相色譜法
°:結果是至少兩個獨立實驗的平均值。±SD < 10%。

表3:他汀類藥物(阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀和辛伐他汀)和魚油(n-3 PUFA;0.9 g)，在10%的共溶劑存在下。

穩定性測試

在初步穩定性測試中，樣品被放置在5ºc、25ºc和40ºc、相對濕度(RH)為60%的氣候室中。溶液的穩定性(通過目測得到的清晰溶液)被監測了長達6個月(第1、3和6個月)。取適量配製的魚油用甲醇稀釋，用高效液相色譜法進行分析(表5)。

為了增加穩定性

為了增加穩定性，在辛伐他汀溶液中加入少量(10%)己二酸和棕櫚酸或檸檬酸。然而，上述酸的存在並沒有提高穩定性(表6)。

分子篩幹燥魚油溶液。分子篩(0.4 nm，珠約2 mm)在150℃的真空下活化18小時，然後加入到溶液中，在不進行機械攪拌的情況下放置一夜。油溶液經倒液後得到。穩定性測試給出了令人驚訝的結果，如表7所示。

結果與討論

本研究的目的是製備魚油中他汀類藥物的均相溶液，以克服其保留溶解度和不穩定性的挑戰。

已經測試了不同的乳化劑，證明他汀類藥物幾乎不溶於魚油，如阿托伐他汀，瑞舒伐他汀或匹伐他汀，添加離子乳化劑，如Epikuron^®200或多士酸鈉，顯著增加其溶解度，達到濃度大於20 mg/ml(表格12和13;20和21;26日和27日)。兩者的混合同樣有效(表格28)。這樣的濃度至少比用非離子表麵活性劑-乳化劑(Tween 80, Cremophor)配製的類似溶液大10倍^®RH40, Solutol HS 15, Labrasol等)，反過來，即使添加表麵活性劑(即Transcutol^®P, 20%;數據未顯示)(表3和表4)。

圖2:辛伐他汀溶解度試驗

對於更多可溶性的他汀類藥物，如辛伐他汀，離子和非離子表麵活性劑的作用也得到了驗證。結果表明，不同溶劑所達到的最大溶解度在相同的範圍內(表29- 31,33,34)(表7)^®200溶解度隨離子乳化劑添加量的增加而成比例增加(見S.I.中的例子):添加20%的Epikuron^®溶解度達到70 mg/ml (Form 32);對於非離子溶劑，Transcutol^®P和Lauroglycol^®90，盡管使用了更多的溶劑，溶解度並沒有增加(表3和4)。

從這項研究中可以清楚地證明，要溶解他汀類藥物，尤其是那些在魚油中難以溶解的藥物，離子乳化劑，比如Epikuron^®200和多克酸鈉，都是必需的。用辛伐他汀，加入20%的埃匹庫隆^®大大增加其溶解度，高達70毫克/毫升。最新一代的他汀類藥物的效果甚至更大，因為它的可溶性較低，其中含有離子乳化劑的配方的溶解度增加了高達2 Log單位:見表格1 vs.表格12和13;表格2 vs.表格20和21;表格3 vs.表格26和27(表4)。

總之，新的他汀類藥物(如阿托伐他汀)在魚油中的最大溶解度極低(<0.1 mg/ml)，而生長抑素在魚油中的溶解度較高(約11 mg/ml)，但沒有治療價值。在這裏，我們清楚地證明了在穩定的溶液中增加所有他汀類藥物的溶解度以達到治療劑量(≥20 mg/ml)的可行性。

關於穩定性的章節，對這些新提議的配方進行了兩個主要方麵的監測:n-3 PUFA的降解和他汀類藥物的穩定性。魚油主要由兩種n-3 PUFA (EPA和DHA)表示(>85%)，如圖1的色譜譜圖所示。在這裏提出的所有配方中，魚油降解的結果都不顯著(表5)。在同一表中，他汀類藥物與Epikuron的穩定性數據^®200(表格12,20,26和31)或與多士酸鈉(表格13)，監測在5ºC, 25ºC和40°C，長達6個月。室溫下，遊離酸形式的他汀類藥物，阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀，唯一降解產物為封閉內酯衍生物(10%;±3)。此外，內酯形式的他汀類藥物，即辛伐他汀，唯一降解產物是打開的內酯衍生物(5%;±2)。(S.I圖1)所有他汀類藥物在5°C下隨訪一個月顯示完全穩定。魚油溶液中遊離酸形式的他汀類藥物隻導致很小比例的內酯(<5%)(表12,20,26)(表5)。

一項關於辛伐他汀的獨立研究已經完成。在這種情況下，必須克服的挑戰是穩定性。辛伐他汀作為一種不活躍的內酯前藥被使用:假設酸性條件可以穩定內酯、檸檬酸、己二酸和棕櫚酸，這些都是藥物配方中常用的輔料，甚至是在市場上已經含有辛伐他汀的固體配方中添加到配方中。然而，與預期相反的是，在魚油溶液中羧酸或羥基酸的存在並不能提高穩定性(表6)。觀察到的唯一降解產物是內酯環打開後產生的羧酸衍生物。化學上，內酯的降解可以用水的存在來解釋，所以從溶液中去除微量的水可能會穩定他汀類藥物。為此，我們通過加入適當幹燥的分子篩對魚油溶液進行脫水處理。穩定性測試給出了令人驚訝的結果(表7)。

然後分別用兩種共溶劑在不同溫度下進行了一個月的穩定性研究。結果證實，無論使用哪種共溶劑，從溶液中去除微量的水都足以穩定辛伐他汀(表7)。值得注意的是，僅用活性分子篩對魚油溶液進行脫水，不足以穩定辛伐他汀，而且隻有兩種共溶劑(Epikuron)的組合^®200 + docate鈉)確保極佳的穩定性長達6個月。使用不同的表麵活性劑，如Transcutol^®或Lauroglycol^®(專利文獻中描述的配方;WO2006/096806)，在類似條件下得到的解比這裏描述的解更不穩定(表7)。

他汀類藥物在魚油中溶解後的體內穩定性不是本研究的目的，因為預期其與魚油和他汀類藥物聯合使用時的穩定性相似。然而，辛伐他汀在模擬生物液(SGF，胃和SIF，腸道)中已經進行了初步研究。在S.I.(模擬生物液體試驗)中報道的結果表明，魚油溶解的他汀類藥物在兩種載體中都具有穩定性，與文獻中報道的類似。

總之，這裏所報告的方法與在水溶液中溶解藥物所用的方法相同:實際上，是像酒精、乙二醇、丙二醇等共溶劑^®等或表麵活性劑，降低液體和固體之間的表麵張力的化合物，是眾多可用的和文獻報道的方法之一，以提高水溶性差的藥物的溶解度。在我們的研究中，我們試圖提高他汀類藥物在魚油共溶劑中的溶解度，但結果很糟糕，乳化劑中也有一些，Epikuron^®200、docusate鈉、吐溫80、Solutol HS 15的溶解度可提高到20% p/p。其他乳化劑如Cremophor®RH40和Labrasol效果較差。

表4:溶解度測試:他汀類藥物(阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀和辛伐他汀)在魚油(n-3 PUFA)中的最大溶解量(mg/ml);0.9 g)。
(*)表3所示的相同配方，增加他汀類藥物的用量，直至達到溶液中的最大濃度。
(°):結果是至少兩個獨立實驗的平均值。±SD < 10%。

如前所述，提高他汀類藥物在魚油中的溶解度的物理化學機製可能是由於反膠束的形成。通過對本文所研究的各種乳化劑的分析，可以清楚地看到，表麵活性劑的化學特性，特別是極性頭，對他汀類藥物的溶解度非常重要，尤其是對新一代的他汀類藥物(阿托伐他汀、匹他伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀)。然而，這種行為也觀察到更多可溶性他汀類藥物，如辛伐他汀。綜上所述，乳化劑在提高他汀類藥物在魚油中的溶解度方麵起著重要作用，乳化劑的疏水組分參與與油分子的相互作用，親水組分(頭)參與與他汀類藥物分子的相互作用，形成反膠團。研究還觀察到，他汀類藥物的前藥(內酯形式，見辛伐他汀)溶液一旦幹燥，通過去除水的痕跡，在不需要混合添加劑的情況下特別穩定。

表5:他汀類藥物(阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀和辛伐他汀)在n-3 PUFA中溶解，在5℃和最高40℃(加速儲存條件)下儲存6個月的穩定性測試。

表6:辛伐他汀，魚油溶劑，單獨或與Epikuron的穩定性試驗^®或Epikuron^®在25℃和40℃兩種溫度下放置一個月後，
:結果是至少兩個獨立實驗的平均值。±SD < 10%。

表7:辛伐他汀與埃匹庫隆的長期穩定性試驗^®或者/和docusate鈉，在魚油中溶解在非脫水和脫水溶液中。Transcutol^®和Lauroglycol^®也被評估。
(º):結果是至少兩個獨立實驗的平均值。±SD < 10%。

綜上所述，實驗數據證實了他汀類藥物和魚油之間的聯係是可能的，通過穩定的配方、均勻的和口服給藥，使藥物開發濃度符合治療劑量(圖3)。此外，這些溶液可在短時間內獲得，成本低，使該過程特別適合工業應用。這些製劑可能為醫生和患者治療與高脂血症、高甘油三酯血症、高膽固醇血症相關的病理提供了一種新的工具，對於這些病理，他汀類藥物和n-3 PUFA已經在標準治療方案中單獨開出了處方。例如，在長期預防心血管疾病的患者中，與單獨服用兩種藥物相比，服用一顆藥可以提高患者對治療的依從性。這些結果已獲得專利[19,20]。

圖3:目錄(TOC

最後但並非最不重要的是，多士酸鈉配方，對便秘的對症治療有用的藥物，可能對他汀類藥物治療的患者有用，便秘是常見的不良反應。

鳴謝

作者要感謝Gilles Pain博士對手稿的幫助。

作者披露聲明

作者聲稱是sigma-tau IFR, S.p.A的雇員，這是一家國際製藥公司，讚助了這項研究。