摘要

這項工作旨在評估的可行性嗜酸乳杆菌海藻酸鈣球在不同應力條件下的固定化。將球滴入5% (w/v)海藻酸鈉細菌懸浮液的溶液中製備嗜酸乳杆菌，之前已激活。為了模擬酸脅迫，將遊離和固定化的細菌暴露在pH值2.5、3.5和7.0中，在37℃下孵育4小時。鹽脅迫濃度分別為0.85%、4%和6%時也同樣如此。對於冷凍應激，將遊離和固定化的細菌在-20°C保存3個月。在所有的壓力條件(pH值，鹽和凍結)模擬中，固定化細菌的數量變化較低，當發生最大的保護時嗜酸乳杆菌在6% NaCl濃度的高滲透壓下進行固定化並冷凍。由此可見，海藻酸鈣在不利條件下具有保護作用，對微生物有保護作用。因此，海藻酸鈣固定化技術在開發新型益生菌食品方麵具有良好的前景。

關鍵字

社區服務;態度;知覺;牙科實習生

簡介

城市化、工業化和全球化等幾個日常方麵可能會對現代生活質量產生不利影響，因此，消費者越來越多地尋求攝入能改善健康的功能食品。由於這種興趣，開發滿足這一需求的健康和有吸引力的產品已經引起了工業界和科學界的注意。這種對產品的新需求已經成為一個重大挑戰，因為它們必須滿足感官和技術方麵的要求，同時還要確保消費者的安全和福利。

功能食品是指那些除了提供基本營養外，還能帶來其他健康益處的食品。它們有可能通過傳統營養無法提供的機製促進健康，應強調的作用是，這種作用僅限於預防而不是治愈疾病。負責這些產品功能的主要成分是膳食纖維、魚油、植物固醇、礦物質、維生素、益生菌和益生元[4,5]。

國際上接受的定義是，益生菌是活的微生物，當施用適量時，對宿主[6]的健康有益。除了這些特點外，益生菌還必須能抵抗胃液的pH值，耐受胰腺和腸道分泌物，基因組中不攜帶耐藥基因，具有抗誘變和抗癌特性，長期保持活力，是安全的[7-11]。

有些乳酸菌除了在添加乳酸菌的產品中促進理想的技術效果外，還能對攝入乳酸菌的人產生功能性效果，因此被稱為益生菌。對益生菌微生物的一個要求是，它必須抵抗胃腸道的消化酶，通過粘附在腸上皮上，至少暫時在腸道內繁殖和定殖[12,13]。

一種廣泛使用的乳酸菌，嗜酸乳杆菌與其他種類的乳酸菌屬相比，它是最推薦的益生菌之一，因為它對腸道上皮的粘附能力很強，對宿主也有好處，如調節胃腸道[14]。這就是為什麼它是近年來使用和研究最多的益生菌之一。

食品中益生菌的生長和生存能力受幾個因素的影響。其中包括pH值，儲存期間酸度的增加，儲存溫度，防腐劑和其他微生物的存在，產品中所含的氧氣濃度，其通過包裝的滲透性和生長因子[16]的有效性。在食品保質期的不利條件下，確保這些生物體更大的生存和活力的另一種選擇是其固定化[17]。

細胞固定化可減少細胞死亡並增加其活力，這可能受到儲存、產品加工或實際食物攝入的影響，因為固定化細胞對與消化過程相關的生物液體的作用具有更大的抵抗力。此外，固定化提供了較低的微生物與食物成分的相互作用，降低感染易感性[18]。該技術是在固定劑酶或細胞的內部或表麵放置，海藻酸鈣凝膠和k -卡拉膠是最常用的基質[19,20]。

褐藻酸鹽屬於異構聚合物家族，具有廣泛的化學組成、分子大小和功能特性。化學上，它們是由1,4-linked β -D-mannuronic acid和α-L-guluronic acid單體以不同比例[21]組成的不分枝多糖。凝膠的性能可以概括為其孔隙率和工藝所必需的機械強度。多孔性與凝膠保護細胞和改變底物[22]有效擴散率的能力直接相關。

在這方麵，目前的工作旨在研究的可行性嗜酸乳杆菌不同應力條件下海藻酸鈣珠固定化。

材料與方法

固定的嗜酸乳杆菌

在製備海藻酸球時，用移液管將海藻酸鈉滴入5% (w / v)的溶液中(美食實驗室)，細菌懸浮液嗜酸乳杆菌，之前在重組脫脂牛奶(LDR 10%)中活化，加入6.67%的脫脂奶粉以增加粘度(在未固定化的細菌中也加入了等量的奶粉)。球體靜止30分鍾，從而發生海藻酸鈣的生成反應。

應力條件-pH

為評估pH脅迫條件，取1 ml菌懸液嗜酸乳杆菌按照Araújo[23]所描述的方法，加入9 ml含乳酸的生理鹽水(0.85% NaCl)， pH值分別為2.5、3.5和7.0。混合物在37°C下孵育4小時，以評估施加的應力。在此期間，每小時通過6000 g離心(Sorvall離心機)獲得4個顳葉細胞樣本，持續6分鍾，用於存活分析，以計算活細胞數量。為此，我們將細胞顆粒重懸於9 mL生理鹽水(0.85% NaCl)中，然後在MRS瓊脂(Merck)上進行一係列稀釋，在37°C厭氧條件下培養48小時後計數存活細胞。選擇含有25-250菌落的板，計數菌落形成單位(CFU.mL-1)，結果表示為log10。采用同樣的方法對酸的應力條件進行了評價嗜酸乳杆菌海藻酸鈣固定化細胞。

定量球體的數量，對應於1毫升的細菌懸浮液嗜酸乳杆菌，我們將1毫升細胞懸液滴入5% (w / v)海藻酸鈉溶液中，球處於靜止狀態，然後在分析天平上稱重。這個過程我們重複了25次。得到的平均重量為1.5 g，對應於1 mL。

壓力Condition-NaCl

在鹽脅迫條件下，取1毫升菌懸液嗜酸乳杆菌加入不同NaCl濃度(0.85、4、6%)的生理鹽水9 ml中。混合物在37°C下孵育4小時，以評估施加的應力。每隔一小時收集細胞進行活細胞計數，對此進行與酸脅迫條件相同的程序。同樣的程序被用於嗜酸乳杆菌在海藻酸鈣中固定。

壓力condition-freezing

在溫度脅迫條件下，取1 mL菌懸液嗜酸乳杆菌加入9 mL生理鹽水(0.85% NaCl)中。混合物在-20°C(冷凍)下保存3個月。在此期間，在冷凍前、冷凍後和90天儲存期間的30天內測定細菌計數，如前所述[24]。每次分析時，收集細胞計數活細胞，進行與酸脅迫條件相同的程序。同樣的程序被用於嗜酸乳杆菌在海藻酸鈣中固定。

統計數據

試驗分為3個重複，3次重複。結果采用描述性統計進行分析。

結果與討論

壓力condition-pH

的活細胞計數嗜酸乳杆菌在壓力條件下，不同時間(1 ~ 4小時)分析的pH值見表1和表2。

遊離菌的最小和最大細胞計數範圍為8.04到8.71 Log CFU。mL-1的不同pH值。而固定化菌的變異量為8.12 ~ 8.46 Log CFU.mL-1。

值得注意的是，當pH值為2.5時，遊離菌比固定化菌的腐爛速度更快，因為遊離菌的計數範圍為8.58至8.33 Log-CFU。mL-1，差異為0.25，固定化範圍為8.32 ~ 8.27 Log CFU。mL-1，差異為0.05。在pH值3.5時，最初3小時內固定化細菌數量顯著減少，然而，在第三次分析後，遊離細菌數量進一步減少。遊離菌的初始計數與最終計數之差為0.30，而固定化菌的初始計數與最終計數之差為0.04。在pH 7.0時，兩種遊離的固定化細菌表現出相似的行為。然而，遊離菌數減少0.36，固定化菌數減少0.21。

	時間(小時)
pH值	1	2	3.	4
7日0	8,40±0,36	8,43±0,25	8,67±0,19	8,04±0,26
3、5	8,64±0,06	8,57±0,17	8,71±0,30	8,34±0,21
2、5	8,58±0,24	8,42±0,23	8,40±0,15	8,33±0,17

表1:遊離活細胞數嗜酸乳杆菌(日誌CFU。mL-1) pH脅迫。

	時間(小時)
pH值	1	2	3.	4
7日0	8,33±0,29	8,39±0,23	8,16±0,22	8,12±1,87
3、5	8,46±0,22	8,24±0,21	8,23±0,11	8,42±0,23
2、5	8,32±0,18	8,24±0,23	8,17±0,20	8,27±0,25

表2:遊離活細胞數嗜酸乳杆菌(日誌CFU。mL-1) pH脅迫。

嗜酸乳杆菌耐受乳酸濃度為0.3% ~ 1.9%的酸性環境，最適pH值為5.5 ~ 6.0。它對胃酸和膽鹽具有抗性，因為在胃腸道中的存活率估計在2%至5%之間，以達到結腸[25]的足夠濃度。這種抗性可以解釋本研究中發現的對酸脅迫的顯著計數。Oliveira[26]也發現了大量的嗜酸乳杆菌微膠囊化，約108 CFU。mL-1，即使在pH值為1和3的孵育3小時後。

Yoon et al.[27]研究番茄汁中乳酸菌的行為，發現嗜酸乳杆菌在這種飲料中，植物乳杆菌、幹酪乳杆菌和德爾布魯奇乳杆菌迅速生長，降低了糖的含量，增加了乳酸的濃度。雖然發酵72小時後果汁的pH值降至pH 3.5;在4℃保存4周後，乳酸培養物的活力保持在106 CFU g-1以上。在這項研究中，在類似的條件下也發現了類似的結果，一旦pH值3.5的所有計數都超過106 CFU。mL-1在不同時間進行分析。這一證據可能與更大的適應性有關嗜酸乳杆菌乳酸，由於這是一種天然代謝產物的能量產生機製。

固定行為的趨勢線嗜酸乳杆菌如圖1所示。

通過趨勢線，我們可以觀察到，當這些受到不同pH值時，固定化提供了更大的保護，因為在所有條件下，固定化細菌的計數減少都更低，而且在測試期間計數有更多的線性趨勢。

在Krasaekoopt等人的研究中，海藻酸鹽和殼聚糖的包裹也能有效地提高其生存力嗜酸乳杆菌酸奶中的幹酪乳杆菌在pH值為4.7的條件下應用，並置於4°C的冷藏條件下，相對於遊離益生菌有一個周期對數的差異。

Mandal et al.[29]評估了不同濃度海藻酸鈉乳化技術包封的幹酪乳杆菌NCDC 298的耐受性，並暴露於低pH值、高濃度膽鹽和加熱。在這項研究中，作者發現，與遊離形式相比，固定化的益生菌提高了對測試條件的抵抗力。此外，還觀察到，活力的增加與使用的海藻酸鈉濃度成正比。

壓力condition-NaCl

對不同鹽濃度(0.85%、4%和6%)脅迫下的活細胞進行計數嗜酸乳杆菌不同分析時間(1 ~ 4小時)的遊離和固定情況見表3和表4。固定行為嗜酸乳杆菌和遊離態在不同鹽濃度下，通過趨勢線如圖2所示。

在6%鹽濃度下，遊離菌數為8.60 ~ 7.40 Log CFU。mL-1，發生了一個以上的日誌周期的減少。在固定化細菌上，差異為0.19，範圍為8.35 ~ 8.16 Log CFU.mL-1。這說明海藻酸鈣對細菌有更強的保護作用嗜酸乳杆菌當它受到高於滲透壓的壓力時。此外，6%鹽濃度的趨勢線顯示，遊離菌在時間3 ~ 4之間進一步減少，而固定化菌在分析計數過程中幾乎有一條直線常數。

圖1:在pH值為2.5、3.5和7.0的脅迫條件下，遊離和固定化的計數隨時間(小時)的變化趨勢線嗜酸乳杆菌．

根據戈梅斯和馬爾卡塔的說法嗜酸乳杆菌具有耐介質鹽度的特殊性。正如預期的那樣，在本文中，我們注意到，當遊離菌受到較高濃度的NaCl(6%)時，發生1.2 log循環的減少，表明在這個濃度的鹽下，微生物對滲透效應的抵抗力降低。

在4%的濃度下，遊離菌數由9.18 log CFU降至8.61 log CFU。mL-1(差0.57)。固定化菌數差異為0.54，末初計數為8.66和8.12 Log CFU。mL-1分別。然而，趨勢線顯示，遊離菌的這種濃度的減少時間發生在2 - 3小時之間，而固定化菌的減少時間發生在1 - 3小時之間，與遊離菌相比，保持了更多的線性趨勢。

計數嗜酸乳杆菌濃度為0.85%時遊離量為8.54 ~ 8.75 Log CFU。mL-1，增加0.21。固定化菌數為8.03 ~ 8.51 Log-1 CFU。mL-1增加0.48。這種行為是預期的，因為細菌處於有利的滲透壓，以維持其代謝活動[31]。

壓力condition-freezing

固定和自由的行為嗜酸乳杆菌圖3通過趨勢線顯示了凍結3個月期間的形成情況。

遊離菌數為9.04 ~ 7.50 log UFC。mL-1(差1.54)。對於固定化細菌，差異為0.60，從8.53 Log UFC減少到7.93 Log UFC。mL-1分別。觀察到的細胞計數嗜酸乳杆菌當暴露於冷凍溫度時，海藻酸鈣固定形式的微生物比自由形式的要高，這表明海藻酸鈣固定的微生物有更好的保護作用。

在Lorenz[1]的研究中也發生了同樣的情況，微囊化細胞的存活率高於遊離細胞。計數顯示，在-18±2°C保存12周後，遊離細胞的活力下降了4.3 log周期。同期，乳化法和噴霧幹燥法製備的微囊化細胞存活率分別降低1.77 log和1.75 log cycle。

圖2:遊離和固定化鹽(0.85、4.0和6.0%)脅迫條件下計數隨時間(小時)的變化趨勢線嗜酸乳杆菌

圖3:自由凍結和固定狀態下的應力趨勢線嗜酸乳杆菌在不同的時間。

	時間(小時)
%的鹽	1	2	3.	4
0, 85%	8,03±0,11	8,80±0,05	8,33±0,28	8,51±0,30
4, 0%	8,66±0,09	8,41±0,20	8 14±0 14	8,12±0,07
6、0%	8,35±0,42	8,64±0,12	8,29±0,31	8,16±0,24

表3:鹽脅迫下遊離嗜酸乳杆菌活細胞計數(Log CFU.mL-1

	時間(小時)
%的鹽	1	2	3.	4
0, 85%	8,54±0,27	8,41±0,58	8,76±0,14	8,75±0,21
4, 0%	9,18±0,41	9,25±0,05	8,58±0,35	8,61±0,28
6、0%	8,60±0,08	8,75±0,56	8,63±0,20	7,40±0,50

表4:鹽脅迫下固定化嗜酸乳杆菌活細胞計數(Log CFU.mL-1)

Desmond et al.和Tsen et al.[32,33]等研究表明，較低的溫度可以保證微囊化細胞較高的存活率，但細胞的死亡率隨著儲存時間的增加而增加。

然而，在這項研究中，我們注意到最高的死亡率發生在冰凍後不久，隨著時間的推移，在三個月內，計數趨於保持不變。這可以解釋為幾乎隻在這一階段緩慢形成冰晶，這些冰晶會導致蛋白質和酶變性，也可能導致細胞膜損傷，導致微生物[30]死亡。

結論

在所有的模擬應力條件(pH值，鹽和凍結)的致命嗜酸乳杆菌固定化比遊離低，說明海藻酸鈣在細胞活力不利的條件下起了保護劑的作用。在高滲透壓條件下(6% NaCl)和冷凍條件下，固定化的益生菌具有較好的保護作用。這表明可以替代開發具有類似壓力條件的益生菌食品。

海藻酸鈣固定化技術嗜酸乳杆菌已被證明是開發具有不良條件的新型益生菌產品的重要替代方案。

致謝

作者感謝Gustavo Maruyama Mori。

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文章類型:研究文章

引用:Cruz RG, Pereira SGF, Araújo EA和Dores MT(2015)可行性嗜酸乳杆菌海藻酸鈣球固定化及不同應力條件下的研究。納爾食品科技1.1卷:http://dx.doi.org/10.16966/2470-6086.101

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出版的曆史:

收到日期:2015年2月23日

接受日期:2015年2月28日

發表日期:2015年3月4日