神經學與神經生物學

全文

與機械腦損傷相比，爆炸暴露大鼠中腦的急性和亞急性差異基因表達

斯坦尼斯拉夫我Svetlov1、2、3 * 維克多的3. Zhiqun張2 肯尼斯·C科裏4 Firas Kobeissy2 艾哈邁德Moghieb2 凱文千瓦王1

1 1Banyan Laboratories, Banyan Biomarkers, Inc, Alachua, USA
2 佛羅裏達大學精神病學學係，蓋恩斯維爾，佛羅裏達州，美國
3. 佛羅裏達大學醫學院，蓋恩斯維爾，佛羅裏達州，美國
4 美國陸軍醫學研究和裝備司令部(USA MRMC)，美國馬裏蘭州德特裏克堡

*通訊作者:Stanislav I Svetlov，醫學博士，研究副教授，100 Newell Drive Gainesville, FL 32611, Tel: 352-359-1612;電子郵件:ssvetlov@ufl.edu


條信息

文章類型:研究文章

引用:張誌強，張誌強，張誌強，張誌強，張誌強，等(2015)與機械腦損傷相比，爆炸暴露對大鼠中腦急性和亞急性差異基因表達的影響。神經生物學雜誌，vol .1: http://dx.doi.org/10.16966/2379-7150.103

版權:©2015 Svetlov SI，等人。這是一篇根據創作共用署名許可協議發布的開放獲取文章，該協議允許在任何媒體上無限製地使用、發布和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2月25日,2015年。

  • 接受日期:03年3月,2015年。

  • 發表日期:07年3月,2015年。

    • 摘要

    本研究采用兩種大鼠創傷性腦損傷模型:頭部定向爆炸超壓暴露(OBI)和機械控製皮質撞擊(CCI)。兩組動物作為對照:naïve大鼠和暴露在爆炸噪音下的大鼠。采用基因組學神經係統生物學方法分析實驗組之間的差異基因表達。在創傷性損傷後24小時(急性)和7天(亞急性)分離中腦RNA，使用包含31100個基因序列的Affymetrix陣列進行探測，並由安捷倫科技進行量化。將差異表達的基因分為功能簇，使用Welch校正的參數和非參數t檢驗進一步評估24小時和7天的基因表達變化的顯著性。然後，利用神經係統生物學工具創建並分析了爆炸暴露和機械衝擊後病理通路中的基因相互作用。

    經方差分析(p<0.05)， blast暴露組994個基因與對照組表達差異顯著(p<0.05)， CCI組1532個基因與對照組表達差異顯著(p<0.05)，總重疊基因為579個。參數和非參數t檢驗顯示，與CCI相比，blast暴露動物在24小時和7天內不同基因變化的時間分布有顯著差異。具體而言，參與神經發育和修複的基因，如ROBO1和NEDD4，在CCI中上調，而在衝擊波暴露後下調。

    這些結果表明，兩種腦損傷之間的基因表達有一些差異，也有一些重疊。這將有助於揭示每個腦損傷的特定分子特征，並有助於發展慢性創傷後腦病的診斷。

    關鍵字

    爆炸腦損傷;控製大腦皮層的影響;基因表達;Neurorepair;基因組學;神經係統生物學

    簡介

    盡管對創傷性腦損傷(TBI)，特別是戰鬥相關的TBI的認識取得了顯著的進展，但其不同的病理途徑和長期結局仍有待揭示和描述。具體來說，需要解決的問題是，爆炸誘導的TBI與包括腦震蕩在內的機械衝擊型腦損傷的機製在多大程度上相似，以及它們之間的區別可能是什麼。尤其重要的是闡明不同層次的分子動力學變化——分子調控;這將包括基因表達研究(mRNA)及其調控(miRNA)，蛋白質組學及其代謝組學相關領域。

    我們的實驗室和其他實驗室進行了多項研究，以建立創傷性腦損傷的病理基礎的全麵圖像，包括基因組和蛋白質組學特征[2-4]。然而，已有報告將爆炸暴露後發生的基因組變化與機械損傷進行了並列分析，如控製性皮質撞擊(CCI)或閉合性頭部損傷。此外，利用神經係統生物學工具來揭示和可視化這類腦損傷中涉及的基因相互作用、分子功能和生物過程，以及破譯非穿透性爆炸損傷和機械CCI損傷通路的重疊或差異，似乎是至關重要的。

    本研究的主要目的是應用先進的基因組學技術和神經係統生物學工具，比較中度爆炸暴露與機械控製皮質撞擊(CCI)造成的腦損傷在不同時間後的基因表達模式的改變。為此，對鑒定出的差異基因進行包括分子功能和生物學過程在內的基因本體分析;此外，一種基因相互作用的全局方法是觀察基因是如何相互關聯的，以及一種有針對性的方法來確定由於這種相互作用而涉及的下遊目標。這使得我們能夠揭示blast和CCI腦損傷之間的時間依賴相似性和損傷特異性差異，並揭示神經炎症、神經介質和神經修複成分的關鍵成分。

    材料和方法

    動物暴露在可控衝擊波下:模擬爆炸超壓暴露是通過改變目標與爆炸發生器的位置來實現的，之前詳細描述了[5]。采用PCB壓電式爆破壓力傳感器和LabView 8.2軟件采集爆破壓力數據。成年雄性大鼠(Sprague-Dawley, Harlan, Indianapolis, IN, USA)在1:1 O2/N2O的載氣中，用4%異氟烷麻醉(4分鍾)[5]。在達到深度麻醉後，他們被放置在一個支架中，暴露在電擊管出口噴嘴以下5厘米的距離。大鼠被直接安置在電擊管上。軸將它們暴露在“複合”爆炸中，包括峰值超壓為52 psi的壓縮空氣射流，持續時間為10毫秒。對照組的動物被麻醉，放在電擊管旁邊的籠子裏，產生衝擊波，使動物隻暴露在噪音中。

    控製皮質衝擊(CCI)

    采用控製性皮質撞擊(CCI)程序在大鼠模型上模擬機械性腦損傷，基本與之前描述的[6]相同。簡單地，用4%異氟醚麻醉大鼠，並維持在2.5%異氟醚中。持續監測核心體溫，維持在37±1°C。動物被安裝在一個立體定向框架中，以俯臥的姿勢，並由耳朵和門牙閂固定。在顱正中切口和軟組織反射後，在bregma和lambda之間的中間位置，在靠近中央縫合處進行單側(撞擊部位同側)開顱手術。皮質上的硬腦膜保持完整。采用直徑為4mm的電磁驅動器，以3.5 m/s的速度撞擊右側(同側)皮層，壓縮2.5 mm，停留時間為200 ms。

    對blast和CCI進行適當的傷前和傷後管理，以最大限度地減少疼痛和不適，並確保遵守佛羅裏達大學、機構動物護理和使用委員會以及《實驗室動物護理和使用指南》中詳細介紹的國家衛生研究院的指導方針。此外，研究遵循動物福利法和其他與動物和涉及動物的實驗有關的聯邦法規和法規，並遵循“實驗室動物護理和使用指南，NRC出版物，1996年版”中的原則。

    大腦組織收集:在腦外傷後24小時或7天處死動物;根據方案(圖1)，用brain Slicer裝置從中腦區(4- 5mm厚)切開腦組織。切片中央部分(Bregma後約- 5mm至- 9mm)清除周圍皮層、垂體等組織。它被切成兩半並快速冷凍用於蛋白質組學(L)，或保存在RNALater (Ambion, Austin, TX)用於RNA研究。

    確保RNA分離、質量鑒定和驗證(Agilent Bioanalyzer, Santa Clara, CA)，並使用asagen公司(Austin, TX)的affmetrix genchip陣列，按照QC/QA指導程序進行基因組分析。用Affymetrix GCOS v1.3進行雜交和陣列掃描，收集原始熒光數據。數據進一步歸一化，使用Affymetrix MAS 5.0算法進行計算。總結值使用單向方差分析進行分析，配對naïve、噪聲控製組和TBI組之間的差異進一步通過參數和非參數t檢驗(Welch校正，GraphPad, Inc.)確定。路徑圖使用係統生物學軟件PathwayStudio (Ariadne Genomics, Rockville, MD)創建。其他分析軟件:Partek Genomic solution 6.2 (Partek Inc.， St. Charles, MO);Matlab 7 (Mathworks Inc.， MA)。

    神經係統生物學分析

    利用生物信息學係統生物學方法進一步分析了CCI和blast損傷組與各自對照的基因組芯片差異表達，以評估不同特異性腦損傷改變基因相關的改變通路，以及它們對CCI和/或blast損傷的發展的貢獻。PathwayStudio軟件(v 10;Ariadne Genomics, Rockville, MD, USA)用於神經係統生物學分析。該軟件有助於從差異基因表達解釋生物學意義，建立和分析途徑，並確定改變的細胞過程和分子功能涉及。

    結果與討論

    經方差分析(p<0.05)， blast暴露組有994個基因與對照組表達差異顯著(p<0.05)， CCI組有1532個基因與對照組表達差異顯著(p<0.05)，有579個基因總體重疊。參數和非參數t檢驗顯示，與CCI相比，blast暴露動物在24小時和7天內不同基因變化的時間分布有顯著差異。此外，與未受噪聲影響的大鼠相比，受到噪聲影響的大鼠的幾個基因表達發生了改變。

    已有多項研究評價機械創傷後齧齒類動物大腦的基因表達變化，包括CCI和液體衝擊損傷(FPI)，主要是皮質和海馬組織[3,7-10]。齧齒類動物爆炸後基因模式表達的信息較少。在最近一項對大鼠的研究中，使用有限的基因陣列評估了大鼠在[11]爆炸後24小時海馬和前額葉皮層的變化，該基因陣列強調炎症成分。Risling和同事研究了在有或沒有頭部加速和腦穿透性損傷的大鼠中，blast誘導的TBI的機製，包括24小時後海馬的基因組改變，也強調了神經炎症、細胞死亡和突觸傳遞[12]。然而，他們注意到參與神經發生和突觸傳遞的基因有一個重要的下調。在小鼠中，比較創傷後和機械損傷後行為學改變及海馬區部分基因的表達，並通過Q-PCR[13]進行驗證。

    在我們的研究中，我們采用blast TBI模型，並使用由asagen公司提供的全尺寸affmetrics genchip(31100序列)陣列，在攻擊後24小時和7天，大鼠中腦與CCI的基因組變化進行比較。此外，我們對顯著改變的基因進行方差分析，p<0.05，並將其分為主要功能群/組，(a)全身/血管反應;神經炎症;蛋白水解作用;(b) neuromediators;信號;離子通道;(c)神經發育/修複;在blast和CCI組中，使用t檢驗評估24小時和7天與各自對照的顯著性，在某些情況下，CCI對照與blast noise對照。最後，利用係統生物學工具繪製了blast和CCI之後的基因相互作用。 Pathways reflecting gene-associated molecular functions altered after blast injury were created and compared to CCI.

    全身/血管反應，神經炎症，蛋白水解

    在blast組和CCI組中都發現了一些蛋白水解和炎症基因的顯著變化，包括急性期激肽原1、組織蛋白酶和趨化因子(表1A和2A)。然而，在這些反應中，blast組和CCI組之間有重要的差異。首先，幾種趨化因子在CCI作用24 h和7 d後顯著上調，而隻有C-X-C配體1mrna表達在24 h後輕度上調，在7 d後下調。其次，TNF超家族成員11的表達在blast暴露後一直高度升高，而CCI後沒有變化。相比之下，MMP-9基因在撞擊後CCI後表達上調，但在撞擊後24小時開始輕微上調後，在第7天輕微下調(表1A和2A)。

    blast和CCI都有一些共同的調節因子和通路，如kininogen 1 (KNG1)連接炎症和止血，細胞因子和下遊的NF-kB(圖1和2)。這種差異反映在CCI參與雌激素受體2，血氧酶和一些趨化因子網絡(圖2)，而CD69，c反應蛋白和急性期細胞因子以及血管收縮因子內皮素基因是blast暴露的主要上調通路(圖1)。如前所述，腫瘤壞死因子(TNFSF11)和金屬蛋白酶(MMP-9)編碼基因的變化方向和時間進程不同。

    最近的一些研究表明，編碼細胞因子和趨化因子的基因(IL- 1, IL-6, C-X-C-L10)的早期上調，包括CCI和blast後海馬和皮層的基因表達譜[7,11 14,15]。除促炎分子外，抗炎IL-10和組織抑製金屬蛋白酶-1 (TIMP-1)的上調也有多篇報道[11,12]。在本文中，我們展示了blast和CCI反應的重要差異，這可能對不同病因的TBI具有診斷/預後意義，以及更重要的治療策略。

    表1:衝擊波暴露後中腦中選擇差異表達的mRNA。使用affmetrix芯片將RNA樣本與熒光標記探針雜交，並使用安捷倫科技(Agilient Technology)配備軟件的掃描儀進行分析(詳見材料和方法)。mrna按功能集群分組，最重要基因表達的時間進程差異被提出。動物組至少3隻大鼠的背景校正和內部對照歸一化熒光值以Mean+ SEM表示，每隻大鼠樣本重複處理。

    表2:CCI後中腦選擇性mRNA表達的時間進程

    使用affmetrix芯片將RNA樣本與熒光標記探針雜交，並使用安捷倫科技(Agilient Technology)配備軟件的掃描儀進行分析(詳見材料和方法)。mrna按功能集群分組，最重要基因表達的時間進程差異被提出。動物組至少3隻大鼠的背景校正和內部對照歸一化的熒光值為Mean+ SEM，每隻大鼠樣本重複處理。

    Neuromediators;信號;離子通道:該基因簇中非常重要的基因表達特征是S100鈣結合蛋白A11 (calizzarin)、S100鈣結合蛋白A8 (calgranulin A)和S100鈣結合蛋白A4在CCI後顯著上調，而blast後沒有上調(表2B)。與噪聲對照組相比，爆炸暴露組大鼠GABA A受體pi基因顯著上調(表1B)。CCI組與對照組相比，該基因表達略有增加，但不顯著(p=0.23)(表2B)。同樣，與對照組相比，爆炸暴露組穀氨酸離子性n -甲基天冬氨酸受體顯著上調，但CCI處理組沒有上調(表1B和2B)。與CCI後的S100A家族相比，該集群的差異基因相互作用，包括NCAM和VEGF-A，分別如圖1和圖2所示。

    圖1:腦爆傷後基因相互作用的係統生物學圖譜

    在blast組和CCI組中不重疊的通路關鍵組分在框架中顯示。CASP9-caspase 9;CRP- C反應蛋白;IL1R2-白細胞介素1受體2型;esr2 -雌激素受體2型;HMOX1-血紅素加氧酶1;趨化因子(C-X-C)配體1;趨化因子受體CXCR2。KNG1 -激肽原1;TNFSF11-腫瘤壞死因子超家族成員11。 Please see text for a detailed description. The upregulated genes are shown in red and downregulated genes are in blue. Yellow highlights indicate biphasic gene regulation (see table),

    S100蛋白家族在TBI中的作用已被證實，S100B膠質蛋白作為Ca2+/calmodulin信號轉導的組成部分在TBI中已被廣泛研究，包括其臨床診斷價值[16-18]。然而，S100在大多數機械創傷模型(CCI、閉合性頭部損傷、FPI)和TBI患者中均有顯著性評價，而對其他成分未給予關注。我們的數據強調了幾個S100家族基因的參與，包括calgranulin A和calizzarin的皮質機械撞擊發病機製，並顯示了S100在爆炸暴露後的輕微(如果有的話)損傷。重要的是，我們的數據表明，與噪聲控製相比，穀氨酸離子性受體基因2A(24小時和7天)和3B(24小時)上調，這在爆炸暴露中此前沒有報道過(表1B)。

    生長因子/神經發育/維修。暴露組之間涉及神經發育和修複的基因存在顯著差異。與對照組相比，blast暴露後激活素受體樣激酶7(神經元表達)基因顯著上調，但在cci受試組未見上調。與naïve對照相比，achaet -scute複合物同源基因1和SRY-box包含基因11在爆炸暴露後增加，但沒有改變甚至下調(表1C和2C)。

    重要的是，與naïve大鼠相比，blast後神經前體細胞表達發育性下調基因4A (Nedd4a)的表達明顯降低，CCI後無變化，甚至略有升高(但不顯著)。與對照組相比，blast組和CCI組二氫嘧啶酶樣3 (CRMP-4)均下調。

    最有趣的模式是觀察到的表達迂回軸突引導受體1 (Robo1)基因。CCI後上調非常明顯，而blast暴露後有明顯的下調趨勢(表1C和2C)。

    圖1和圖2顯示了該集群在blast與CCI中基因相互作用的路徑，包括blast暴露觸發GM-CSF和下遊轉錄激活因子的激活，包括SOX11導致修複過程的誘導，例如微管蛋白、WNT(負性)和RPS6K核糖體蛋白激酶基因以及TGFbeta相關通路，包括ALK7 (ACVR1C)/ SMAD轉錄調控因子的上調。

    相關的基因的分子功能

    blast與CCI分子相互作用的途徑如圖3所示。結果顯示，CCI隊列中S100A家族基因上調，參與泛素、蛋白酶激活受體、Rho、GPCR、JAK信號通路的下遊調控。在blast誘導組中，功能調節通路顯示了穀氨酸受體、CAMK和鈣調素信號傳導以及GABA/GABA A受體激活等潛在的NCAM1依賴過程(表1B和圖3)。在blast組和CCI組中，使用該聚類成分生成的病理/疾病圖譜非常相似，並與聚類1(係統性/血管/神經炎症/蛋白溶解)重疊。盡管涉及到一些不同的組件——CCI的S100A和blast的NCAM(表2B和圖3和4)。

    圖2:機械控製皮質撞擊後的基因相互作用通路。符號/交互和非重疊分量類似於圖2。ncam1 -神經細胞粘附分子1;gr3bkcnq1 -電壓門控鉀通道;穀氨酸受體離子性n -甲基- d -天冬氨酸3B;gr2a -穀氨酸受體離子性n -甲基- d -天冬氨酸2A;P2RX2—嘌呤能受體P2X，配體門控離子通道2;GABA-gamma aminobutiric酸;S100Acalcium結合蛋白;PLAUR-纖溶酶原激活劑，尿激酶受體。 Please see text for details.

    圖3:與爆炸損傷相關的基因相關分子功能:分子組成和相關病理的係統生物學圖譜。符號和交互與圖2中相同。FGFR2-成纖維細胞生長因子受體2;CSF2—粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子;IGF1R-胰島素生長因子1受體;ACVR1C-激活素受體樣激酶7;ROBO1—迂回軸突導向受體1;nedd4 -神經前體細胞表達發育性下調基因4;DPYSL3-dihydropyrimidinaselike 3 (CRMP-4)。請參閱文本的詳細描述和討論。
    圖4:CCI損傷相關的基因通路和分子功能:符號和相互作用如圖2所示。fgfr2成纖維細胞生長因子受體2;CSF2—粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子;IGF1R-胰島素生長因子1受體;ACVR1Cactivin受體樣激酶7;ROBO1—迂回軸突導向受體1;nedd4 -神經前體細胞表達發育性下調基因4;DPYSL3-dihydropyrimidinase-like 3 (CRMP-4)。請參閱文本的詳細描述和討論。

    參與神經修複的基因和分子過程尚不清楚，因此闡明損傷後結果的機製、分子組成和生物標誌物具有重要的臨床意義。blast暴露後，下遊MAP激酶家族的FGF通路負向參與基因調控(表1C，圖1)。CCI後，中腦基因調控的中心點似乎是IGF1和EGF家族分子，包括連接類似blast效應基因的IGF1受體和EGF配體基因，如tubulin、S6激酶、組蛋白和WNT，如表2C和圖2、圖4。

    目前尚不清楚ROBO1和NEDD4在CNS中的功能作用，但從圖中可以看出，ROBO1和NEDD4基因下調可促進PI3激酶和RAS，刺激修複(圖3和圖4)，而CCI後ROBO1和NEDD4基因上調可對神經修複產生負麵影響。

    研究表明ROBO1調節發育中的大腦皮層[19]的神經發生。ROBO1通過neuropilin-2[20]參與多巴胺能神經元的軸突引導，我們之前已經證明了其上調[21]。然而，與CCI相比，爆炸後ROBO1的相反調控可能反映出ROBO1在前腦和新皮層的表達和功能的空間特異性[22-24]，衝擊波在中腦對其的影響不同於CCI直接對皮層的影響。然而，ROBO1及其相關的Slit係統在TBI後腦修複中的作用尚未被研究。此外，激活素受體家族(包括ALK激酶)在TBI後的作用尚未被研究，盡管ALK1信號通路產生了較低的TBI誘導的GFAP mRNA水平的升高，表明對[25]損傷的星形膠質和神經元反應減弱。

    與噪聲控製相比，爆炸後ACVR1C顯著上調，而CCI值與naïve大鼠相比並沒有同等上調。與ROBO1類似，NEDD4a在blast後中腦表達下調，CCI後7d上調。NEDD4 (WW)在腦皮質損傷後存活的神經元中表達，這些基因在中腦的差異表達可能反映了空間差異。綜上所述，我們的數據首次揭示了ALK7、ROBO1和NEDD4參與了後爆炸和後CCI，可能是大腦修複。在最近的一篇論文中，Heinzelmann和同事們報道了幾種生長因子和受體基因的下調，如EGFR受體和緊張素-1在從細胞後綜合征[27]患者采集的外周血中。這些重要成分在腦外傷後神經損傷和恢複中的具體機製仍有待進一步研究。

    結論

    據我們所知，這是第一個同時評估兩種定義明確且特征明確的腦損傷中基因表達改變的基因組學研究——通過衝擊波超壓建模的TBI和CCI開放性頭部損傷。為此，我們利用基於係統生物學的大鼠中腦轉錄組學分析進行了一項綜合研究，以比較爆炸暴露和機械皮層衝擊腦損傷。我們的數據顯示，這些組之間的基因表達變化存在重疊和顯著的時間依賴性差異，尤其是神經發育和修複基因。與CCI相比，新成分如ROBO1和NEDD4在爆炸誘導的TBI後以相反的方式表達，這表明不同的機製可能涉及神經修複動力學。這些結果表明，需要進一步深入研究，以闡明爆炸與機械撞擊造成的腦損傷機製的差異。這將有助於揭示潛在的生物標誌物和發展慢性創傷後腦病的診斷。

    確認

    兩位作者要感謝奧萊娜·格盧沙科娃提供了出色的技術援助。這項工作由國防部W81XWH-8-1-0376和W81XWH-07-01-0701撥款支持。這項研究是在沒有任何商業或金融關係的情況下進行的，這些關係可能被解釋為潛在的利益衝突。kw.w和S.I.S是Banyan生物標記公司的股東，該公司對將創傷性腦損傷診斷測試商業化感興趣。

    要求免責聲明:

    本文僅代表作者個人觀點，不代表國防部或美國政府的官方政策或立場。

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